Name: Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Öğrenin, fare subcallosal bölgesinden yetişkin nöral kök hücre izolasyonu ve kültürü için basit ama hassas bir yöntem. Bu teknik, nörolojik hastalıkların tedavisinde yenilikçi araştırmaları destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Kore Bilim, BİT ve Gelecek Planlama Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla Beyin Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir (Hibeler NRF-2015M3C7A1028790); ve Sağlık ve Refah Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi'nden alınan bir hibe ile, Kore Cumhuriyeti (HI14C3347).

Malzemeler ve kültür besiyeri hazırlanması 1. <ol><li> SCz diseksiyonu ve ayrışma için, alüminyum folyo ile beyin matrisi, iki ucu keskin jilet ve forseps sarın ve daha sonra otoklav ile sterilize. </li><li> Bütün fare beyin yıkamak için soğuk PBS tamponu 50 ml hazırlayın. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu kurmak ve beyin (otoklav makas ve forseps) diseksiyonu için gerekli cerrahi aletler ve SCZ (1 ml şırınga, 30 G iğne, beyin matris ve ince forseps) izolasyonuna hazırlar. </li><li> N2 ortamında hazırlanması: <ol><li> F-12 / DMEM (+ L-glutamin + sodyum bikarbonat)% 2 B27,% 1, N2 takviyeleri ve% 1 Penisilin-Streptomisin ile orta hazırlayın. Not: büyüme ortamı N2 ortamı ve büyüme faktörleri oluşur (20 ng / ml saflaştırılmış epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 20 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF2)). </li></ol></li><li> Bir sindirim tampon hazırlayın (40 ünite / ml papain, 2.4 ünite / ml dispase II ve% 2 penisilin-streptomisin, PBS içinde), Doku sindirimi için. </li><li> Kaplama Plakası ve lamel hazırlanması: <ol><li> (0.01,% PLO) ve laminin (DH 2 O içinde çözülmüş 10 mg / ml), poli-L-ornitin hazırlayın. bir tek tabaka ya da immün 18 mm lamelleri olarak SCZ-aNSCs bakımı için kaplama 6 oyuklu plakalar, 4 ° C&#39;de gece boyunca PLO ile inkübe edin. Sonra O. tabak ve lamelleri son yıkandıktan sonra kurumaya bırakın DH 2 ile onları 3 kez yıkayın. </li><li> Daha sonra, gece boyunca 4 ° C &#39;de laminin inkübe edin. Sonra, DH 2 O. ile onları 3 kere yıkayın Dikkat: hücre eki etkileyecek olan, laminin kurutmayın. Not: kaplama çözeltileri 3 kez tekrar edilebilir. </li></ol></li></ol> 2. İzolasyon ve Yetişkin SCz ve Ayrılma <ol><li> kültür hazırlama öncesinde, buz üzerinde beyin matrisi ve iki ucu keskin jilet yerleştirin. Not: beyin matris dondurmak br çünkü etmeyinain buna eklemek olabilir. </li><li> CO 2 boğulma ya da servikal dislokasyon (8 haftalık) bir fare Kurban. <ol><li> % 70 etanol püskürtme sonra keskin bir makas ile kafasını kesti. kafasını hareketsiz kılmak, sıkıca başın her iki tarafını tutun. Bir kuyruk-rostral yönde orta hatta makas ile cilt kesin. Bu kafatası derinin tamamen kaldırılması teşvik etmektedir. </li><li> dorsal orta hat konumunda kafatası ve beyin arasındaki forseps yerleştirin daha sonra ilk kafatasına (lambda posterior) kaudal parçası kaldırmak ve. sol (veya sağ) parietal kemik kapmak ve dikkatlice sökün. Diğer parietal kemiğin çıkarılması için bu yordamı yineleyin. Not: Optik sinir ve beyin menenjlerin çıkarılması Ayırma daha kolay kafatası beyin ayırmak için yapmak. </li><li> Soğuk PBS tampon (25 ml) beyin aktarın ve aşırı kan çıkarmak için iki kez yıkayın. </li></ol></li><li> buz ve ma beyin matris içine beyin yerleştirinke koronal kesimler 1 mm kalınlığında dilimler elde etmek. 35 mm plastik Petri tabağı içine soğuk PBS beynin arka kısmında yer almaktadır SCZ bölgeler içeren Beyin dilimleri (1 mm) aktarın. Dikkat: beyin fissür beyin matris orta hatta yerleştirilir emin olun, koronal kesitlerin paralel düzlemi elde etmek için; bölümlerde gereksiz değişimleri önlemek için önemlidir. Not: Bregma 2-3 mm posterior beyin dilimleri alın; Bu SVZ&#39;unda gelen SCZ ayrılmasını sağlar. </li><li> Düşük büyütme ile mikroskop altında, bir bükülmüş 30G iğne 6,9 ile korteks ve hipokampus beyaz cevher alanından SCZ mikro-teşrih. Ardından, SCZ yukarıdaki korteks bölgeleri kaldırın. soğuk PBS olmadan buz üzerinde bir 35 mm plastik petri içine dilim disseke SCZ bölgesini yerleştirin. Not: olgun nöron içeren ekstra bölgelerin Kirlilik aNSCs ve neurosphere oluşum b canlılığını etkileyebilirçünkü ara bunlar ANSC kültür koşullarında hücre ölümüne uğrarlar. </li><li> bükülmüş 30 G iğne kullanılarak, hemen küçük parçalar halinde disseke dokuların doğrayın. Not: daha uzun bir zaman SCZ doku kesme için gerekli ise, kesme işleminden önce soğuk PBS içinde parçalara dokuların bırakın. </li><li> Yeniden askıya sindirim tamponu 1 ml doğranmış doku, sindirim tamponu 2 mi ihtiva eden bir 15 ml tüp doku aktarın ve 37 ° C su banyosu içinde 30 dakika için inkübe edilir. Not: iyice karıştırın etmek için tüpü her 10 dakikada sallayın. </li></ol> 3. Subcallosal Bölge türetilmiş Yetişkin Sinir Kök Hücre Kültürü <ol><li> sindirilmiş doku ayırmak hafif tüp dokunun ve ardından 5 dakika boyunca 145 xg&#39;de tüp santrifüj. sindirim tamponu yıkamak için önceden ısıtılmış N2 ortamı 1 mL süpernatan, yeniden süspansiyon haline Sindirilmiş doku atın ve yavaşça örnek çözelti P1000 pipet kullanarak 5 kez fazla pipetleyin. Not: Aşırı triturating dar olanpipetlemeyin ucu hücre canlılığı ve sonraki büyüme azaltabilir. </li><li> 5 dakika boyunca 145 x g&#39;de tüp santrifüjleyin. Süpernatant atıldıktan sonra, N2 ortamı, 1 ml hücre pelletini yeniden askıya. </li><li> olmayan bir kaplanmış 6-çukurlu plaka içindeki N2 ortamı içinde 1 ml hazırlayın ve 2 ml nihai bir hacimde süspanse hücrelerin 1 ml. </li><li> Her kuyuya EGF (20 ng / ml) ve bFGF (20 ng / ml) eklenir. Yavaşça, tabakalanmış hücrelere ilave büyüme faktörleri karıştırmak için elle 6 oyuklu kültür çanak sallayın. 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatöründe 6 oyuklu plaka tutun. </li><li> 8 gün boyunca her gün, her bir kuyucuğa EGF (20 ng / ml) ve bFGF (20 ng / ml) eklenir. Her üç gün ortam, yaklaşık 2 mi hacmını muhafaza etmek için N2 ortamı 200 ul ekle. </li></ol> Neurospheres olarak ve Tek tabakalı Kültürler için NSC&#39;lerde 4. Pasajlanması <ol><li> neurospheres toplayın ve yeni bir 15 ml konik tüp aktarabilirsiniz. Not: neurospheres sayısını (&gt; 50 mikron çapında) pede tek bir fare beyin SCz gelen R SVZ&#39;unda daha azdı 64.3 ± 7.31 idi (190.5 ± 6.33) 9. </li><li> Tek hücrelere Neurospheres ayırmak için bir 37 ° C su banyosu içinde 5 dakika için ayrılma tamponu, 0.5 ml Neurospheres inkübe edin. Birincil Neurospheres tek hücre halinde ayrılmış ve neurosphere ya tek tabakalı kültürler halinde birçok pasaj boyunca muhafaza edilebilir. Not: SCZ-aNSCs bir neurosphere kültürü biçiminde bir tek tabakalı kültürü biçimde&gt; 10 kat, fakat &lt;5 kere daha pasaj yapıldı, çünkü tek-katman olarak SCZ-aNSCs Genişleyen neurospheres üstündür. Dikkat: SCZ-aNSCs kuvvetli toplanmayı göstermektedir ve tek bir hücre içine, çözünmelerini zordur. Bu nedenle, neurosphere kültürü biçimi, rutin hücre genişlemesi için uygun değildir. </li><li> Yavaşça 5 dakika boyunca 145 xg&#39;de yukarı ve aşağı P1000 pipet ile en az 5 kez ve santrifüj tüpü örnek çözümü pipetlemeyin. Süpernatantı ve yeniden-su atınN2 ortamı içinde 1 ml Neurospheres geçirirler. Not: hücre canlılığı ve sonraki büyüme azaltabilir dar pipet ile öğütülerek üzerinde. </li><li> Hücre süspansiyonu (10 ul) ve% 0.4 tripan mavisi çözeltisi 1 karışımı, ve daha sonra bir hematositometre ile canlı hücre sayısını: hücre sayımı için, 1 olun. PLO / laminin ile 6 çukurlu bir levha kaplandıktan sonra, her bir N2 ortamında, 2 ml 2.5 x 10 5 hücre / ml&#39;de hücreleri plaka. Not: hücre yoğunluğu değişiklikler durumlarını ve farklılaşma potansiyelinin etkileyebilir. </li><li> 5 gün boyunca büyüme faktörleri günlük tedaviden SCZ-aNSCs (2 mi, 20 ng / ml) korumak ve bunları kanalı bunları. </li></ol> Subcallosal Bölgesi kaynaklı Yetişkin Sinir Kök Hücre 5. Farklılaşma <ol><li> SCZ-aNSCs farklılaşması için büyüme faktörleri ile 1 mi N2 (20 ng / ml), 1 x 10 5 hücre / ml bir PLO / laminin ile kaplanmış 18 mm örtücü kısım üzerine Levha aNSCs. </li><li> Sonraki gün,Hücreler sıkıca lamel bağlandıkları zaman, büyüme faktörleri kaldırmak için N2 ile büyüme ortam değişikliği. </li><li> 6 gün sonra, hücre artıklarının çıkarılması ve immün giderilmesi için 1 ml PBS ile farklılaşmış hücreleri yıkayın. Not: BrdU çoğalan hücrelerin yeni sentezlenmiş DNA içine dahil edilebilir. arzu edildiği takdirde, bu nedenle, BrdU (10 ug / ml), hücrelerin tespit öncesi hücrelerin yaşama eklenebilir. </li></ol> 6. İmmünoboyama Erişkin Nöral Kök Hücreler ve Farklılaşmış Progenitörler <ol><li> immün için, hücrelerin PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 PFA sabitleyin. Dikkat: PFA son derece zehirli olduğu; Göz ve cilt ile temasından kaçının. </li><li> % 4 PFA kaldır 3 defa PBS ile sabit hücreleri durulanır ve daha sonra 4 ° Cuntil da immün için gerekli saklayın. </li><li> (% 3 sığır serum albumin ve% 0.1 Triton X-100 1x P çözüm engelleme ile lamel hücreleri inkübeOda sıcaklığında, en az 30 dakika boyunca bs). </li><li> Taze bloke çözeltisi içinde primer antikorların hazırlanması ve 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe örnekleri. <ol><li> aNSCs immün <ol><li> Anti-Nestin ve anti-BrdU antikoru ile aNSCs Leke. tespit önce aNSCs için BrdU 20 ug ilave edin ve 2 saat boyunca inkübe. bloke etme adımı gerçekleştirmek 37 ° Cbefore 20 dakika süreyle 2 N HCI kullanılarak denatüre aşamasını gerçekleştirir. </li></ol></li><li> farklılaşmış atalarıdır immün: <ol><li> farklı progenitörlerin etiketlemek için, anti-O4, anti-BIII-tubulin, ve anti-glial fibriler asidik protein (GFAP) antikorları kullanın. </li></ol></li></ol></li><li> PBS ile 3 kez örnekleri yıkayıp floresan boyalar (1: 500) ile konjuge sekonder antikor ile inkübe oda sıcaklığında 30 dakika süre ile çözelti bloke. Sonra, PBS ile numuneleri 3 kere yıkayın. Not: birincil ana maç Kullanım sekonder antikorlarantikorlardır. Hoechest33343 (1: 2,000) nükleer boyama için kullanılmaktadır. </li><li> bir slayt cam monte çözüm ekleyin ve montaj ile devam edin. Birden fazla dalga boylarında bir konfokal mikroskop örnek gözlemlemek ve görüntü: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm) ve Hoechest33343 (405 nm). </li></ol>

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Developmental biology. 175, 1-3 (1996).</li>
<li>Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+monolayer+precursor+cell+cultures+from+micro-dissected+adult+mouse+dentate+gyrus+yield+functional+granule+cell-like+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons.</a> PloS one. 2, e388(2007).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+adult+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in adult subventricular zone.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 629-634 (2002).</li>
<li>Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKempermann%2C+G+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22">Cold Spring Harbor perspectives in biology</a>. 7, a018812(2015).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li>
<li>Seri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+organization+of+the+SCZ%3A+a+large+germinal+layer+containing+neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain.</a> Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).</li>
<li>Kim, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+spontaneous+production+but+massive+programmed+cell+death+of+new+neurons+in+the+subcallosal+zone+of+the+postnatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain.</a> The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).</li>
<li>Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+the+subcallosal+zone+neurogenesis+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+international%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice.</a> Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+Cortical+Neurogenesis+from+the+Neural+Stem+Cells+in+the+Adult+Mouse+Subcallosal+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone.</a> Stem Cells. , (2015).</li>
<li>Nunes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature medicine. 9, 439-447 (2003).</li>
<li>Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+widespread+is+adult+neurogenesis+in+mammals%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">How widespread is adult neurogenesis in mammals?</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).</li>
<li>Gage, F. H., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+generating+and+regenerating+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: generating and regenerating the brain.</a> Neuron. 80, 588-601 (2013).</li>
<li>Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+secondary+neural+tube-derived+embryonic+neural+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro.</a> Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).</li>
<li>Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+heterogeneity+demonstrated+by+molecular+phenotyping+of+clonal+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).</li>
<li>Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+neuronal+cells+from+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+and+fibroblast+growth+factors+behave+as+mitogenic+regulators+for+a+single+multipotent+stem+cell-like+population+from+the+subventricular+region+of+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).</li>
<li>Wachs, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficacy+of+clonal+growth+and+expansion+of+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).</li>
<li>Xiong, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+time+for+passaging+neurospheres+based+on+primary+neural+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures.</a> Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).</li>
<li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Matrigel-based+culture+for+expansion+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells.</a> Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).</li>
<li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).</li>
<li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+mouse%2C+two+cultures%3A+isolation+and+culture+of+adult+neural+stem+cells+from+the+two+neurogenic+zones+of+individual+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225(2014).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Bu yazıda erişkin fare SCZ gelen NSCs oluşturmak ve çeşitli uygulamalar için onları korumak için ayrıntılı bir protokol açıklar. SCZ-NSCs arındırmak ve genişletmek için gerekli in vitro kültür sistemi kurulması için üç kritik adımlar vardır. İlk olarak, SCZ bölgesi hassas diğer potansiyel nörojenik bölgeler (Şekil 1B) dışarı parçalara sağlamak için önemlidir. SCZ bölgeler içeren kalın ve hassas Bölümler 1 mm&#39;lik aralıklı beyin matriksi ile elde edilmiştir, ve daha sonra ince bir iğne kortik...

NSC'ler kendini yenileme ve çoklu soy farklılaşması özelliklerine sahiptir. Bu özellikleri doğrulamak için, bir nörosfer kültür sistemi yaygın olarak kullanılmaktadır. Nörosfer kültür sistemi 1990'ların başında geliştirildi ve standart bir kök hücre kültürü sistemi olarak görev yaptı1. Kendini yenileme potansiyeline bağlı olarak, NSC'ler sürekli olarak çoğalır ve bir süspansiyon kültüründe bir hücre kütlesi oluşturur. Hücre sayısı ve nörosferin büyüklüğünün, NSC'lerin proliferasyon özellikleri ile yakından ilişkili olduğu düşünülmektedir. Tek katmanlı kültürler, NSC'lerin bakımı ve farklılaşması için de yaygın olarak kullanılmaktadır. Nörosfer kültürü ile karşılaştırıldığında, tek katmanlı kültür sistemi, NSC'lerin2'nin daha iyi homojen bakımını ve genişlemesini sağlar. Bu iki iyi gelişmiş kültür sistemi, aNSC'lerin in vitro karakterizasyonuna katkıda bulunmuştur. 
NSC'ler, lateral ventrikülün subventriküler bölgesi (SVZ) ve hipokampusun subgranüler bölgesi (SGZ)3-5 gibi farklı beyin bölgelerinde bulunur. Kaudal subkortikal beyaz cevherin subkallozal zonu (SCZ), yeni bir nörojenik bölge6-8 olarak kabul edilmektedir. Yakın zamanda SCZ-aNSC'lerin travmatik beyin hasarında terapötik potansiyele sahip olduğu bildirilmiştir9. Diğer nörojenik bölgelerle karşılaştırıldığında, SCZ subkortikal beyaz cevher boyunca bulunur. İnsan beyninde, subkortikal beyaz madde, fare beynindekinden daha büyük bir bölgeyi kaplar10. Bu nedenle, bir in vitro kültür sistemi kullanılarak SCZ-aNSC'lerin özelliklerinin anlaşılması, bu hücrelerin nöral rejenerasyon için potansiyel kullanımını teşvik etmek için önemlidir. İstenen beyin bölgesinin hassas diseksiyonu, aktif veya hareketsiz NSC'ler içeren istenmeyen bölgeler tarafından olası kontaminasyonu ekarte etmek için gereklidir. Örneğin, nörojenik olmayan bölgelerdeki aNSC'ler, yaralı beyinlerde veya in vitro kültürleme sırasında aktive edilebilir ve yeni nöral hücreler üretebilir11. SCZ'den NSC'leri elde etmek için, SCZ'yi içeren beyin dilimlerinden hücreler toplandı. Daha sonra, ince bir iğne kullanılarak SCZ bölgesinin dikkatli bir mikro diseksiyonu yapıldı. SCZ'den nörosfer oluşturmak için, mikro diseke SCZ doku parçaları tek hücrelere ayrıldı ve daha sonra epidermal büyüme faktörü (EGF) ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) varlığında bir süspansiyon olarak kültürlendi. SCZ-aNSC'ler nöroküreler oluşturduktan sonra, genişleme için nöroküreler veya tek tabakalar olarak da muhafaza edilebilirler. Bu prosedür aynı zamanda, tek katmanlı bir kültürde genişlemeleri ve farklılaşmalarından sonra NSC'lerin ve soylarının tespiti için çeşitli belirteçlerle immün boyama işlemlerini de gösterir. Burada, SCZ-aNSC kültür sisteminin görsel bir protokolü sunulmaktadır. Bu protokol, SCZ bölgesinin mikro diseksiyonu ve hücrelerin bakımı ve geçişi için ayrıntılı talimatlar içerir.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Orta bileşenler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DMEM / F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320-033+</td><td>L-glutamin, +Sodyum bikarbonat</td></tr><tr><td>Kalem/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Büyüme faktörü</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Tampon</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>BİYOÇÖZÜM</td><td>BP007a</td><td>1x seyreltme</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095<</td><td></td></tr><tr><td>güçlü>Ayrışma tamponu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>04-942-078-001</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ICT</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Alet</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>WPI</td><td>555229F</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>Storz</td><td>E3321-C</td><td></td></tr><tr><td>Beyin matrisi (1 mm)</td><td>RWD</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>Çift kenarlı tıraş bıçağı</td><td>DORCO</td><td>ST-300</td><td></td></tr><tr><td>30 G iğne</td><td>SUNGSHIM</td><td>N1300</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Malzemeler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml tüpler</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tüpler</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>35 mm çanak</td><td>SPL</td><td>10035</td><td>Petri kabı</td></tr><tr><td>100 mm çanak</td><td>SPL</td><td>10090</td><td>Petri kabı</td></tr><tr><td>Kapak kayması, (18 mm)</td><td>Deckglaser</td><td>111580</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyulu çanak</td><td>SPL</td><td>32012</td><td>kaplamasız</td></tr><tr><td>6 kuyulu çanak</td><td>SPL</td><td>32006</td><td>kaplamasız</td></tr><tr><td><güçlü>Kaplama malzemeleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLO</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>%0.01</td></tr> <tr><td>Laminin</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>10 mg / ml</td></tr> <tr><td>< güçlü > primer antikorlar & </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB353</td><td>fare (1:1,000)</td></tr><tr><td>EGFR</td><td>Abcam</td><td>ab2430</td><td>tavşan (1:1,000)</td></tr><tr><td>DCX</td><td>Santa Cruz</td><td>SC8066</td><td>keçi (1:500)</td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>tavşan (1:2,000)</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>13-0300</td><td>sıçan (1:1,000)</td></tr><tr><td>O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>fare (1:500)</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>Sıçan (1:500)</td></tr><tr><td><güçlü>İkincil antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-fare 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anti-fare cy3</td><td>Jackson</td><td>715-165-151</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare 647</td><td>Jackson</td><td>715-606-150</td><td></td></tr><tr><td>tavşan karşıtı 488</td><td>Alexa</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>tavşan karşıtı cy3</td><td>Jackson</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>anti-tavşan 647</td><td>Jackson</td><td>711-605-152</td><td></td></tr><tr><td>keçi karşıtı 488</td><td>Alexa</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>keçi karşıtı cy3</td><td>Jackson</td><td>705-165-147</td><td></td></tr><tr><td>keçi karşıtı 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21447</td><td></td></tr><tr><td>sıçan önleyici 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>sıçan önleyici cy3</td><td>Jackson</td><td>712-166-150</td><td></td></tr><tr><td>sıçan önleyici 647</td><td>Jackson</td><td>712-605-153</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > immün boyama malzemeleri< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Millipore</td><td>82-100-6</td><td>PBS Triton X-100 usb'de% 0.1 Triton X-100% 3 BSA</td></tr><tr><td></td><td></td><td>22686</td><td></td></tr><tr><td>%4 PFA</td><td>Biosesang</td><td>P2031</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest33342</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>H3570</td><td>Boyama çekirdekleri için boya</td></tr></tbody></table>

fare subcallosal zone İzolasyon ve yetişkin nöral kök hücre kültürü

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Yetişkin nöral kök hücreler (aNSC'ler) hasarlı beyin dokusunun yenilenmesi için kullanılabilir. NSC'ler üç tip hücreye farklılaşma ve çoğalma potansiyeline sahiptir: nöronlar, astrositler ve oligodendrositler. aNSC'den türetilen bölgelerin tanımlanması ve aNSC özelliklerinin karakterize edilmesi, aNSC'lerin potansiyel kullanımı ve nöral rejenerasyondaki rollerinin aydınlatılması için kritik öneme sahiptir. Beyaz cevher ve hipokampus arasında yer alan subkallozal bölgenin (SCZ) son zamanlarda aNSC'ler içerdiği ve sürekli olarak nöroblastlara yol açtığı bildirilmiştir. SCZ'den gelen aNSC'lerin düşük bir yüzdesi nöronlara farklılaşır; Çoğu hücre, oligodendrositler ve astrositler gibi glial hücrelere farklılaşır. Bu hücrelerin travmatik kortikal yaralanma için terapötik bir potansiyele sahip olduğu öne sürülmektedir. Bu protokol, yetişkin bir fare beyninden SCZ-aNSC'ler üretme sürecini ayrıntılı olarak açıklar. SCZ içeren koronal dilimleri elde etmek ve SCZ'yi tüm beyinden hassas bir şekilde incelemek için 1 mm aralıklı bir beyin matrisi kullanılır. SCZ bölümleri başlangıçta bir nörosfer kültürüne tabi tutulur. İyi geliştirilmiş bir kültür sistemi, özelliklerinin doğrulanmasına izin verir ve NSC'ler üzerindeki araştırmaları artırabilir. Bir nörosfer kültür sistemi, proliferasyonu belirlemek ve gerçek NSC'leri toplamak için yararlı bir araç sağlar. Tek katmanlı bir kültür aynı zamanda proliferasyon ve farklılaşmayı test etmek için in vitro bir sistemdir. Önemli bir şekilde, bu kültür sistemi, NSC'ler için nörosfer kültür sisteminden daha homojen bir ortam sağlar. Bu nedenle, ayrı bir beyin bölgesi kullanarak, bu kültür sistemleri, aNSC'ler ve terapötik kullanımlar için uygulamaları hakkındaki bilgimizi genişletmek için yardımcı olacaktır.

Bilinmeyen nörojenik bölgeden aNSCs için kültür sistemi tanımlayan bu hücrelerin anlamak için beyin tamir 12 potansiyel kullanımını geliştirmek için gereklidir. Farklı gelişim evrelerindeki ya da farklı bölgelerde NSC&#39;lerde farklı 3,4 davranır bilinmektedir. Son zamanlarda, bu SCZ türetilmiş hücreler SVZ türetilmiş hücreler 7-9 ile karşılaştırıldığında in vivo ve in vitro nöronal farklılaşma için farklı potansiyelleri sergilediği bil...

Erişkin nöral kök hücrelerin (aNSC'ler) genişletilmesi için kültür sistemlerinin kurulması, aNSC'lerin tedavi için incelenmesine ve uygulanmasına olanak sağlar. Subkallozal bölge (SCZ) son zamanlarda yetişkin farelerde yeni bir nöroblast oluşturan bölge olarak kabul edilmiştir. Burada, SCZ-aNSC'lerin izolasyonu, genişletilmesi ve farklılaştırılması için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Bu yetişkin sinir hücresi kültür sisteminin genel amacı, subcallosal bölgeden yetişkin sinir kök hücrelerini izole etmek ve bu hücreleri yapışmayan ve yapışkan kültür sistemlerinde genişletmektir. Bu çalışma, subcallosal bölge gibi küçük beyin lezyonlarından sinir kök hücrelerinin izolasyonu ve kültürü gibi, yetişkin sinir kök hücresi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yetişkin sinir kök hücrelerinin subcallosal bölgeden izole edilmesidir.Basit ancak hassas bir işlemdir. Bu prosedüre başlamak için beyin matrisini, çift ağızlı bir jiletle ve penseti otoklavdan geçirin. Ardından, fare beynini yıkamak için 50 mililitre soğuk PBS hazırlayın.Ardından, bir diseksiyon mikroskobu kurun ve beyin diseksiyonu ile SCZ izolasyonu için gerekli cerrahi aletleri hazırlayın. %2 B-27 ve %1 N-2 takviyeleri ile %1 penisilin-streptomisin içeren F-12 DMEM medyumu hazırlayın. Daha sonra, doku sindirimi için sindirim tamponunu hazırlayın.Ardından, %0,01 Poly-L-Ornitin ve laminin hazırlayın. Sonrasında, SCZ yetişkin nöral kök hücrelerinin monokatman olarak sürdürülmesi için altı küçük plakayı veya immün boyama için 18 milimetrelik lamelleri kaplayın. Da

isolation-culture-adult-neural-stem-cells-from-mouse-subcallosal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video embriyonik farelerin gelişmekte olan korteks neuroprecursors izolasyonu için kullanılan yöntem açıklanır. , Embriyoların rahim kaldırarak, kortikal doku diseksiyon, ve sindirerek izole serebral korteks prosedür gösterilmiştir.

Fare Nöral Kök Hücre Öncüleri Kültür

Bu video protokolü yetişkin fare periventriküler bölge nöral kök hücreler oluşturmak ve genişletmek için neurosphere assay yöntemi gösterir ve bir tekrarlanabilir neurosphere kültürleri elde edebilirsiniz sağlamak için teknik bilgiler sağlar.

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Bu video protokolü, embriyonik gün 14-fare beyninde ganglion eminences nöral kök hücrelerin izolasyonu ve genişleme için neurosphere testinin uygulama göstermektedir.

Neurosphere Testi kullanarak Embriyonik Fare Nöral Kök Hücre Kültürü oluşturulması

Video, fare beyninin subkallozal bölgesinden nöral kök hücrelerin izole edilmesi ve kültürlenmesi sürecini göstermektedir. Dokuların diseksiyonunu, enzimatik dissosiyasyonu ve olgun nöral hücrelere dönüşmek için farklılaşma faktörleriyle kültürlenmesini içerir.

Fare Subkallozal Bölgesinden Erişkin Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Bu video, yetişkin fare beyninden lateral ventrikül duvarlarını izole etmek ve tek hücreler elde etmek için enzimatik doku ayrışması gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Bu hücreler daha sonra nöral kök hücrelerin proliferasyonunu seçici olarak artıran ve bunların oligodendrositlerin ve astrositlerin ko-kültürlerine farklılaşmasını teşvik eden spesifik kültür koşullarına tabi tutulur.

Yetişkin fare nöral kök hücrelerinden karışık oligodendrosit ve astrosit kültürü elde edilmesi

Bu video, doğum sonrası fare beyinciğinden kök hücreleri izole etmek ve bunları nöral hücrelere ayırmak için bir yöntemi göstermektedir. İzole edilmiş hücre süspansiyonundan elde edilen kök hücreler, antikor kaplı manyetik boncuklar kullanılarak saflaştırılır ve nöroküreler oluşturmak üzere kültürlenir. Nörosferler daha sonra nöral hücreler oluşturmak için bir farklılaşma ortamında tutulur.

Doğum Sonrası Fare Beyinciğinden Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Nöral Hücrelere Farklılaşması

Yetişkin beyin hasat nöral kök hücreler sinir sistemi gelişiminin temel araştırma rejeneratif tıpta potansiyel klinik uygulamaları keşfetmek için çeşitli uygulamalar kullanılmaktadır artmaktadır. Bu deneysel sonuçların ses için kritik bu hücreleri büyümek için kullanılan yalıtım ve kültür koşullarında titiz kontrolü yapar.

Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen

Burada subventricular bölgesi ve bireysel yetişkin farelerin kıvrımlarının gelen yapışkan tek katman veya neurospheres ya gibi, sinir öncü hücre kültürlerinin eş zamanlı üretimi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

Nöral kök hücreleri (NSC'ler) ve soylarını yetişkin fare beyninin subventriküler bölgesinden (SVZ) izole etmek için Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) tabanlı bir yöntem bildiriyoruz. Floresan Ubikitinasyon Hücre Döngüsü Göstergesi (FUCCI) transgenik farelere uygulandığında, canlı görüntüleme ile hücre döngüsü ilerlemesinin incelenmesine izin verir.

Hücre Yetişkin Fare subventricular Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücreler Sıralama ve Hücre Döngüsü Dynamics Canlı görüntüleme

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Burada, erişkin murin subventriküler bölgesinden izole edilen genişletilmiş nöral kök hücrelerde (NSC'ler) gen iletim verimliliğini artırmak için tasarlanmış bir nükleofeksiyon sistemini açıklıyoruz. Bulgular, bu yöntemin NSC'lerde gen bozulmasını önemli ölçüde iyileştirdiğini, geleneksel transfeksiyon protokollerinin etkinliğini aştığını ve hücre sağkalım oranını artırdığını göstermektedir.

Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

Öğrenin, fare subcallosal bölgesinden yetişkin nöral kök hücre izolasyonu ve kültürü için basit ama hassas bir yöntem. Bu teknik, nörolojik hastalıkların tedavisinde yenilikçi araştırmaları destekler.

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Daha fazla video keşfet