Santrifüj Yerçekimi ile adipoz kaynaklı Kök Hücrelerin kondrojenik Farklılaşma İndüksiyon

Bu prosedürün genel amacı, kusurlu kıkırdak onarımı için ASC'lerin kondrojenik farklılaşmasını indüklemektir. Bu yöntem, merkezkaç yerçekimi kuvveti kullanılarak ASC'lerin prekondrojenik farklılaşmasını indüklemek içindir. Bu yöntem ASC'lerin kondrojenik farklılaşması hakkında fikir verebilse de, osteojenik ve fibrojenik farklılaşma gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, kondrojenik farklılaşmanın, herhangi bir sitokini tedavi etmeden kök hücrelerden kolayca indüklenebilmesidir. Prosedürü göstermek laboratuvarımdan Yeri Alice Rim ve Yoojun Nam olacak. 100 mililitrelik bir kültür kabından% 80 birleşik yağ türevi kök hücreleri, ortamı atarak ve beş mililitre PBS ile yıkayarak hasat ederek başlayın.

Daha sonra, bir milimolar EDTA içeren bir mililitre PBS ekleyin ve% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede iki dakika inkübe edin. İki dakika sonra, kültür plakasına hafifçe vurun, ardından dört mililitre taze ortam ekleyin ve hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında iki dakika boyunca 250 kez g'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, peleti bozmadan süpernatanı çıkarın. Ardından, peleti 10 mililitre ortamda yeniden askıya alın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.

Santrifüj yerçekimi yüklemesi için, beşinci hücrelere 2,5 çarpı on tane yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın ve 15 dakika boyunca 2400 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, pelet veya mikrokütle kültürüne devam edin. Santrifüjlemeden hemen sonra, süpernatanı ve 500 mikrolitre kondrojenik farklılaşma ortamını veya CDM'yi ve mililitre başına 50 mikrogram taze hazırlanmış L-askorbik asit 2-fosfatı pelete aspire edin.

Pozitif bir kontrol, kondrojenik farklılaşmayı indükler ve mililitre TGF-beta-1 başına 10 nanogram içeren CDM ekleyerek hücrelerini toplar. Tüpleri gevşek bir şekilde kapatın ve üç hafta boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Yerçekimi yüklemeli santrifüjlemeden hemen sonra, süpernatanı aspire edin ve peleti 10 mikrolitre CDM'de yeniden süspanse edin.

Bir mikrokütle oluşturmak için, yeniden süspanse edilmiş hücreleri 24 oyuklu bir plakanın kuyusunun ortasına pipetleyin ve ardından plakayı inkübatöre yerleştirin. İki saat sonra, mikrokütlenin bozulmasını önlemek için plakanın duvarına pipetleyerek kuyuya dikkatlice 500 mikrolitre CDM ekleyin. Pozitif bir kontrol olarak, mililitre TGF-beta-1 başına 10 nanogram içeren CDM ekleyerek santrifüjlenmemiş hücrelerle bir mikrokütle kültürü gerçekleştirin.

Mikrokütleyi üç hafta boyunca inkübe edin. Mikrokütle oluşumundan sonraki 21. günde, küresel peletleri hasat etmek için bir pipet kullanın ve ardından 1X PBS ile yıkayın. Küresel peletleri 24 saat boyunca %4 paraformaldehite daldırarak sabitleyin.

Ertesi gün, fiksatifi atın ve hücre peletlerini deiyonize su ile durulayın. Doku kasetine bir kat gazlı bez yerleştirin ve sabit küresel topakları bir pipet kullanarak aktarın. Gazlı bezi katlayarak peletin üzerini örtün ve kaset kapağını kapatın.

Daha sonra, küresel peletleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca% 70 etanole daldırarak kurutun. Ardından, her biri beş dakika boyunca bir dizi etanol konsantrasyonu ile devam edin. Ardından peletleri 15 dakika boyunca %100 ksilene batırın.

Gömmek için küresel peletleri 56 santigrat derecede parafine batırın. Ardından, döner bir mikrotom kullanarak parafine gömülü hücre peletinden beş mikron kalınlığında bölümler kesin. Bölümleri %50 etanolde yüzdürün ve ardından 50 santigrat derece su banyosuna aktarın.

Yüzen bölümleri slaytlara monte edin ve ardından immüno-floresan boyama için safranin o ve alcian mavisine geçin. Uygun bir merkezkaç yerçekimi kuvveti belirlemek için, ASC'ler sıfır, 300, 600, 1, 200 ve 2.400 kez g merkezkaç yerçekiminde on beş dakika boyunca döndürüldü. SOX9 mRNA ekspresyonu, CG stimülasyonundan 24 saat sonra değerlendirildi.

2.400 kez g'lik bir CG, SOX9 mRNA ekspresyonunu önemli ölçüde indükledi. Kondrogenez ile ilişkili genlerin ekspresyonunu değerlendirmek için, toplam RNA, uyarılmamış ASC'lerden, santrifüjlenmiş veya TGF-beta-on ile muamele edilmiş ASC'lerden ekstrakte edildi. Burada görüldüğü gibi, CG stimülasyonu kollajen tip-2 ve agrekan ekspresyonunu indükler.

CG ile tedavi edilen ASC'lerde kollajen tip-2'nin aşırı ekspresyonu, bir Alexa Fluor 594 konjuge ikincil antikorda kollajen tip-2'ye karşı bir antikor kullanılarak immünofloresan ile doğrulandı. CG'nin kondrogenez ile ilişkili ECM aşırı ekspresyonu üzerindeki etkisini belirlemek için, ASC'ler pozitif kontrol olarak TGF-beta-one ile tedavi edildi. Negatif kontrol, CG yüklemesine veya TGF-beta-one işlemine tabi tutulmamış bir pelet kültürüydü.

Kondrogenez ile ilişkili ECM'nin aşırı ekspresyonu, safranin o ve alcian mavisi boyama kullanılarak santrifüjlenmiş ASC'lerden oluşan küresel peletlerde değerlendirildi. Eklem kıkırdağının önemli bir bileşeni olan glikozaminoglikan, alcian mavisi ile maviye boyandı veya safranin o ile turuncuya boyandı. 14 günlük mikrokütle kültüründen sonra, kondrosit yoğunlaşması agregaların boyutuna göre değerlendirildi.

CG tarafından üretilen her bir agreganın boyutu yaklaşık 0,5 milimetre idi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 30 dakika içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, merkezkaç yerçekimi kuvveti kullanarak kök hücrelerin kondojenik farklılaşmasının nasıl indüklendiğini iyi anlamış olmalısınız.