Name: Santrifüj Yerçekimi ile adipoz kaynaklı Kök Hücrelerin kondrojenik Farklılaşma İndüksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Keşfedin santrifüj yerçekimi kullanarak adipoz kaynaklı kök hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını. Bu sitokinsiz yöntem SOX9 upregülasyonu ile kıkırdak onarımı için umut vaat eden bir strateji sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Kore Cumhuriyeti Sağlık ve Refah Bakanlığı (hibe numarası: HI14C2116) ve Kore Katolik Üniversitesi Seul St. Mary's Hastanesi Araştırma Fonu tarafından finanse edilen Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi'nin bir hibesi ile desteklenmiştir.

Bu çalışma protokolü NIH kurallarına göre Kore Katolik Üniversitesi (KC16EAME0162) kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. Bütün dokular yazılı bilgilendirilmiş rıza ile elde edilmiştir. 1. Santrifüj Yerçekimi Yükleme ve Pelet Kültür <ol><li> Hücre kültürü ve hasat <ol><li> Kültür TSK (P2-P3; Malzemelerin listesine bakınız), 37 ° C&#39;de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı düşük glikoz (DMEM-LG) &#39;de % 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde. </li><li> Hücreler% 80 kaynaşmaya eriştikten sonra, orta atmak ve 1 x fosfat tamponlu tuz 5 mL (PBS) hücreleri yıkamak. </li><li> PBS içeren 1 mM EDTA 1 ml ilave edilir ve% 5 CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C&#39;de 2 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> hücreleri transferi, hafifçe kültürü plakası dokunun taze ortam 4 ml15 ml konik tüp, santrifüj, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca (RT) 250 x g&#39;de hücreleri. </li></ol></li><li> Santrifüj yerçekimi yükleme <ol><li> Santrifüj (aşama 1.1.4) sonra pelet bozmadan süpernatant kaldırmak ve% 10 FBS bulunan DMEM-LG 10 mL pelletini. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> CG yükleme için, 15 dakika için 2400 x g &#39;de, yeni bir 15 mL konik tüp ve santrifüj 2.5 x 10 5 hücre transfer edin. </li></ol></li><li> pelet kültürü <ol><li> Hemen Santrifüjlemeden sonra, süpernatan aspire ve belirlenen kondrojenik farklılaştırma ortamının 500 ul ekle (CDM, yüksek glukozlu DMEM,% 1 FBS,% 1 ITS + karışımlar, 100 nM deksametason, 1x MEM gerekli olmayan amino asit çözeltisi, 50 ug ile takviye / ml L-prolin, ve% 1 penisilin / streptomisin). Her bir değiştirilen ortam içinde taze hazırlanmış L-askorbik asit 2-fosfat 50 ug / ml. Bir pozitif kontrol olarak, kondrojenik differentiati sebepekleyerek santrifujlenmemiş hücrelerde ilgili CDM 10 ng / ml TGF-ß1 ihtiva etmektedir. </li><li> Bir ayakta durma konumunda peletleri içeren gevşek kapatılmış tüp yerleştirilir ve% 5 CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 3 hafta boyunca her gün orta değiştirin. </li></ol></li><li> Micromass kültürü <ol><li> Hemen santrifüj (aşama 1.2.2, 15 dakika boyunca 2400 x g) sonra, süpernatan aspire ve CDM 10 mcL pelletini. </li><li> bir mikro oluşturmak üzere bir 24-çukurlu plaka iyi merkezinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler yerleştirin. </li><li> 2 saat sonra, dikkatli bir şekilde mikrokütle bozmamak için plakanın duvara de, pipetleme CDM 1 ml. Bir pozitif kontrol olarak, 10 ng / ml TGF-ß1 ihtiva CDM eklenerek santrifujlenmemiş hücreleri ile bir Micromass kültürü yerine getirir. </li><li> % 5 CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C &#39;de mikrokütle inkübe edin. </li><li> orta EV değiştirme3 hafta boyunca gün ery. </li></ol></li></ol> 2. Ters Transkriptaz-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) kondrojenik Farklılaşma İşaretlerinin transkripsiyonel upregülasyonun Algılama için <ol><li> 14. günde, 1 x PBS içinde bunları yeni bir 1.5 ml tüp küremsi pelet aktarmak ve yıkama için bir pipet kullanın. </li><li> Guanidinyum tiosianat-fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemi 9 kullanarak pelet toplam RNA ekstrakte edin. </li><li> üreticinin protokolüne uygun olarak, ters transkriptaz kullanılarak toplam RNA 2 ug cDNA sentez (1 saat boyunca 42 ° C&#39;de inkübe ve daha sonra 5 dakika süreyle 70 ° C &#39;de enzimi inaktive). </li><li> Kondrojenik farklılaşma markörünü 10 için özel primerler ile PCR gerçekleştirin. </li></ol> 3. Boyama kondrojenik Farklılaşma Marker proteinlerin aşırı ekspresyonu Algılama için <ol><li> Parafin gömme hücre topakları <ol><li> 21. günde,sfero pelet hasat ve 1x PBS ile onları yıkamak için bir pipet kullanın. </li><li> 24 saat süreyle% 4 paraformaldehid içinde daldırma ile küremsi pelet sabitleyin. Dikkat: Paraformaldehyde son derece toksiktir. Gözlere, cilde veya mukoza ile temasından kaçının. maruziyeti en aza indirmek ve hazırlanması sırasında solunması. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. </li><li> fiksatif atın ve deiyonize su (DW) ile hücre pelletleri durulayın. </li><li> kasete gazlı bir katmanı yerleştirin ve bir pipet kullanarak sabit pelet aktarın. gazlı katlanarak pelet Kapak ve kaset kapağını kapatın. </li><li> pelet dehydrate. <ol><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 70 etanol (EtOH) &#39;de pelet bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 80 EtOH içinde peletler bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 95 EtOH içinde peletler bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 100 EtOH içinde peletler bırakın. İki kez tekrarlayın. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 100 ksilen pelet bırakın. Tekrarlama twice. </li></ol></li><li> bir kalıba 56 ° C&#39;de parafin sabit hücre pelletleri yerleştirme; pelet uzmanlaşmış otomatik doku işleme sistemlerini kullanarak parafin içine gömülü olabilir. </li><li> bir döner mikrotom kullanılarak parafine gömülü hücre topağından 5 um kalınlığında kesitler halinde kesilmiştir. </li><li> % 50 EtOH bölümleri yüzer ve sonra bir slayt kullanarak bir 50 ° C su banyosunda aktarabilirsiniz. </li><li> Slaytlarınıza yüzen bölümleri yerleştirin. </li></ol></li><li> Safranin O ve Alcian blue boyama <ol><li> Parafin bölümleri rehidrate. <ol><li> 15 dakika ksilen slaytlar daldırın. İki kez tekrarlayın. </li><li> 5 dakika boyunca% 100 EtOH içinde slaytlar bırakın. İki kez tekrarlayın. </li><li> 5 dakika boyunca% 90 EtOH slaytlar daldırın. </li><li> 5 dakika boyunca% 80 EtOH slaytlar daldırın. </li><li> 5 dakika boyunca% 70 EtOH slaytlar bırakın ve daha sonra 1 x PBS içinde yıkayın. </li></ol></li><li> % 1 Safranin O solüsyonu ve% 3 Alcian mavi için birlikte rehidrate bölümleri Leke30 dk. </li><li> boyama çözüm atın ve DW ile bölümleri durulayın. </li><li> 1 dakika boyunca Hematoksilen / Eosin çözeltisi (counterstain) ile bölümleri Leke. </li><li> boyama çözüm atın ve DW ile bölümleri durulayın. </li><li> herhangi bir artık suyun çıkarılmasından sonra bir lamel üzerine monte ortamının bir drop yerleştirin. Dikkatle montaj orta içeren lamel slayt (aşağı hücre tarafı) yerleştirin. </li><li> slaytlar oda sıcaklığında 2-3 saat süreyle kurumaya bırakın. </li><li> Parlak alan mikroskobu (otomatik dik bir mikroskop, 50X ve 200X) kullanarak görüntüleri yakalayabilir. </li></ol></li><li> immünofloresan tahlil <ol><li> Bölüm 3.2.1&#39;de tarif edildiği gibi bölümleri rehidrate. </li><li> sodyum sitrat tampon maddesi içinde slaytlar (10 mM sodyum sitrat,% 0.05 Tween 20, pH 6.0) daldırın ve bir mikrodalga kullanılarak 10 dakika için bir alt-kaynama sıcaklığında onları korumak. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika için slaytlar soğutun ve daha sonra, musluk suyu ile yıkanır. </li><li> % 3 slaytlar inkübeH 2, daha sonra O 15 dakika boyunca (1 x PBS içinde) 2 ve 15 dakika 11 musluk suyu ile yıkayın. </li><li> 1 saat boyunca tampon (PBS içinde% 10 normal keçi serumu) ile slaytlar bloke. </li><li> engelleme çözeltisi aspire ve slaytlar üzerine% 5 normal keçi serumu ile seyreltilmiş birincil antikor uygulayın. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece slaytlar inkübe edin. </li><li> 5 dakika her biri için 1x PBS slaytlar üç kez yıkayın. </li><li> karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 normal keçi serumu ile seyreltildi florokrom-konjuge sekonder antikor slaytlar inkübe edin. </li><li> karanlıkta 5 dakika her biri için 1x PBS slaytlar üç kez yıkayın. </li><li> 10 dakika için DAPI (1 ug / mL) ile slaytlar inkübe, ve daha sonra 5 dakika her biri için 1 x PBS içinde onları iki kez yıkayın. </li><li> herhangi bir artık suyun çıkarılmasından sonra bir lamel üzerine monte ortamının bir drop yerleştirin. Dikkatle montaj ortamda slayt (aşağı hücre tarafı) yerleştirin. </li><li> slaytlar 2-3 kurumasını bekleyinOda sıcaklığında, karanlıkta, H. </li><li> Floresan mikroskobu kullanarak slaytlar gözünüzde canlandırın (: 594 nm, DAPI: Rhod 340 nm; 60X ve 200X büyütme) 12. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta1+and+dexamethasone+on+the+growth+and+chondrogenic+differentiation+of+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells.</a> Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).</li>
<li>Erickson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+potential+of+adipose+tissue-derived+stromal+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo.</a> Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).</li>
<li>Sah, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+response+of+cartilage+explants+to+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression.</a> J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).</li>
<li>Sakao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chondrogenic+phenotype+in+synovium-derived+progenitor+cells+by+intermittent+hydrostatic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure.</a> Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).</li>
<li>Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenesis+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-polyurethane+composites+is+modulated+by+frequency+and+amplitude+of+dynamic+compression+and+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress.</a> Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).</li>
<li>Alves da Silva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+chitosan-based+scaffolds+using+a+flow-perfusion+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).</li>
<li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microstructure+and+gene+expression+of+articular+chondrocytes+cultured+in+a+tube+under+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress.</a> Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).</li>
<li>Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugation+of+human+lung+epithelial+carcinoma+a549+cells+up-regulates+interleukin-1beta+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+using+TRIzol+%28TRI+reagent%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent).</a> Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UVB+induces+HIF-1alpha-dependent+TSLP+expression+via+the+JNK+and+ERK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways.</a> J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).</li>
<li>Wu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+human+telomerase+reverse-transcriptase+%28hTERT%29+re-appraised%3A+nucleolin+and+telomerase+cross+paths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths.</a> J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).</li>
<li>Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+chondrogenic+phenotype+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Regulation of the chondrogenic phenotype in culture.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).</li>
<li>Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Sox9+has+essential+roles+in+successive+steps+of+the+chondrocyte+differentiation+pathway+and+is+required+for+expression+of+Sox5+and+Sox6%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6.</a> Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).</li>
<li>Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+is+a+potent+activator+of+the+chondrocyte-specific+enhancer+of+the+pro+alpha1%28II%29+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene.</a> Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+for+clinical+application+to+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+regeneration+of+articular+cartilage+and+subchondral+bone+in+vivo+using+MSCs+induced+by+a+spatially+controlled+gene+delivery+system+in+bilayered+integrated+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).</li>
<li>Janzen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell+ageing+modified+by+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a.</a> Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).</li>
<li>Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+mesenchymal+progenitors+from+human+bone+marrow+differentiate+in+vitro+according+to+a+hierarchical+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model.</a> J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).</li>
</ol>

Bu çalışmayla ilgili herhangi bir çıkar çatışmamız olmadığını beyan ederiz.

hücrelerin stemness durumu SOX9 CG indüklenen aşırı ekspresyonu için çok önemlidir. Bizim çalışmamızda, SOX9 sentezleme ancak sonraki geçiti TSK, erken geçit TSK (2-3) &#39;de CG neden olabilir. Yetiştirilmesi sırasında, TSK 3 pasajlar 16 kadar, CD34 + hücreleri içermektedir, bildirilmiştir. TSK hücreleri CG düşük bir yanıt elde geçişli olarak CD34 ifadesini kaybetmek eğilimindedir. merkezkaç yerçekimi kuvveti ile, hidrostatik basınç CG uyarılması sırasında hücreler ü...

eklem kıkırdağında Kusur doğal iyileşmek yok. Sonuç olarak, hücre transplantasyonu bozulmuş kıkırdak tamiri için umut verici bir yaklaşım olarak önerilmiştir kaynaklanıyor. Bununla birlikte, bu yöntem, bir kök hücre, yeterli sayıda elde edilmesi ve kondrojenik farklılaşma geçmesi bu hücrelerin uyarılmasını gerektirir. Kemik iliği (BM), yaygın olarak, kök hücre kaynağı olarak kullanılmıştır, ancak BM hücre izolasyonu, iki önemli dezavantajı vardır: invaziv ve yetersiz verim. Çünkü satın kolaylığı nedeniyle, yağ dokusu, kök hücrelerin tercih edilen kaynağıdır. Daha önceki çalışmalar, adipoz dokusundan kök hücrelerin izole edilmesi ve TGF-ß1 1, 2 gibi sitokinler kullanılarak bu hücrelerde kondrojenik farklılaşmasını uyaran uygulanabilirliğini ortaya koymuştur. Bu yöntemler etkili ama pahalı. sitokinler için daha düşük bir ekonomik alternatif olarak, mekanik strese kullanılabilirkondrojenik farklılaşmasını indükler. Mekanik yükleme eklem kıkırdağı 3 sağlığını korumada önemli bir rol oynar, ve çeşitli hücrelerde kondrojenik fenotipleri neden olabilir. Örneğin, hidrostatik basınç MAP kinaz / JNK yolunun 4 üzerinden sinovya kaynaklı progenitör hücrelerde kondrojenik fenotipleri neden olur ve mekanik sıkıştırma kondrositik genleri 5 regülasyonunda insan mezenkimal kök hücrelerin (MKH) &#39;de kondrojenezi neden olur. Buna ek olarak, kayma gerilmesi insan MSC 6 kondrogenezis ilgili ekstrasellüler matriks (ECM) ifadesi katkıda bulunur. Santrifüj ağırlığı (CG), santrifüj ile üretilen bir kolaylıkla uygulanabilen ve kontrollü mekanik stres, hücre 7 farklı gen ifadesini endükleyebilen. Örneğin, akciğer epitelyal karsinom hücrelerinde, interlökin (IL) -1b sentezlenmesi santrifüj 8 ile üst-düzenlenmektedir. Therefore, deneysel olarak uyanlabilir mekanik stres, CG kök hücrelerdeki kondrositik, gen ekspresyonunu başlatmak için kullanılabilir. Ancak, CG kök hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını teşvik edip belirsizliğini koruyor. Bu çalışmada, CG kondrositik genlerin tanımlanması sonuçlanan insan TSK olarak, SOX9 uyarılması, kondrojenez bir ana regülatör neden olduğu bulunmuştur. Buna ek olarak, TGF-ß1 olanlar ile kondrojenez CG etkileri, büyüme faktörü en çok kök hücrelerin in vitro kondrojenezi indüklemek için kullanılan göre.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mm Çanak</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Çanak</td><td>TPP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Kornikal Tüp</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Kornikal Tüp</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Tek Kullanımlık Pipet</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tek Kullanımlık Pipet</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">ASC Kültür Ortamı Malzemeleri</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Düşük Glikoz</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11885-084</td><td>büyüme baz ortamı</td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>%1</td></tr> <tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16000-044</td><td>%10</td></tr> <tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12604-039<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4"><güçlü>kondrojenik Farklılaşma Ortamı Malzemeler</td></tr><tr><td>DMEM Yüksek glikoz</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11995</td><td>kondrojenik farklılaşma temel ortamı</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915 100</td><td>nM</td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P4333</td><td>%1</td></tr> <tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16000-044</td><td>%1</td></tr> <tr><td>Askorbat-2-fosfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 &# 956; g/mL</td></tr><tr><td>L-prolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607</td><td>50 & # 956; g/mL</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td></td> 354352 <td>%1</td></tr> <tr><td>İnsan TGF & beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>18 mm Kapak Camı</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>%4 Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Yenilik</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin Vektör</td><td>Laboratuvarı</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kollajen II antikoru</td><td>abcam ve nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 594 eşlenik</td><td>Moleküler Prob</td><td>A-11037</td><td>1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Moleküler Prob</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Uzun süreli altın antifade reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Sürgülü Cam, Kaplamalı</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>İzoprilalkol</td><td>Milipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Sentez kiti</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA Polimeraz</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Tampon Yaşam</td><td>Teknolojileri</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>yükleme yıldızı</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) DNA merdiven işaretleyicisi</td><td>Enzimomik</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>İnsan yağ kaynaklı kök hücreler (ASC'ler)</td><td>Katolik MASTER Hücreleri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

santrifüj yerçekimi ile adipoz kaynaklı kök hücrelerin kondrojenik farklılaşma İndüksiyon

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Bozulmuş kıkırdak doğal olarak iyileşemez. Şu anda, kıkırdak defektleri için en gelişmiş tedavi, sitokinler kullanılarak kök hücrelerden farklılaşan kondrositlerin transplantasyonudur. Ne yazık ki, sitokin kaynaklı kondrojenik farklılaşma maliyetli, zaman alıcıdır ve in vitro farklılaşma sırasında yüksek kontaminasyon riski ile ilişkilidir. Bununla birlikte, biyomekanik uyaranlar da kondrogenez için çok önemli düzenleyici faktörler olarak hizmet eder. Örneğin, mekanik stres, kök hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını indükleyebilir ve bu da bozulmuş kıkırdağın onarımı için potansiyel bir terapötik yaklaşım olduğunu düşündürür. Bu çalışmada, santrifüjleme ile kolayca uygulanan mekanik bir stres olan santrifüj gravitenin (CG, 2.400 × g), adipoz kaynaklı kök hücrelerde (ASC'ler) cinsiyet belirleyici bölge Y (SRY)-kutu 9'un (SOX9) yukarı regülasyonunu indükleyerek kondrojenik fenotipleri eksprese etmelerine neden olduğunu gösterdik. Santrifüjlenmiş ASC'ler, agrekan (ACAN), kollajen tip 2 alfa 1 (COL2A1) ve kollajen tip 1 (COL1) gibi daha yüksek seviyelerde kondrojenik farklılaşma belirteçleri ifade etti, ancak daha düşük seviyelerde kollajen tip 10 (COL10), hipertrofik kondrositlerin bir belirteci. Ek olarak, santrifüjlenmiş ASC'lerde kondrogenez için bir ön koşul olan kondrojenik agrega oluşumu gözlenmiştir.

Santrifüj gravite adipoz elde edilen kök hücreleri kondrojenik farklılaşma markerlerinin aşırı ekspresyonunu indükler. kondrojenik değişimi etkilemek için uygun olan, santrifüj yerçekimi kuvveti derecesini belirlemek için, TSK 15 dakika için farklı CG derece (0, 300, 600, 1200 ve 2400 x g) ile uyarıldı. stimülasyon sonrasında TSK kültür plakaları üzerine yeniden ekildi ve 24 saat süre ile kültüre edildi. Şekil 1A'da</s...

Mekanik stres, kök hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını indükleyebilir ve bozulmuş kıkırdağın onarımı için potansiyel bir terapötik yaklaşım sağlar. Merkezkaç gravitesi (CG) kullanarak adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) kondrojenik farklılaşmasını indüklemek için bir protokol sunuyoruz. SOX9'un CG kaynaklı yukarı regülasyonu, kondrojenik fenotiplerin gelişmesine neden olur.

Santrifüj Yerçekimi ile adipoz kaynaklı Kök Hücrelerin kondrojenik Farklılaşma İndüksiyon

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Bu prosedürün genel amacı, kusurlu kıkırdak onarımı için ASC'lerin kondrojenik farklılaşmasını indüklemektir. Bu yöntem, merkezkaç yerçekimi kuvveti kullanılarak ASC'lerin prekondrojenik farklılaşmasını indüklemek içindir. Bu yöntem ASC'lerin kondrojenik farklılaşması hakkında fikir verebilse de, osteojenik ve fibrojenik farklılaşma gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Bu tekniğin temel avantajı, kondrojenik farklılaşmanın, herhangi bir sitokini tedavi etmeden kök hücrelerden kolayca indüklenebilmesidir. Prosedürü göstermek laboratuvarımdan Yeri Alice Rim ve Yoojun Nam olacak. 100 mililitrelik bir kültür kabından% 80 birleşik yağ türevi kök hücreleri, ortamı atarak ve beş mililitre PBS ile yıkayarak hasat ederek başlayın.Daha sonra, bir milimolar EDTA içeren bir mililitre PBS ekleyin ve% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede iki dakika inkübe edin. İki dakika sonra, kültür plakasına hafifçe vurun, ardından dört mililitre taze ortam ekleyin ve hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında iki dakika boyunca 250 kez g'de santrifüjleyin.Santrifüjlemeden sonra, peleti bozmadan süpernatanı çıkarın. Ardından, peleti 10 mililitre ortamda yeniden askıya alın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.Santrifüj yerçekimi yüklemesi için, beşinci hücrelere 2,5 çarpı on tane yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın ve 15 dakika boyunca 2400 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, pelet veya mikrokütle kültürüne devam edin. Santrifüjlemeden hemen sonra, süpernatanı ve 500 mikrolitre kondrojenik farklılaşma ortamını veya CDM'yi ve mililitre başına 50 mikrogram taze hazırlanmış L-askorbik asit 2-fosfatı pelete aspire edin.Pozitif bir kontrol, kondrojenik farklılaşmayı indükler ve mililitre TGF-beta-1 başına 10 nanogram içeren CDM ekleyerek hücrelerini toplar. Tüpleri gevşek bir şekilde kapatın ve üç hafta boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Yerçekimi yüklemeli santrifüjlemeden hemen sonra, süpernatanı aspire edin ve peleti 10 mikrolitre CDM'de yeniden süspanse edin.Bir mikrokütle oluşturmak için, yeniden süspanse edilmiş hücreleri 24 oyuklu bir plakanın kuyusunun ortasına pipetleyin ve ardından plakayı inkübatöre yerleştirin. İki saat sonra, mikrokütlenin bozulmasını önlemek için plakanın duvarına pipetleyerek kuyuya dikkatlice 500 mikrolitre CDM ekleyin. Pozitif bir kontrol olarak, mililitre TGF-beta-1 başına 10 nanogram içeren CDM ekleyerek santrifüjlenmemiş hücrelerle bir mikrokütle kültürü gerçekleştirin.Mikrokütleyi üç hafta boyunca inkübe edin. Mikrokütle oluşumundan sonraki 21. günde, küresel peletleri hasat etmek için bir pipet kullanın ve ardından 1X PBS ile yıkayın. Küresel peletleri 24 saat boyunca %4 paraformaldehite daldırarak sabitleyin.Ertesi gün, fiksatifi atın ve hücre peletlerini deiyonize su ile durulayın. Doku kasetine bir kat gazlı bez yerleştirin ve sabit küresel topakları bir pipet kullanarak aktarın. Gazlı bezi katlayarak peletin üzerini örtün ve kaset kapağını kapatın.Daha sonra, küresel peletleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca% 70 etanole daldırarak kurutun. Ardından, her biri beş dakika boyunca bir dizi etanol konsantrasyonu ile devam edin. Ardından peletleri 15 dakika boyunca %100 ksilene batırın.Gömmek için küresel peletleri 56 santigrat derecede parafine batırın. Ardından, döner bir mikrotom kullanarak parafine gömülü hücre peletinden beş mikron kalınlığında bölümler kesin. Bölümleri %50 etanolde yüzdürün ve ardından 50 santigrat derece su banyosuna aktarın.Yüzen bölümleri slaytlara monte edin ve ardından immüno-floresan boyama için safranin o ve alcian mavisine geçin. Uygun bir merkezkaç yerçekimi kuvveti belirlemek için, ASC'ler sıfır, 300, 600, 1, 200 ve 2.400 kez g merkezkaç yerçekiminde on beş dakika boyunca döndürüldü. SOX9 mRNA ekspresyonu, CG stimülasyonundan 24 saat sonra değerlendirildi.2.400 kez g'lik bir CG, SOX9 mRNA ekspresyonunu önemli ölçüde indükledi. Kondrogenez ile ilişkili genlerin ekspresyonunu değerlendirmek için, toplam RNA, uyarılmamış ASC'lerden, santrifüjlenmiş veya TGF-beta-on ile muamele edilmiş ASC'lerden ekstrakte edildi. Burada görüldüğü gibi, CG stimülasyonu kollajen tip-2 ve agrekan ekspresyonunu indükler.CG ile tedavi edilen ASC'lerde kollajen tip-2'nin aşırı ekspresyonu, bir Alexa Fluor 594 konjuge ikincil antikorda kollajen tip-2'ye karşı bir antikor kullanılarak immünofloresan ile doğrulandı. CG'nin kondrogenez ile ilişkili ECM aşırı ekspresyonu üzerindeki etkisini belirlemek için, ASC'ler pozitif kontrol olarak TGF-beta-one ile tedavi edildi. Negatif kontrol, CG yüklemesine veya TGF-beta-one işlemine tabi tutulmamış bir pelet kültürüydü.Kondrogenez ile ilişkili ECM'nin aşırı ekspresyonu, safranin o ve alcian mavisi boyama kullanılarak santrifüjlenmiş ASC'lerden oluşan küresel peletlerde değerlendirildi. Eklem kıkırdağının önemli bir bileşeni olan glikozaminoglikan, alcian mavisi ile maviye boyandı veya safranin o ile turuncuya boyandı. 14 günlük mikrokütle kültüründen sonra, kondrosit yoğunlaşması agregaların boyutuna göre değerlendirildi.CG tarafından üretilen her bir agreganın boyutu yaklaşık 0,5 milimetre idi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 30 dakika içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, merkezkaç yerçekimi kuvveti kullanarak kök hücrelerin kondojenik farklılaşmasının nasıl indüklendiğini iyi anlamış olmalısınız.

chondrogenic-differentiation-induction-adipose-derived-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol, domuz adipoz kaynaklı kök hücrelerin (pADSC) deri altı yağ dokularından izolasyonunu ve çoklu potansiyelin incelenmesini tanımlar. Multipotent pADSC, adiposit farklılaşma süreçlerini tanımlamak ve rejeneratif çalışmalar için mezodermal mezenşimin çoklu hücre soylarına veya ektoderm ve endodermin diğer soylarına transdiferansiyonu incelemek için kullanılır.

Domuz Subkutan yağ dokularındaki İzolasyonu ve Yağ-Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşması

Burada, insan göbek kordonu (UC) ve kord fetal plasenta örnek izolasyonu için (CL) Wharton jöle (WJ), kordon plasenta bileşke (CPJ) ve fetal plasenta (FP) astar diseksiyon için bir protokol mevcut ve eksplant kültürü tekniği kullanılarak mezenkimal stromal hücreler (MSC) karakterizasyonu.

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

Embriyodik vücut (EB) oluşumu, fibroblastik hücrelerin genişlemesi ve kondrojenik indüksiyonu içeren entegrasyonsuz bir yöntem kullanarak, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) yoluyla insan periferik kandan (PB) bir kondrojenik soy oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

Burada, kordon kanı mononükleer hücre kaynaklı insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden kondrojenik farklılaşma için bir protokol önermekteyiz.

Kordon Kanından Oluşan İndüklü Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrojenik Pellet Oluşumu

Dendrimer tabanlı yerel arginin-glisin-aspartik asit (RGD) yüzey yoğunluğu Nano yönetilsin düzensiz nanopatterns elde etmek için bir yöntem açıklanan ve hücre adezyon ve chondrogenic farklılaşması çalışma için uygulanmıştır.

Düzensiz Nanopatterns Dendrimer tabanlı yerel olarak kumanda yüzeyi Adhesiveness için: Chondrogenic farklılaşma yönlendirmek için bir yöntem

Bu iletişim kuralının amacı insan Perivasküler Yağ dokusundan elde edilen progenitör hücre birden çok hücre soy ayırt etmek yeteneği test etmektir. Farklılaşma Mezenkimal Kök hücre adipocyte, osteocyte ve kondrosit soy ayırt etmek için bilinen insan kemik iliği elde için karşılaştırıldı.

İnsan aort Perivasküler yağ progenitör hücre farklılaşması kapasitesi

Wnt-1 Cre+/-periaortik yağ dokusundan elde edilen adipoz türetilmiş kök hücrelerin (NCADSCs) izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için bir protokol salıyoruz. Rosa26RFP/+ fareler. NCADSCs in vitro adipogenez veya lipogenez modelleme için ADSCs kolay erişilebilir bir kaynak olabilir.

Periaortik Yağ Dokusundan Nöral Adipoz-Türetilmiş Kök Hücrelerin İzolasyon, Kültür ve Adipojenik İndüksiyonu

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.

Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Yağ dokusu mükemmel bir mezenkimal kök hücre kaynağıdır. Burada, İsviçre fareleri epididimal yağ dokusundan yağ dokusu türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) adım adım ekstraksiyonunu, yetiştirilmesini ve karakterizasyonunu getiriyoruz.

Fare Epididimal Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu, İn Vitro Genişletme ve Karakterizasyonu

Bu çalışma, hücreleri yerçekimi kullanarak düşük yapışma koşulları altında sferoidler halinde toplayarak ve ardından elde edilen sferoidleri mini biyoreaktörlerde kültürleyerek kondrositik sferoidlerin üretilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır.

Yerçekimi ve Ev Yapımı Mini Biyoreaktörler Altında Düşük Yapışkan Koşullar Kullanılarak Çeşitli Kondrositlerden Sferoidlerin Üretilmesi

Keşfedin santrifüj yerçekimi kullanarak adipoz kaynaklı kök hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını. Bu sitokinsiz yöntem SOX9 upregülasyonu ile kıkırdak onarımı için umut vaat eden bir strateji sunar.

Santrifüj Yerçekimi ile adipoz kaynaklı Kök Hücrelerin kondrojenik Farklılaşma İndüksiyon

Daha fazla video keşfet