Name: Bağışıklık Yanıtları intravital multiphoton Görüntüleme Fare Kulak Skin uyaran İskemi-reperfüzyon yaralanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Öğrenin fare kulak derisinde iskemi-reperfüzyon yaralanmasını intravital multiphoton görüntüleme ile incelemeyi. Bu yöntem bağışıklık hücrelerinin dinamik davranışlarını canlı ortamda gözlemlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Thomas Graf'a bize LysM-eGFP farelerini sağladığı için teşekkür ederiz.

canlı hayvan ile ilgili tüm deneyler ilgili tüm hayvan kullanımı ve bakımı kurallarına ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmıştır. Floresan Muhabir 1. Farelerin Choice <ol><li> 6- 12 haftalık LysM-eGFP 11 fare (erkek ya da kadın ya hiçbir tercih) kullanın. Not: Çeşitli hücreye spesifik flüoresan raportör farelerin kullanılması in vivo olarak farklı bağışıklık hücrelerinin görselleştirme sağlar. Bu soyda, görselleştirilebilir monositler (GFP lo hücreleri), ve dermal makrofajlar (GFP lo hücreleri) dolaşan nötrofiller (GFP yüksek hücreler) dolaşımdaki. görüntüleme parametreleri kullanılan ile, GFP pozitif nötrofillerden sadece parlak sinyaller tespit edilecektir. Not: Cilt görüntüleme bu tip çalışmalar için uygun olan immün hücreye spesifik raportör fare suşlarının bir listesi Referans 8 bulunabilir. Not: son derece pigmen gibi, albino fareleri görüntüleme için kullanılması önerilirted fareler fotohasar daha yatkındır. pigmentli kulak derisi (doku yakma gösterir) lazer kaynaklı speckling çok daha hassas olmasıdır. Bunun bir sonucu olarak, nötrofil çoğalması ve biriktirme daha kararlı durum 8,12 sırasında görülebilir. </li><li> 12 saatlik aydınlık ve karanlık döngüsü ile belirli bir patojen içermeyen (SPF) koşullarda fareler tutun. </li></ol> 2. Fare Anestezi <ol><li> Steril su içinde çözülmüş 15 mg mL karışımı -1 ketamin ve 1 mg ml -1 ksilazin oluşan ketamin-ksilazin (8 uL g-1 vücut ağırlığı) bir intra-peritonal enjeksiyon, ile fare anestezisi. </li><li> Hazırlık işlem boyunca 37 ° C de vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerinde fare yerleştirin. Bir ayak tutam refleks yokluğu gözlemleyerek yeterli anestezi olup olmadığını kontrol edin. Not: ilk bir saat sonra, anestezi sonraki çeyrek dozları deri altından uygulanan bir gerekecektird yaklaşık 0,5 saat her sürecek. bıyık ya da kuyruk seğirmesi de anestezi kapalı giyiyor olduğunu ve bir kontör gerekli olduğunu gösterebilir. </li><li> anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri oftalmik yağ kullanın. </li></ol> 3. Depilasyon <ol><li> Dikkatle pamuk uçlu aplikatör kullanarak dorsal fare kulağın üst üçte ikisi tüy dökücü krem ​​uygulayın. </li><li> kapsamlı ama nazik bir şekilde ıslak pamuk uçlu aplikatör kullanarak krem ​​çıkarmadan önce 3 dakika - 2 bekleyin. Not: inflamasyonu 13,14 neden olabilir tüy dökücü krem, çok uzun süre fare kulağı kalmak için izin vermeyin. </li></ol> İskemi ve Reperfüzyon Hasarı 4. İndüksiyon <ol><li> fare kulak deride iskemi ikna etmek için, 12 mm çap x 2 mm kalınlığında altın kaplama, N42 dereceli neodimyum mıknatıs kullanın ve yaklaşık 3.000 Gauss derece ile. Not: Bu durumda, mıknatısların gamzeli yüzü Denotes kuzey kutbu. </li><li> bireysel plastik kılavuzlara mıknatıslar yuvası. Not: plastik kılavuz yüksek mukavemetli mıknatısların yerleştirilmesini ve ayrılmasını kolaylaştırmak için hizmet vermektedir. Nedeniyle güçlü bir manyetik kuvvet kırılması henüz düşük direnç için, birbirleriyle ya da diğer metallere yakın bireysel mıknatıslar koymayın. Birbirlerine doğru çekin eğer hurda ve dağılma oluşabilir. </li><li> Sadece kenar, ikinci (alt) mıknatıs (Şekil 3a) ile temas içinde olduğu şekilde, ilk (dorsal) mıknatıs yerleştirin Not: Bu düzgün yerleştirilmiş önce birlikte yakalamaya gelen mıknatıslar engeller. </li><li> Ventral mıknatıs kulak (Şekil 3a) düz yatıyor öyle ki her iki mıknatıslar yerleştirin. Not: iskeminin neden olduğu önce, fare, 37 ° C &#39;de tutulur ve bu yeterli anestezi (adım 2.2) muhafaza edilmesini sağlar. </li><li> Hazır kez dikkatlice (Şekil 3a mıknatıslar bir araya gelsin </strong&gt;). Not: Görüntüleme amaçları doğrultusunda, bir IR olmayan IR bölgesi görülmektedir, böylece kulak sadece yarısını kelepçe. </li><li> iskemi 1.5 saat sonra, reperfüzyon gerçekleşecek sağlayan, mıknatıslar birbirinden uzağa büküm plastik kılavuzları kullanarak mıknatıslar kaldırın. Not: Bakım mıknatıslar konulduğunda kırışmasını kulakları önlemek için alınmalıdır. Mıknatıslar kaldırıldıktan sonra makroskopik olarak görülebilen büyük kan damarları (yani, kan derhal damarları doldurur) hemen-perfuse re eksik iskemi açıktır. reperfüzyon mıknatıslar çıkarılmasından hemen sonra meydana gelmez, ancak, damar tıkanıklığı, sadece geçicidir. nedenle, mümkün olduğunca hızlı görüntüleme fare kulak hazırlamak için zorunludur. </li></ol> Kan Gemi Etiketleme Ajanlar 5. Enjeksiyon <ol><li> Hemen mıknatıs çıkarılmasından sonra, Evans mavisi (10 mg mL (retroorbital veya kuyruk ven enjeksiyon yoluyla) intravenöz yönetmek -1PBS veya tuzlu su içinde; 1 uL g -1 vücut ağırlığı) ya da seçtiğiniz başka bir kan damarı etiketleme ajanı. Not: Enjeksiyon öncesinde yeterli anestezi hala yumuşak ayak sıkıştırma fonksiyonunu gerçekleştirerek tutulmasını sağlar. </li></ol> Görüntüleme Platformunda Kulak 6. Yerleştirme <ol><li> bantlamayın uzunluğunda 1.5 cm genişliğinde 1.8 cm maskeleme 2 adet kesin. </li><li> Yapışkan kenarları genişliği boyunca yapıştırıcı yaklaşık 1 mm terk ederken birbirine yapışmasına izin verin. </li><li> Kulak platformda yarık içindeki yerleşimi karşılamak için, boylamasına ikiye maskeleme bandı kesti. </li><li> yapışkan tarafı yukarı bakacak şekilde, yarıktan hakkında yarım bu maskeleme bandı takın. </li><li> ısıtma yastığı fare yerleştirin yansıması kulak maskeleme bandı şeridi yanında böyle olduğunu. </li><li> İki PBS nemlendirilmiş pamuk uçlu aplikatör kullanarak, yavaşça yapışkan bant karşı kulağını basın. </li><li> Bir kılavuz olarak şeridi kullanarak, fare kulağı getirmekyarıktan aynı anda yakın sahnede doğru fareyi ayarlarken. </li><li> yapışkan bant kaldırmak için, öncelikle bant yapışkanlığını azaltmak için PBS bir damla ekleyin. </li><li> ince bir fırça kullanarak yavaşça mümkün olduğu kadar maskeleme bandı fare kulağı ayırın. </li><li> hafifçe kulak üzerinde nemli pamuk uçlu aplikatör yuvarlayarak kulak platformu karşı kulak düzleştirin. </li><li> (Gres ile lamel tutucu pozisyonda tutulur; Şekil 2) lamel altına PBS bir damla koyun ve yavaşça kulağına üzerine yerleştirin. Gerekirse daha fazla PBS ile kontör. Not: lamel tutucu görüntüleme sırasında stabiliteyi arttırır. </li><li> rektal sıcaklık probu yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre ısıtma sistemine telleri bağlamak. Not: 37 ° C vücut ısıtma yastığı sıcaklığı ve 35 ° C, kulak sahne platformundan ayarlayın. </li></ol> 7. multiphoton Mikroskop Setiyukarı ve Görüntüleme Parametreleri Not: Bu protokol tunable ile multiphoton mikroskobu tek bir ışın kullanır (680 - 1080 nm) Ti: Sa lazer (3.3 W nm 800; 140 fs darbe uzunluğu; 80 MHz tekrarlama oranı) 20X su amacı ile (NA = 1.0) intravital görüntüleme çalışmaları için. <ol><li> görüntüleme yazılımı açın. </li><li> üreticinin talimatlarına göre lazer hizalama. </li><li> 950 nm dalgaboyu ayarlayın. Not: GFP ve Evans mavisi 950 nm aynı anda heyecanlı olabilir. </li><li> 500 mikron 2 scanfield, 505 x 505 piksel çözünürlük, ve tek bir satır tarama 800 Hz tarama frekansı: önizleme için aşağıdaki ayarları kullanın. &quot;Önizleme&quot; ı tıklayın. </li><li> zayıflatıcı (lazer) güç değiştirir. tüm temel sinyaller ısı hasarına neden olabilir lazer gücü aşırı miktarda, Görüntüleme alanını maruz kalmadan aldı emin olun. Not: Düşük zayıflatıcı güç başlayın ve signa eğer artışl loş. Erken zamanda interstisyum sonrası reperfüzyon işaret gelen nötrofiller yok olacak gibi eski nötrofiller daha sönük olduğu gibi, makrofajlar, gerekli minimum güç belirlemek için bir gösterge olarak kullanılabilir. Not: Bu adım, ilk kez yapılması gereken ise, bozulmamış vasküler bütünlüğü beklenen olmayan iskemik bölgesi, ayarları ve zayıflatıcı güç ayarı kolaylaştıracaktır. lazer gücü kararsız değilse, bir sonraki deneylerde, bu ayarlar kadar değişiklik gerektirmez. </li><li> PMT ayarlarını yapın. Not: PMT için maksimum optimum kazanç gerilimi üreticisine başvurun. Tavsiye eşiğin ötesinde PMT gerilimi ayarı daha yüksek bir sinyal-gürültü oranı neden olacaktır. genel tavsiye tavsiye eşik PMT kazanç gerilimini ayarlamak ve sinyal çok loş olmalıdır gerektiği gibi zayıflatıcı gücünü arttırmaktır. </li><li> yakın bir görüntüleme bölge seçinmasif Evans mavisi sızıntı ile karakterize iskemi kenarı. </li><li> GFP ve sırasıyla 525/50 bant geçiren (BP) ve 655/40 BP filtrelerini kullanarak Evans mavisi sinyalleri toplayın. dermal bölmesi içinde kollajen liflerinin ikinci harmonik üretimi (SHG) sinyalleri için, bir 475/42 BP filtresi kullanın. </li><li> Mevcut görüntü analiz yazılımı uyumlu bir formatta görüntü kaydetmek için bir klasör oluşturun. </li><li> 500 mikron 2 scanfield, 505 x 505 piksel çözünürlük, ve tek satır tarama tarama frekansı 400 Hz: elde etmek için, aşağıdaki ayarları kullanın. </li><li> 4 um&#39;lik bir adım büyüklüğü 100 mikron z yığın nötrofil infiltrasyonu izlemek için, 1 dakika aralıklarla, zaman içinde tekrar tekrar elde edilebilir. Not: Özellikle yüksek bir göç hızı, hücre izleme analizi sırasında zorluklara neden olabilir en fazla 1 dakika olan bir aralık ile lökosit (örneğin, nötrofil) dir. Bu durumda, kullanıcı, AC kalınlığını azaltmakedinirken yığını veya tarama sıklığını artırmak. Not: iskemik bölgenin gerekli alıcı yığını (alternatif olarak bir üst SHG yoğunluğuna sahip) sıkıştırmanın bir sonucu olarak küçük görünse de, daha sonra reperfüzyon kulak şişmesine yol açar büyük iltihaplanma ile sonuçlanacaktır. Z-yönünde önemli kaymalar beklenmektedir. Bu nedenle, büyük bir z-yığın elde edilmesi kaymalara gereklidir. </li><li> görüntüleme boyunca nemli ve suya batırılır objektif lens kulak tutmak için düzenli olarak PBS ve su kontör. Not: Tipik bir deney genellikle 2 sürer - 4 saat. Deneysel tasarım bağlı ve görüntüleme süresini uzatılması mümkündür, iyi kontrollü anestezi rejimi ile birleştiğinde. </li></ol> 8. Deneme Sonlandırma <ol><li> pr kurumun Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) göre Karbondioksit boğulma fare Euthanizeocedures. Not: Kurumun kuralları, yönetmelik ve yönergeler ile belirlenen Daima onaylanmış yöntemlerle fare euthanize. Tekrarlanan görüntüleme gerekiyorsa anestezi kapalı giyer kadar ısıtma yastığı fare tutmak. Fare yeterli bilinci yerine ve hareketli sonra, kendi kafesine fare dönün. </li></ol> 9. Görüntü Analizi Not: Görüntüleme deneyden üretilen veriler farklı yazılım paketleri tarafından görüntülenmiştir olabilir. <ol><li> görüntü analiz yazılımı açın. </li><li> Altında dosyayı içe, Mode Aşmak (Açık → &quot;açık&quot; Click istediğiniz klasöre → herhangi bir dosyayı seçin). </li><li> Düzenleme sözde renkleri varsayılan renkler geçerli değilse (kanal sekmesinde Düzen → Ekran ayarı →, renk paletinden istediğiniz rengi seçin). </li><li> parlaklık, kontrast ve arka plan (Değiştir Max ve Min değerleri → Düzenle → Ekran Ayarı) ayarlayın. </li&gt; <li> Dosya boyutları doğru olduğundan emin olun (Düzenle → Görüntü özelliklerini → geometri sekmesi altında, voksel boyutunu kontrol edin. Bu protokolde, X = 0.99, Y = 0.99 ve Z = 4). Not: piksel çözünürlüğe göre scanfield boyutu bölerek X ve Y türevi. Z&#39;nin her dilim arasında kalınlığıdır. Not: Bu veri setleri çıkış maksimum projeksiyon film olarak sunulabilir. Not: Takip analizi tam in vivo fonksiyonlarını anlamak için hücresel faaliyetler ve etkileşimleri tanımlamak için gereklidir. yazılım mevcuttur nokta işlevini kullanarak hücre izleme ayrıntılı talimatlar Referans 15 protokol bulunabilir. Not: Referans 16 derlemede bulunabilir olan birçok nicel lökosit göç yolları, ayrıntılar vardır. </li></ol>

<ol><li>Black, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Pressure+Ulcer+Advisory+Panel%27s+updated+pressure+ulcer+staging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Skin+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system.</a> Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Huebener, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HMGB1%2FRAGE+axis+triggers+neutrophil-mediated+injury+amplification+following+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis.</a> J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).</li>
<li>Wassermann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chronic+pressure+ulcer+model+in+the+nude+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">A chronic pressure ulcer model in the nude mouse.</a> Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).</li>
<li>Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple%2C+noninvasive%2C+clinically+relevant+model+of+pressure+ulcers+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Surg%22%5BJournal%5D)">Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse.</a> J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).</li>
<li>Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+ischemia-reperfusion+injury+in+a+microcirculatory+model+of+pressure+ulcers%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers.</a> Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).</li>
<li>Li, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+immune+responses+in+the+mouse+ear+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin.</a> Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).</li>
<li>Tong, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+immune+atlas%3A+three-dimensional+analysis+of+cutaneous+leukocyte+subsets+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy.</a> J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).</li>
<li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+MCP-1+attenuates+cutaneous+ischemia-reperfusion+injury+in+a+mouse+model+of+pressure+ulcer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer.</a> J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-726 (2000).</li>
<li>Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+migration+within+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell migration within the skin.</a> Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).</li>
<li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci Rep. 3, 1913(2013).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+dermal+dendritic+cells+act+as+rapid+sensors+of+protozoan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites.</a> PLoS Pathog. 4, e1000222(2008).</li>
<li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. , e51805(2014).</li>
<li>Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+immune+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysing immune cell migration.</a> Nat Rev Immunol. 9, 789-798 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

önem IR cilt bası yarası önde gelen nedenlerinden biridir. (Altta yatan derialtı dokularda ve kaslara kıyasla) Basınç ülserlerinin erken aşamalarında (I ve II) insan derisinin durumunu açıklar. Ancak, immünolojik etiyolojisinde bir anlayış hala yetersizdir. Burada, bu boşluğu gidermek için fare kulak ciltte basit ve sağlam bir IR modeli sunuyoruz. Biz mıknatıs kaldırma (reperfüzyon) sonra aşağı bağışıklık tepkilerini incelemek iki mıknatıs ve daha sonra aralarında fare kulağı sıkma ile iskemi s...

geçici hipoksi nedeniyle dokuların (reperfüzyon) bir sonraki yeniden oksijenlenme ardından kan akışının (iskemi) tıkanması olduğunda iskemi reperfüzyon hasarı (IRI) oluşur. Deride, iskemi-reperfüzyon (İR) uzun süreli yatak istirahati yaralanma uzun vadeli hastane hasta yatkınlık basınç ülserlerinin patofizyolojisi, katkıda bulunan faktörlerden biri olduğu düşünülmektedir. Bu hastalarda, deri ve alttaki kaslar hem sürekli, tedavi edilmediği takdirde, nekrotik 1 olabilir lokalize yaralanmalarla sonuçlanan, kemikli öne alanları üzerine uygulanan ağırlık basınca maruz kalmaktadır. Bir IRI katılan zarar iki yönlüdür. iskemi sırasında kan damarlarının tıkanması dokulara oksijen dağılımının ciddi bir düşüşe yol açar. Bu hücre metabolizmasında rol oynayan ATPazlar inaktive ATP ve pH, bir azalma ile sonuçlanır. Buna karşılık, hücresel kalsiyum düzeyleri başak ve stresli veya c hasarlıarşın apoptosisi ve nekrosisi 2 geçer. Hücre içi içeriğinin veya hasar ilişkili moleküler desenleri (DAMP) serbest bırakılması, HMGB1 gibi, inflamatuar yanıt 3 katkıda bulunur. İkinci hakaret reperfüzyon sırasında oluşur. oksijen ve pH düzeyleri reperfüzyon sırasında geri edilir olsa da, bu, hücre içi lipidlerin, DNA ve protein oksidasyonuna neden reaktif oksijen türlerinin üretimi (ROS) ile sonuçlanır. Sonuç olarak, pro-enflamatuar medyatörler enflamatuar bölge 2 bağışıklık hücrelerinin alınmasını içeren ikinci bir enflamatuvar yanıtı tetikler olan aktif hale gelir. enflamatuvar yanıta yol açan biyokimyasal olay zincirinin de tarif edilmiş olmakla birlikte, immün hücre faaliyetlerinin uzamsal ve geçici ayarı iyi anlaşılmış değildir. Burada, basit mıknatıs sıkma kullanarak fare kulak cilt üzerinde sağlam bir kızılötesi modeli açıklanmaktadır. multiphoton intravital görüntüleme (MP-IVM) ile birleştiğinde, bizreperfüzyon gerçekleşir sonrasında meydana in vivo enflamatuar yanıtları incelemek için bir model oluşturdu. Bu tekniğin geliştirilmesi ve kullanımı arkasındaki mantığı interstisyel ve infiltre hücreler hem gerçek zamanlı IR nasıl tepki anlamaya çalışmaktır. Onlar immünolojik çalışmalar 4 için az daha ideal hale getirerek, cilt kanadını çelik levha cerrahi implantasyon gerektiren cilt kanadında sıkıştırma tekniğini kullanarak IR mevcut modeller, son derece invaziv. Benzer bir invasif olmayan sıkıştırma tekniği fare deri dış yan yüz 5,6 tarif edilmiştir. O nefes nedeniyle hareketlerini circumvents ve 7,8 görüntüleme sırasında istikrar sunuyor Ancak, bu yöntemde intravital görüntüleme bileşeninin birleşmesinin, bunun yerine, hedeflenen IR sitesi olarak kulak cildi seçti. Ayrıca, interstisyuma kapsayan lökosit alt-gruplar da, kulak, deri ve deri kanadı arasındaki özdeşsayılar ve oranlar biraz 9 değişebilir. Böylece, kulak cilt ideal bir görüntüleme bölgesini temsil eder. Ayrıca, bu IRI modellerden alınan çoğu veri makroskopik değerlendirmeler (ülserlerin derecelendirme) ve son nokta inflamatuar göstergelerin 10 mikroskopik analizler sınırlıdır. Bu modeli kullanarak, bir flüoresan raportör fare deri reperfüzyon sonrası nötrofillerin hücre tepkisinin gerçek zamanlı görsel etkindir. Önceden yayınlanmış intravital kulak görüntüleme modeli ek modifikasyon (Şekil 1, 2) ile 8 kullanılır.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><güçlü>Fare suşları</strong</td></tr><tr><td>>Lysozyme-GFP C57BL/6</td><td>Thomas Graf, Genomik Düzenleme</td><td></td><td></td>Merkezi</tr><tr><td>C57BL/6-C2J</td><td>Jackson Laboratuvarları</td><td>000058</td><td>Cilt görüntüleme için albino Lizozim-GFP oluşturmak üzere Lizozim-GFP ile çaprazlanacak</td></tr><td colspan="4">ReagentsPBS <tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viaflex% 0.9 (ağırlık / hacim) salin</td><td>Baxter Healthcare</td><td>F8B1323</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (100 mg mL ve eksi; 1 ketamin hidroklorür</td><td>Parnell</td><td></td><td>Ketamin kontrollü bir ilaçtır ve ilgili tüm yerel düzenlemelere uyulmalıdır</td></tr><tr><td>Ilium Xylazil-20 (20&nbsp; mg&nbsp; mL ve eksi; 1 ksilazin hidroklorür)</td><td>Troy Laboratories</td><td></td><td>Xylazil-20 kontrollü bir ilaçtır ve ilgili tüm yerel düzenlemelere uyulmalıdır.</td></tr><tr><td>Evans mavisi (10&nbsp; mg&nbsp; mL ve eksi; 1 PBS veya tuzlu suda)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>46160</td><td></td></tr><tr><td>Ultra arıtılmış su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr> <tr><td>İğneli insülin şırıngası</td><td>BD</td><td>328838</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipetleri</td><td>Biologix Araştırma Şirketi</td><td>30-0135</td><td></td></tr><tr><td>3 M kağıt maskeleme bandı</td><td>3M</td><td>2214</td><td></td></tr><tr><td>Deckglaser mikroskop kapak camı (22 mm ve kez; 32 mm)</td><td>Paul Marienfeld</td><td>101112</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli kıymık forseps</td><td>Aesculap, B. Braun Melsungen</td><td>BD312R</td><td></td></tr><tr><td>Veet tüy dökücü krem</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medical pamuk uçlu aplikatörler</td><td>Puritan Medical Products Company</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>C-katlanır havlu</td><td>Kimberly-Clark</td><td>20311</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes hassas görev mendilleri</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Altın kaplama, N42 dereceli neodimyum mıknatıslar, 12 mm çapında ve 2 mm kalınlığında&nbsp;</td><td>first4magnets</td><td>F656S</td><td></td></tr><tr><td>Plastik kılavuz, 10 cm'ye 1,5 cm (polivinil klorür malzeme)</td><td></td><td></td> <td>uzunlamasına ikiye katlayın, maskeleme bandı ve yuva mıknatısı ile</td></tr><tr><td>bağlayın Yüksek vakumlu gres</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Mikroskop</td></tr><tr><td>TriM Scope II tek ışınlı iki fotonlu mikroskop</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ayarlanabilir (680&ndash; 1.080 nm) Tutarlı Chameleon Ultra II Tek Kutu Ti:safir lazer (&ge; 800 nm'de 3,3 W; 140 fs darbe uzunluğu, 80 MHz tekrarlama oranı)</td><td>Tutarlı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Su daldırma hedefleri (20&kez;, NA = 1.0)</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN20xW</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Miscroscope filtre ve ayna setleri (GFP, SHG, Evans Blue görüntüleme için)</td></tr><tr><td>495 uzun geçişli</td><td>Chroma</td><td>T495LPXR</td><td></td></tr><tr><td>560 lomg-pass</td><td>Chroma</td><td>T560LPXR</td><td></td></tr><tr><td>475/42 bant geçişli</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/42-25</td><td></td></tr><tr><td>525/50 bant geçişli</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td></td></tr><tr><td>655/40 bant geçişli</td><td>Chroma</td><td>NC028647</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Cilt görüntüleme aşaması platformu (montaj için şemaya bakın)</güçlü</td></tr><tr><td>>A metal taban plakası (126 mm ve kez; 126 mm ve kez; 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kulak için pirinç bir platform (79 mm ve kez; 19 mm; yanda 1 mm kalınlık, ortada 0,5 mm kalınlık; yarıklı <güçlü>Şekil 1</güçlü>) (1,7 mm ve kez; 1 mm; uzun kenardan 1,5 mm uzakta)İki</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>plastik blok (10 mm yükseklik)&mdash; ısı yalıtımı</td><td></td><td></td><td></td>için</tr><tr><td>Kontrol termistörünü kulak platformuna</td><td></td><td></td><td></td>yerleştirmek için</tr><tr><td>kavisli tutucu DIN konektörlü ve termistörlü arabirim kablosu CC-28, biri sıcaklık kontrolü ve diğeri sıcaklık monitörü için</td> <td>(Warner Instruments (Harvard Aparatı)</td><td>640106</td><td>arabirim kablosunu 35 & derece olarak ayarlanmış her iki dirençli ısıtıcı bloğuna bağlayın; C</td></tr><tr><td>Dirençli ısıtıcı blokları RH-2</td> <td>(Warner Instruments (Harvard Aparatı)</td><td>640274</td><td>Dirençli ısıtıcı blokları, pirinç kulak platformunu 100 ° C'ye kadar ısıtabilir; Dakikalar içinde C. Aşırı ısınmayı önlemek için kontrol termistörünün tutucuya düzgün şekilde sabitlendiğinden emin olun.</td></tr><tr><td>Kulak platformu için sıcaklık kontrolörü TC-344B</td> <td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640101</td><td></td></tr><tr><td>Fare ısıtma yastığı için sıcaklık kontrolörü TR-200</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>21052-00</td><td>Ünite artık satılık değil. Üreticiden alternatifler isteyin</td></tr><tr><td>TR-200 Fine</td><td>Science Tools</td><td>21051-00</td> için güç kaynağı <td>Ünite artık satışta değil. Üreticiden alternatifler isteyin</td></tr><tr><td>Isıtma yastığı</td><td>Fine Science Tools</td><td>21060-00</td><td>Ünite artık satışta değil. Üreticiden alternatifler isteyin.</td></tr><tr><td>Hayvan rektal sondası&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>21060-01</td><td>Ünitesi artık satılmamaktadır. Üreticiden alternatifler isteyin. Rektal probu ve ısıtma yastığını TR-200 sıcaklık kontrol cihazına bağladıktan sonra, sıcaklığı 37 > C</td></tr><tr><td colspan="4">Lamel tutucu</strong</td></tr><tr><td>>2 plastik çubuk, 1 cm çapında, 10 cm uzunluğunda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çubukları yerleştirmek için delikler açılmış 1 plastik adaptör (şemaya bakın)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik çubukları yerinde</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>tutmak için 3 plastik sıkma vidası1 metal plaka, 6 cm x 2,5 cm, 1 ucunda 2 cm kare kesik, kısa kenardan</td><td></td><td></td><td></td>2 mm kenar uzakta</tr><tr><td>Metal plakayı plastik çubuğa</td><td></td><td></td><td></td>takmak için 1 çift somun ve cıvata</tr><tr><td>1 akrilik taban (4 cm x 5 cm x 1,5 cm) manometre ile lamel tutucuyu cilt görüntüleme aşaması platformunda tutmak için. 1 çubuk tabana kalıcı olarak sabitlenmiştir.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Görüntüleme analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Imaris v8.1.2</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bağışıklık yanıtları intravital multiphoton görüntüleme fare kulak skin uyaran İskemi-reperfüzyon yaralanması

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

İskemi-reperfüzyon hasarı (IRI), kan akışının tıkanması (iskemi) ve ardından dokuların yeniden oksijenlenmesi (reperfüzyon) nedeniyle geçici hipoksi olduğunda ortaya çıkar. Deride, iskemi-reperfüzyon (IR), basınç ülserlerinin patofizyolojisine katkıda bulunan ana faktördür. Enflamatuar yanıta yol açan olaylar dizisi iyi çalışılmış olsa da, bağışıklık hücrelerinin farklı alt kümelerinin bir IR hasarına mekansal ve zamansal tepkileri iyi anlaşılmamıştır. Deri kanadında klempleme tekniğini kullanan mevcut IR modelleri oldukça invazivdir ve yaralanmaya karşı bağışıklık tepkilerini incelemek için uygun değildir, cilt kanadındaki benzer non-invaziv mıknatıs klempleme çalışmaları intravital görüntüleme çalışmaları için ideal değildir. Bu protokolde, multifoton intravital görüntüleme (MP-IVM) yoluyla reperfüzyon sonrası bağışıklık hücrelerinin hücresel tepkisini gerçek zamanlı olarak görselleştirmeyi amaçladığımız, fare kulak derisi üzerinde geliştirilen sağlam bir non-invaziv IR modelini tanımlıyoruz.

Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi bu protokol, özel bir dahili kulak cilt görüntüleme platformu kullanıyor. Bu platformun çeşitli özellikler, özellikle fizyolojik ayarları koruyarak görüntüleme kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. ısıtmalı pirinç platformda kulak yerleştirilmesi sadece 35 ° C&#39;lik bir fizyolojik sıcaklıkta kulağı tutar, ama aynı zamanda nefes nedeniyle kaçınılmaz hareketlerinden kulak izole eder. pirinç platformunda bir metal klibin eklenmesi ve böylece...

Bu protokol mıknatıs sıkma kullanarak fare kulak cilt üzerinde bir iskemi-reperfüzyon (İR) modeli indüksiyon açıklar. Özel bir dahili Intravital görüntüleme modeli kullanarak, in vivo inflamatuvar yanıt sonrası reperfüzyon eğitim. Bu tekniğin gelişiminin arkasındaki mantık lökosit cilt IR hasarı nasıl cevap anlayışı yaygınlaştırmaktır.

Bağışıklık Yanıtları intravital multiphoton Görüntüleme Fare Kulak Skin uyaran İskemi-reperfüzyon yaralanması

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Bu deneyin genel amacı, fare kulak derisinin intravital multiphoton görüntülemesi aracılığıyla bağışıklık hücrelerinin iskemi reperfüzyona nasıl yanıt verdiğini anlamaktır. Bu yöntem, bağışıklık hücrelerinin dinamik davranışını anlamak için İmmünoloji ve Dermatoloji alanındaki bazı çok önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, enflame veya dinlenme durumundaki ciltte hücresel aktiviteleri incelemek için sağlam bir görüntüleme modeli sunmasıdır.Bu yöntem iskemik reperfüzyon hasarları hakkında bilgi sağlayabilse de, aynı zamanda aşırı duyarlılık reaksiyonları ve enfeksiyonlar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, hazırlık süreci boyunca vücut sıcaklığını 37 °C'de tutmak amacıyla fareyi bir ısıtıcı ped üzerine yerleştirin. Anestezinin derinliğini, ayak parmağı sıkıştırma refleksinin yokluğu ile doğrulayın.Ardından, anestezi altındayken kurumayı önlemek için hayvanın gözlerine oftalmik lubrikant uygulayın. Sonrasında, dorsal kulağın üst üçte ikisine dikkatlice depilatuar krem sürün ve iki ila üç dakika bekleyin. Daha sonra, kremi ıslak pamuklu çubuklar kullanarak titiz ama nazik bir şekilde temizleyin.Şimdi, neodimyum m

inducing-ischemia-reperfusion-injury-mouse-ear-skin-for-intravital

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, bir fare modelinde trombüs oluşumunu incelemek için intravital floresan mikroskobu tekniğini göstermektedir. Fareye, kan dolaşımını izlemek için florofor etiketli bir polisakkarit enjekte edilir. Yüksek yoğunluklu bir ışıkla aydınlatıldıktan sonra, kulağın mikro damar sistemindeki bir yaralanmanın fototoksik indüksiyonu, kan akışındaki tıkanıklığın görselleştirilmesiyle doğrulanan bir trombüs oluşumuna yol açar.

Mikrovasküler Trombüs oluşumunu incelemek için intravital floresan mikroskobu

Hücre dışı matris yara iyileşmesi, iltihap ve kanser gelişimi sürecinde önemli bir yeniden şekil alır. Biz lifimsi dinamiklerinin yanı sıra Epifloresans veya iki-foton mikroskopi kullanılarak yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip örgü benzeri matris bileşenleri görselleştirmek için yeni bir Intravital immunofloresan mikroskopi yaklaşım sunmak.

Epifluoresan ile Doku Matrix Bileşenler ve İki foton Mikroskopi uzun vadeli Intravital İmmünofloresan Görüntüleme

enflamasyon bölgelerinde CD4 efektör T hücrelerinin geçiş motilite yöneten mekanizma nispeten bilinmemektedir. Biz görselleştirmek ve yerinde bu hücrelerin dinamik davranışının çalışması için izin iltihaplı kulak dermiş in vitro -astarlı CD4 T hücrelerinde işlemek için non-invaziv bir yaklaşım sunuyoruz.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

Bu mevcut protokol, canlı hayvanlarda nötrofil hazırlamanın dinamik sürecinin izlenmesini sağlamak için floresan raportörler, in vivo etiketleme ve intravital görüntüleme teknikleri kullanır.

IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme

Tüysüz SKH1-Hr hr fare kulak modeli incelendiğinde mikrovasküler yatakta önce cerrahi hazırlık yapmadan mikrosirkülasyonun ve fototoksik trombüs indüksiyon Intravital floresan mikroskopisi sağlar. Bu nedenle, tüysüz fare kulak mikrovasküler trombus oluşumu, trombüs evrimi ve tromboliz sırasında karmaşık etkileşimleri incelemek için in vivo model bir mükemmeldir.

Bir Tüysüz fare kulak memesi içinde intravital Mikroskopi ve trombüs İndüksiyon

Bir roman cerrahi protokol İki fotonlu görüntüleme en az invaze olan canlı fare karaciğer için kurduk. Bu teknik ile karaciğer detaylı yapısını lipopolysaccharide kaynaklı endotoksemi sırasında tespit. Biz bu yöntemi hepatik lökosit göç için çeşitli reaktifler tedavinin etkinliğini belirlemek için kullanılması gereken tahmin.

İki fotonlu Lipopolysaccharide tedavi fare karaciğer bağışıklık yanıtında sırasında lökositlerin Intravital görüntüleme

İn vivo görüntüleme, sağlık ve hastalıkta biyoloji çalışmaları için güçlü bir araçtır. Bu protokol, standart iki foton mikroskobu ile fare retinasının transpupiller görüntülemesini tanımlar. Ayrıca, retinanın birden fazla hücresel kohortunu floresan olarak etiketlemek için farklı in vivoimaging yöntemleri göstermektedir.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.

Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Nötrofil göçü, kemoatraktana ve hücre dışı mikro çevre ile etkileşimlerine yanıt olarak plazma zarının hızlı ve sürekli olarak yeniden şekillenmesine dayanır. Burada açıklanan, anestezi uygulanmış farelerin kulağına enjekte edilen nötrofillerde zar yeniden şekillenmesinin dinamiğini araştırmak için İntravital Hücre Altı Mikroskobuna dayalı bir prosedürdür.

Fizyolojik Koşullar Altında Hücre Altı Membran Yeniden Şekillenmesini Araştırmak için Fare Derisinde Nötrofil Migrasyonunun Görüntülenmesi

Protokol, ters konfokal mikroskopi kullanarak intravital görüntülemeyi basitleştirmek için yeni bir araç sunar.

Epitel Doku Dinamiğinin İnverted Konfokal Mikroskopta Uzun Süreli İzlenmesi için Kolaylaştırılmış İntravital Görüntüleme Yaklaşımı

Bu çalışma, farelerin ön pençe derisindeki düşük eşikli mekanoreseptör (LTMR) akson terminallerinin görselleştirilmesi için in vivo iki fotonlu görüntüleme yaklaşımını sunmaktadır. Bireysel aksonların tekrarlanan, yüksek çözünürlüklü görüntülemesi kullanılarak, bu yöntem gelişim sırasında ve yetişkinlerde deri duyusal devresinin yapısı ve işlevini incelemek için yeni bir platform sağlar.

Fare Derisindeki Dokunma Duyusal Akson Morfolojisinin İntravital İki Fotonlu Görüntülemesi

Öğrenin fare kulak derisinde iskemi-reperfüzyon yaralanmasını intravital multiphoton görüntüleme ile incelemeyi. Bu yöntem bağışıklık hücrelerinin dinamik davranışlarını canlı ortamda gözlemlemeyi sağlar.

Bağışıklık Yanıtları intravital multiphoton Görüntüleme Fare Kulak Skin uyaran İskemi-reperfüzyon yaralanması

Daha fazla video keşfet