Bağışıklık Yanıtları intravital multiphoton Görüntüleme Fare Kulak Skin uyaran İskemi-reperfüzyon yaralanması

Bu deneyin genel amacı, fare kulak derisinin intravital multifoton görüntülemesi yoluyla bağışıklık hücrelerinin iskemi reperfüzyonuna nasıl tepki verdiğini anlamaktır. Bu yöntem, bağışıklık hücresinin dinamik davranışını anlamak için İmmünoloji ve Dermatoloji alanındaki çok önemli soruların bazılarının ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, iltihaplı veya dinlenme durumundaki ciltteki hücresel aktiviteleri incelemek için sağlam bir görüntüleme modeli sağlamasıdır.

Bu yöntem iskemik reperfüzyon yaralanmaları hakkında bilgi sağlayabilse de, bu, enfeksiyonların yanı sıra aşırı duyarlılık reaksiyonları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, hazırlama prosedürü boyunca vücut ısısını 37 santigrat derecede tutmak için fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Ayak parmağı sıkıştırma refleksinin yokluğuyla anestezi derinliğini onaylayın.

Daha sonra, anestezi altındayken kuruluğu önlemek için hayvanın gözlerine oftalmik kayganlaştırıcı sürün. Daha sonra, tüy dökücü kremi sırt kulağının üst üçte ikisine dikkatlice uygulayın ve iki ila üç dakika bekleyin. Ardından, ıslak pamuklu uçlu aplikatörleri kullanarak kremayı kapsamlı ama nazik bir şekilde çıkarın.

Şimdi, neodimyum mıknatısları kullanarak fare kulak derisinde iskemi indükleyin. Bunu yapmak için önce mıknatısları kendi plastik kılavuzlarına yerleştirin. Bir mıknatısı, kulak mıknatıs üzerinde düz bir şekilde dururken kulağın ventral tarafının altına yerleştirilmesi gereken ikinci bir ventral mıknatıs ile yalnızca kenarı temas edecek şekilde konumlandırın.

Hazır olduğunda, mıknatısların dikkatlice bir araya gelmesine izin verin. 1,5 saatlik iskemiden sonra, plastik kılavuzları kullanarak mıknatısları birbirinden uzağa çevirerek çıkarın ve reperfüzyonun gerçekleşmesine izin verin. Mıknatısın çıkarılmasından hemen sonra, Evans Blue veya tercih edilen başka bir kan damarı etiketleme maddesini intravenöz olarak uygulayın.

Bu adımda, iki parça maskeleme bandı kesin. Genişliği boyunca yaklaşık bir milimetre yapıştırıcı bırakırken yapışkan kenarların birbirine yapışmasına izin verin. Ardından, kulak platformundaki yarık içine yerleştirilmesi için maskeleme bandını ikiye bölün.

Bu maskeleme bandını, yapışkan tarafı yukarı bakacak şekilde yarığın yaklaşık yarısına kadar yerleştirin. Bundan sonra, fareyi, görüntülenecek kulak maskeleme bandı şeridinin yanında olacak şekilde ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. İki PBS nemli pamuklu uç aplikatörü kullanarak kulağı yapışkan şeride hafifçe bastırın.

Şeridi kılavuz olarak kullanarak, fareyi sahneye yaklaştırırken aynı anda fare kulağını yarıktan geçirin. Kulak derisi çok hassas olduğundan, hazırlığa bağlı herhangi bir yaralanmayı önlemek için bu adım çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Yapışkan bandı çıkarmak için, bandın yapışkanlığını azaltmak için önce bir damla PBS ekleyin.

Ardından, ince bir boya fırçası kullanarak fare kulağını maskeleme bandından mümkün olduğunca nazikçe ayırın. Nemli bir pamuk uçlu aplikatörü kulağın üzerine nazikçe yuvarlayarak kulağı kulak platformuna doğru düzleştirin. Daha sonra, lamel altına bir damla PBS damlatın ve nazikçe kulağın üzerine yerleştirin.

Daha sonra, rektal sıcaklık probunu takın ve kabloları üreticinin talimatlarına göre ısıtma sistemine bağlayın. Görüntü elde etmek için hayvanı çoklu foton mikroskobunun altına yerleştirin. Büyük Evans Blue sızıntısı ile karakterize edilen iskeminin kenarına yakın bir görüntüleme bölgesi ile başlayın.

Buradaki şematik diyagram mıknatısların konumunu göstermektedir. Bu iki fotoğraf, mıknatıs kenetlenmesinden sonra bir pre-iskemik ve bir post-iskemik kulağı göstermektedir. Kulağın bu şemasında, mıknatısın yerleştirildiği yere göre görüntülenen bölge gösterilir.

Maksimum projeksiyonun bu hızlandırılmış sekansı, 1.5 saatlik iskemi sonrası LysM-eGFPM albino fare kulak derisindeki reperfüzyona yanıt olarak nötrofil infiltrasyonunu gösterir. Daha önceki zaman noktalarında, Evans Blue sinyalinin olmaması, iskemi sonrası geçici damar tıkanıklığını gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, görüntüleme için iskemik reperfüze kulak hazırlıkları, uygun şekilde yapılırsa 30 dakikadan daha kısa sürede yapılabilir.

Bu işlemi gerçekleştirirken, anestezi derinliğini ve farenin sıcaklığını sürekli kontrol etmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücresel lokalizasyonların genel bir görünümüne sahip olmak için fare kulak derisinin tüm fare boyaması gibi başka bir yöntem de gerçekleştirilebilir. Bu protokoldeki gelişmelerden sonra, İmmünoloji ve Dermatoloji alanındaki araştırmacıların fare kulak derisinde doğuştan gelen bağışıklığı keşfetmesinin önünü açmıştır.

Bu videoları izledikten sonra, iskemik reperfüzyon hasarını incelemek için bir fare kulağı derisi görüntüleme modelinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Çoklu foto mikroskopla çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Ve lazer güvenliği eğitimi gibi önlemler alınmalıdır.