Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

Bu protokolün genel amacı, belirli bir hedefin alternatif eklemesini özel olarak manipüle edebilen yapay birleştirme faktörleri tasarlamaktır. Bu yöntem, kanser hücrelerinde alternatif eklemenin düzenlenmesi ve yanlış düzenlenmesi gibi RNA işleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı esnekliğidir.

Herhangi bir gende farklı türde alternatif eklemeleri teşvik eden veya inhibe eden yapay faktörler tasarlayabiliriz. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımın bir araştırma görevlisi olan Huan-Huan ve laboratuvarımda bir doktora sonrası olan Qianyun olacak. Vahşi tip PUF DNA, özelleştirilmiş PUF alan iskelesini oluşturmak için bir şablon olarak kullanılır.

Her pozisyonda farklı RNA nükleotidlerini spesifik olarak tanıyan PUF dizileri içeren PCR primerleri kullanın. Her PUF tekrarı için, her pozisyonda farklı bir tabanı tanımak için dört farklı astar kullanın. Birinci tur PCR'de, dört PUF tekrarı, evrensel köprü parçaları ve kapak parçaları için kodlama dizileri oluşturmak için gösterilen primer çiftlerini kullanın.

İkinci turda, son adımda oluşturulan PCR ürünlerini, R-bir ila R-dört ve R-beş ila R-sekiz RNA tanıma kodları için kodlama dizileri oluşturmak üzere gösterilen primer kombinasyonları ile şablonlar olarak kullanın. Üçüncü turda, R-one ila R-sekiz için kapaksız kodlama dizileri oluşturmak için R-one ileri astar ve R-sekiz ters astar ile ikinci turdaki ürünleri ve köprü dört ila beşi şablon olarak kullanın. Dördüncü tur PCR'de, eksiksiz PUF alanları için kodlama dizileri oluşturmak için şablon olarak R-bir ila R-sekiz, beş asal uç başlık ve üç asal uç başlık kullanın.

HEK-293T hücrelerinin transfeksiyonuna başlamak için, şişeleri hafifçe ters çevirerek lipozomal transfeksiyon reaktifini karıştırın. Daha sonra iki mikrolitre lipozomal transfeksiyon reaktifini, transfeksiyon başına 50 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında seyreltin. Yavaşça karıştırın ve ardından oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Daha sonra, steril bir tüpte 50 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında 04 mikrogram glisin açısından zengin alan ekspresyon vektörünü ve 0.2 mikrogram modüler birleştirme raportör plazmitini seyreltin. Daha sonra 0.4 mikrogram RS-efektör alan ekspresyon vektörünü ve 0.2 mikrogram PGZ-üç raportör plazmitini 50 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında seyreltin. Son olarak, 0.4 mikrogram PGL-RS-PUF ekspresyon vektörünü ve 0.2 mikrogram PEZ-1B veya PEZ-2F raportör plazmitlerini steril bir tüpte 50 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında seyreltin.

Oda sıcaklığında beş dakikalık inkübasyondan sonra, seyreltilmiş lipozomal transfeksiyon reaktifini seyreltilmiş plazmit karışımları ile hafifçe karıştırın. Son karışımları oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, ekspresyon vektörlerini içeren transfeksiyon karışımlarını, HEK-293 hücreleri ile tohumlanmış 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna ekleyin ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatörde en az 12 saat inkübe edin.

12 saatlik inkübasyondan sonra, transfekte edilmiş hücreleri tripsinizasyon ve santrifüjleme ile hasat edin. Santrifüjlemeden sonra, ortamı atın ve tüp başına 0,5 mililitre RNA ekstraksiyon tamponu ekleyin. Her numuneye 0,5 mililitre RNA ekstraksiyon tamponu başına 0,1 mililitre kloroform ekleyin.

İnkübasyonun ardından, tüpleri 12.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Ardından sulu tabanı yeni bir tüpe aktarın. İlk homojenizasyonda kullanılan 0,5 mililitre RNA ekstraksiyon tamponu başına 0,25 mililitre izopropanol ekleyin.

Girdap yaparak karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha önce olduğu gibi bir santrifüjlemeden sonra, RNA çökeltisi genellikle tüpün dibinde görülür. Süpernatanı atın ve RNA peletini 0,5 mililitre RNA ekstraksiyon tamponu başına 0,5 mililitre %75 etanol ile yıkayın.

Kuvvetlice girdap yapın ve daha sonra dört santigrat derecede beş dakika boyunca 7.500 kez G'de santrifüjleyin. Döndürmeden sonra, süpernatanı çıkarın ve RNA peletlerini havayla kurutun. RNA'ları 50 mikrolitre RNaz içermeyen suda çözün.

Daha sonra, her 50 mikrolitrelik RNA çözeltisine mikrolitre DNase-bir, yedi mikrolitre 10X tampon ve 11 mikrolitre su başına beş birimden iki mikrolitre ekleyin. İnkübasyondan sonra, DNaz'ı etkisiz hale getirmek için çözeltileri 15 dakika boyunca 70 santigrat dereceye ısıtın. Her numuneden cDNA sentezlemek için bir ters transkriptaz reaksiyonu gerçekleştirdikten sonra, PCR reaksiyonu etiketli vücudun bileşenlerini ekranda gösterilen sırayla PCR tüplerine ekleyin.

Numune başına bir reaksiyon hazırlayın. Termal döngüleyici üzerinde RT-PCR programını çalıştırın. Son olarak, PCR ürünlerini TBE tamponlu %10'luk bir poliakrilamid jel aracılığıyla elektroforez yoluyla çözün.

Ürünleri görselleştirmek için bir floresan tarayıcı kullanın ve dansitometri yazılımı kullanarak eklenen her bir izoformun miktarını ölçün. Apoptozu ölçmek için immünofloresan testi için, daha önce gösterildiği gibi glisin açısından zengin alan ekspresyon plazmitleri içeren bir transfeksiyon karışımı hazırlayın ve altı oyuklu bir plakada polilisin kaplı cam örtü kızakları üzerinde büyütülen HeLa hücrelerini transfekte edin. Transfeksiyondan 24 saat sonra, hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1x PBS'de bir mililitre% 4 paraformaldehit ile kapak kızaklarına sabitleyin.

Ardından, kapak fişlerindeki hücreleri iki mililitre 1x PBS ile beş dakika boyunca nazikçe yıkayın. Daha sonra, hücreleri 10 dakika boyunca 1x PBS'de% 0.2 Triton X-100 ile geçirgen hale getirin. Daha önce olduğu gibi 1x PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, 1x PBS'de% 3 sığır serum albümini ile 10 dakika boyunca spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin.

PBS'de% 3 BSA'da bayrak antikorunu bir ila 1.000 oranında seyreltin ve seyreltilmiş bayrak antikorunun 30 mikrolitresini parafilm tabakasına pipetleyin. Bir kapak fişini çıkarmak için forseps kullanın. Fazla tamponu laboratuvar mendilleriyle dikkatlice kurulayın ve ardından kapak kayma hücresini aşağı bakacak şekilde bayrak önleyici solüsyonun üzerine yerleştirin.

Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, çözeltinin üzerinde yüzene kadar kapak kaymasının hücre tarafına yaklaşık 500 mikrolitre 1x PBS ekleyin. Kuyucuklarda 1x PBS ile altı kuyulu plakaya geri koyun.

Daha önce olduğu gibi parafilm üzerinde ikincil antikor ile 15 dakika inkübe edin. Daha önce olduğu gibi yıkayın ve ardından lamel kızakları DAPI içeren montaj ortamı kullanarak mikroskop slaytlarına monte edin. Hücreleri bir floresan mikroskobu kullanarak görselleştirin ve bir dijital kamera kullanarak fotoğraflayın.

İmmünofloresan mikroskobu kullanılarak, Gly-PUF-531'i eksprese eden birçok hücre, apoptoz geçirdiklerini gösteren parçalanmış nükleer DNA'ya sahipti. Bir kontrol olarak, Gly-PUF vahşi tipini eksprese eden hücreler, Gly-PUF-531 transfekte edilmiş hücrelere kıyasla daha az parçalanmış nükleer DNA'ya sahipti. Burada, DAPI ile boyanmış hücrelerle birleştirilmiş anti-bayrak antikorunu kullanan immünofloresan mikroskobu, Gly-PUF-531'in ağırlıklı olarak transfekte edilmiş hücrelerin çekirdeklerinde lokalize olduğunu göstermektedir.

Gly-PUF vahşi tipi ayrıca transfekte edilmiş hücrelerin çekirdeklerinde lokalize edilmiştir, bu da tam eklenmiş mRNA'lar sitoplazmaya taşındığında bu ESF'lerin hedeflerinden ayrıldığını düşündürür. Parçalanmış nükleer DNA'ya sahip apoptotik hücrelerin yüzdesi, rastgele seçilen floresan mikroskobu görüntü alanlarından ölçüldü. Bir kez ustalaştıktan sonra, RNA bağlanma özgüllüğüne sahip PUF iskelelerinin yapımı, uygun şekilde yapılırsa iki gün içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, yapay faktörleri tasarlayarak insan hücrelerinde alternatif eklemenin özel olarak nasıl manipüle edileceğini iyi anlamalısınız.