Name: Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Keşfedin yapay bağlantı faktörleri mühendisliği ile insan hücrelerinde alternatif bağlantı işleme yöntemini. Bu esnek teknik, RNA metabolizması ve kanser hücrelerindeki gen düzenlemesi araştırmalarına yeni kapılar açar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NIH hibe R01-CA158283 tarafından desteklendi ve NSWB, ZWYW için 31400726 no&#39;lu hibe, Genç Bin Talent Programı ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından finanse edildi (hibe 31471235 ve 81422038). XY, Çin&#39;in doktora sonrası bilim kurumu (2015M571612) tarafından finanse edilmektedir.

<ol><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li>
<li>Wang, Z., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+regulation%3A+from+a+parts+list+of+regulatory+elements+to+an+integrated+splicing+code%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code.</a> Rna. 14 (5), 802-813 (2008).</li>
<li>Matera, A. G., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+day+in+the+life+of+the+spliceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A day in the life of the spliceosome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).</li>
<li>Singh, R. K., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-mRNA+splicing+in+disease+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics.</a> Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).</li>
<li>Wang, G. -S., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+in+disease%3A+disruption+of+the+splicing+code+and+the+decoding+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery.</a> Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).</li>
<li>Li, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+splicing+is+a+primary+link+between+genetic+variation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease.</a> Science. 352 (6285), 600-604 (2016).</li>
<li>Scotti, M. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mis-splicing+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA mis-splicing in disease.</a> Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).</li>
<li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).</li>
<li>Graveley, B. R., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine%2Fserine-rich+domains+of+SR+proteins+can+function+as+activators+of+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+cell%22%5BJournal%5D)">Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing.</a> Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).</li>
<li>Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hnRNP+A1+recruited+to+an+exon+in+vivo+can+function+as+an+exon+splicing+silencer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).</li>
<li>Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+binding+of+single-stranded+RNA%3A+is+there+a+code+for+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition.</a> Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).</li>
<li>Dong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+modular+binding+code+for+cytosine+recognition+in+Pumilio%2FFBF+%28PUF%29+RNA-binding+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains.</a> J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).</li>
<li>Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+code+for+RNA+recognition+by+PUF+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A universal code for RNA recognition by PUF proteins.</a> Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).</li>
<li>Wei, H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA-binding+proteins+with+diverse+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA-binding proteins with diverse activities.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+splicing+factors+with+designed+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering splicing factors with designed specificities.</a> Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).</li>
<li>Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA+endonucleases+with+customized+sequence+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities.</a> Nat Commun. 3, 1147(2012).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+network+of+factors+with+overlapping+affinities+represses+splicing+through+intronic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).</li>
<li>McCabe, B. C., Gollnick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+levels+of+trp+RNA-binding+attenuation+protein+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).</li>
<li>Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+splicing+enhancers%2C+cognate+splicing+factors+and+context-dependent+regulation+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).</li>
<li>Choudhury, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+splicing+activator+DAZAP1+integrates+splicing+control+into+MEK%2FErk-regulated+cell+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
<li>Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coevolutionary+networks+of+splicing+cis-regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+and+specific+functions+of+exonic+splicing+silencers+in+splicing+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control.</a> Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031(2012).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).</li>
<li>Venables, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+and+alternative+splicing+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant and alternative splicing in cancer.</a> Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).</li>
<li>Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+translational+regulation+using+the+PUF+protein+family+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).</li>
<li>He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+view+of+cancer-specific+transcript+variants+by+subtractive+transcriptome-wide+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis.</a> PloS one. 4 (3), 4732(2009).</li>
<li>Venables, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+alternative+splicing+markers+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of alternative splicing markers for breast cancer.</a> Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).</li>
<li>Shapiro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+EMT-Driven+Alternative+Splicing+Program+Occurs+in+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer.</a> PLoS Genet. 7 (8), 1002218(2011).</li>
<li>David, C. J., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+pre-mRNA+splicing+regulation+in+cancer%3A+pathways+and+programs+unhinged%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged.</a> Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).</li>
<li>Ladomery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+alternative+splicing+is+another+hallmark+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+biol%22%5BJournal%5D)">Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer.</a> Int J Cell biol. 2013, (2013).</li>
<li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2%2FASF+is+a+proto-oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).</li>
<li>Anczukòw, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRSF1-regulated+alternative+splicing+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+cell%22%5BJournal%5D)">SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer.</a> Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu rapor özellikle bir hedef genin alternatif eklemeler işleyebilirsiniz yapay ekleme faktörlerinin tasarımı ve inşası için ayrıntılı bir açıklama sağlar. Bu yöntem, özel bir özgüllüğü olan bir RNA bağlayıcı iskeleti oluşturmak için tekrar PUF eşsiz RNA bağlanma modu yararlanır. Ya etkinleştirmek veya yapıştırma bastırmak için kullanılabilir. Bu protokol dahilinde kritik safha ESFs spesifikliğini tanımlayan reprogramed PUF etki oluşturulmasıdır. Bir PCR dikiş protokolü geliştirildi ve PUF is...

En çok insan genleri Alternatif Ekleme (AS), büyük ölçüde genom 1, 2 kodlama karmaşıklığı artmıştır farklı faaliyetleri ile birden fazla izoformu üretmek için tabi tutulur. AS gen fonksiyonunu düzenleyen önemli bir mekanizma sağlar ve sıkıca farklı hücresel ve gelişimsel aşamalarda 3, 4 de farklı yollar aracılığıyla düzenlenir. Ekleme düzen bozukluğu insan hastalığı 5, 6, 7, 8 ortak bir nedenidir olduğundan, ekleme düzenleme hedefleyen çekici bir terapötik yol haline geliyor. Esas olarak birleştirme arttırıcılar ya da alternatif eksonların susturucu işlevi ön mRNA&#39;da -elemanları sis Ekleme Düzenleme (SRE&#39;ler) tarafından kontrol edilir, AS birleştirme düzenlemenin basitleştirilmiş bir modeline göre. thEse SRE , ekleme reaksiyonunu 3,9 destekleyen veya bastıran çeşitli trans- aktive protein faktörlerini ( yani splicing faktörleri) özellikle işe alır. Çoğu trans- aktive edici ekleme faktörü, splicing&#39;i kontrol etmek için hedeflerini ve efektör alanlarını tanımak için ayrı diziye özgü RNA bağlama alanlarına sahiptir. En iyi bilinen örnekler, ekson ekleme arttırıcıları bağlayan N-terminal RNA Tanıma Motifleri (RRM&#39;ler) ve ekson içeriğini teşvik eden C-terminal RS alanlarını içeren serin / arginin açısından zengin (SR) protein ailesinin üyeleridir . Tersine, hnRNP A1, RRM alanları vasıtasıyla eksonik ekleme susturucularına bağlanır ve bir C-terminali glisin bakımından zengindir domain 11 aracılığıyla ekson içerilmesini engeller. Bu gibi modüler yapılandırmaları kullanarak, araştırmacılar, farklı etki ile belirli bir RNA-Bağlama Alanı (RBD) birleştirerek yapay ekleme faktörleri mühendisliği yapabilmelidirBağlamayı etkinleştiren veya engelleyen alanlar. Böyle bir tasarımın anahtarı, TALE alanının DNA bağlama moduna benzer programlanabilir RNA bağlanma özgünlüğü ile verilen hedefleri tanıyan bir RBD kullanmaktır. Bununla birlikte, çoğu yerli birleştirme faktörü, zayıf afiniteli kısa RNA elementlerini tanıyan RRM veya K Homology (KH) alanlarını içerir ve dolayısıyla bir &quot;RNA-protein&quot; tanıma koduna sahip değildir12. PUF tekrar proteinlerinin RBD&#39;si ( yani PUF alanı), farklı RNA hedeflerini 13 , 14&#39;ü özel olarak tanıması için PUF alanlarının yeniden tasarımına izin veren benzersiz bir RNA tanıma moduna sahiptir. Kanonik PUF alanı, her biri 8 nt&#39;lik bir RNA hedefinde tek bir tabanı tanıyan sekiz tekrarlar içeren üç α-heliks içerir. İkinci α-sarmalın belirli pozisyonlarındaki amino asitlerin yan zincirleri t nin Watson-Crick kenarı ile spesifik hidrojen bağı oluştururo, her tekrarında (Şekil 1A) RNA bağlanma özgüllüğünü belirleyen temel RNA. PUF tekrar RNA baz tanıması için kod olası 8-baz kombinasyonu (Wei ve Wang 15 tarafından incelenmiştir) tanıyan PUF alan üretimi için izin, (Şekil 1A) şaşırtıcı derecede basittir. Bu modüler tasarım, ilke, özel PUF etki alanı ve bir ekleme modülasyon alan (yani, bir SR alanı ya da bir Gly-zengini domenindeki) oluşan bir Engineered Ekleme Faktörü (ESF) oluşturulmasına olanak sağlar. Bu ESFs ya birleştirme aktivatörleri olarak ya da ekleme olayların çeşitli kontrol etmek için inhibitörleri olarak işlev görebildikleri ve araçlar insan hastalığı 16, 17 ile ilgili endojen genin eklenmesini işlemek için bu da yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bir örnek olarak, spesifik olarak, BCL-X&#39;e geninin yapıştırma değiştirmek için PUF-Gly-tipi ESFs oluşturduk, Anti-apoptotik uzun izoformu (Bcl-xL) pro-apoptotik kısa izoforma (Bcl-xS) dönüştürmek. Bcl-x izoform oranının değiştirilmesi, birçok kanserli hücrenin çoklu anti-kanser kemoterapi ilaçlarına duyarlı hale getirilmesi için yeterliydi16, bu yapay faktörlerin potansiyel terapötik reaktifler olarak yararlı olabileceğini düşündürüyordu. Bilinen ekleme efektör alanlarıyla ( örneğin, bir RS veya Gly-zengin alan) yapıştırmayı kontrol etmeye ek olarak, yeni ekleme faktörlerinin aktivitelerini incelemek için mühendislik PUF faktörleri de kullanılabilir. Örneğin, bu yaklaşımı kullanarak, birkaç SR proteininin C-terminal alanının, farklı pre-mRNA bölgelerine 18 bağlandığında splicing&#39;i aktive edebileceğini veya inhibe edebildiğini, RBM4&#39;ün alanin açısından zengin motifinin ekleme 19&#39;u engelleyebileceğini ve DAZAP1&#39;in prolin açısından zengin motifi, eklemeyi artırabilir 20 , 21 &lt;/ Sup&gt;. Bu yeni işlevsel alanlar, eklemeyi ince ayar yapmak için ek yapay faktörler türlerini oluşturmak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>PCR tamponlu yüksek kaliteli DNA polimeraz (Phusion High-Fidelity)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>DNA ligaz (T4 DNA ligaz)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Lipozomal transfeksiyon reaktifi (Lipofektamin 2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>İndirgenmiş serum ortamı (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>RNA ekstraksiyon tamponu (TRIzol Reaktifi)</td><td>ambion</td><td>15596018</td><td>TRIzol reaktifi, yanıklara neden olabilen fenol içerir. </td></tr><tr><td>PBS (1x)</td> ile çalışırken eldiven giyin<td>: Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Ters Transkriptaz (RT)</td><td>İnvitrojen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Kaspaz-3 antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>9668</td><td></td></tr><tr><td>PARP antikoru</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>9542</td><td></td></tr><tr><td>Bcl-x antikoru</td><td>BD Bioscience</td><td>610211</td><td></td></tr><tr><td>beta-aktin antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>alfa-tubulin antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>FLAG antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4042</td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz membran</td><td>Amersham-Pharmacia</td><td>RPN203D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting tespit reaktifleri</td><td>Invitrogen</td><td>WP20005</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-dCTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA55021</td><td></td></tr><tr><td>Floresanla Aktive Edilen Hücre Sıralayıcı (FACS)</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta (DMEM)</td> <td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>İnvitrojen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Propidyum iyodür (PI)</td> <td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A7638-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-4832</td><td>Filtre-sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Vektör pWPXLd</td><td>Addgene</td><td>12258</td><td></td></tr><tr><td>Vektör pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Vektör psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNaz içermez)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)18 Primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO131&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare ikincil antikoru (Anti-fare IgG, HRP'ye bağlı Antikor)</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>7076S</td><td></td></tr></tbody></table>

yapay faktörler mühendislik Özellikle İnsan hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Birçok ökaryotik RNA işleme, özellikle ön-mRNA hedef ve efektör alanına bağlanan bir RNA tanıma modülü, aşağıdakileri içeren modüler bir konfigürasyonları ile Proteins (RBPS) bağlanması RNA aracılık eder. Daha önce, bir RNA metabolizmasını değiştirmek için çeşitli yapay RBPS dizayn etmek için kullanılan bir programlanabilir RNA bağlayıcı iskeleti oluşturmak için insan pumilio 1 PUF alan eşsiz bir RNA bağlanma modu yararlanmaktadır. Burada detaylı bir protokol, spesifik olarak hedef genin alternatif eklemeler modüle etmek üzere tasarlanmış Engineered Ekleme faktörler (ESFs) oluşturmak için tarif edilmektedir. protokol tasarım ve nasıl bir tasarımcı PUF alanını ve bir efektör alan eritme ve nasıl hedef genlerin yapıştırma işlemek için ESFs kullanımı ile bir ESF sentezleme plasmidini inşa etmek üzere özel bir RNA hedefi, için özel bir PUF iskele inşa etmek için de içerir. Bu yöntemin temsili sonuçlar, aynı zamanda yaygın deneyleri tanımlamışlardırEkstraksiyon raportörlerini kullanarak ESF faaliyetlerinin, kültürlenmiş insan hücrelerinde ESF&#39;nin uygulanması ve müteakip ekleme etkisi değişir. Bu rapordaki ayrıntılı protokolleri izleyerek, splicing düzenlemesini ve farklı splicing izoformlarının fonksiyonunu incelemek için yeni bir strateji sağlayarak, farklı Alternatif Ekleme (AS) tiplerinin düzenlenmesi için ESF&#39;ler tasarlamak ve üretmek mümkündür. Üstelik, farklı işlev alanlarını tasarlanmış bir PUF alanı ile kaynaştırarak, araştırmacılar, RNA işlemenin çeşitli aşamalarını manipüle etmek için spesifik RNA&#39;ları hedef alan yapay faktörleri mühendislik yapabilir.

Bu raporda, ESF'lerin ve ekleme raportörlerinin tasarımı ve inşası için komple protokol açıklanmaktadır. Aynı zamanda, endojen genlerin AS'sinin manipüle edilmesinde ESF'lerin daha ileri uygulamalarını özetlemektedir16. ESF aracılı splicing değişikliklerinin tipik sonuçlarını göstermek için önceki çalışmalarımızdaki verileri bir örnek olarak kullanırız. Farklı fonksiyonel alanlara sahip ESF'ler, hedef kaset eksonunun dahil edilmesini teşvik etmek veya inhibe etmek için kullanılabilir ( <...

Bu rapor, özellikle memeli hücrelerinde hedef genlerin eklenmesini düzenleyen yeni Yapay Ekleme faktörler (ASFS) tasarım ve yapı için biyoteknolojik yöntemi tarif etmektedir. Bu yöntem ayrıca, RNA metabolizması diğer yönlerini işlemek için çeşitli yapay faktörleri mühendisi genişletilebilir.

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Bu protokolün genel amacı, belirli bir hedefin alternatif eklemesini özel olarak manipüle edebilen yapay birleştirme faktörleri tasarlamaktır. Bu yöntem, kanser hücrelerinde alternatif eklemenin düzenlenmesi ve yanlış düzenlenmesi gibi RNA işleme alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı esnekliğidir.Herhangi bir gende farklı türde alternatif eklemeleri teşvik eden veya inhibe eden yapay faktörler tasarlayabiliriz. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımın bir araştırma görevlisi olan Huan-Huan ve laboratuvarımda bir doktora sonrası olan Qianyun olacak. Vahşi tip PUF DNA, özelleştirilmiş PUF alan iskelesini oluşturmak için bir şablon olarak kullanılır.Her pozisyonda farklı RNA nükleotidlerini spesifik olarak tanıyan PUF dizileri içeren PCR primerleri kullanın. Her PUF tekrarı için, her pozisyonda farklı bir tabanı tanımak için dört farklı astar kullanın. Birinci tur PCR'de, dört PUF tekrarı, evrensel köprü parçaları ve kapak parçaları için kodlama dizileri oluşturmak için gösterilen primer çiftlerini kullanın.İkinci turda, son adımda oluşturulan PCR ürünlerini, R-bir ila R-dört ve R-beş ila R-sekiz RNA tanıma kodları için kodlama dizileri

engineering-artificial-factors-to-specifically-manipulate-alternative

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Alternatif ekleme düzenlemesinin, çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde önemli bir hücresel program olan epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Burada, EMT sırasında alternatif eklemenin tespiti için indüklenebilir bir EMT modeli kullanan bir yöntemi açıklıyoruz.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

Burada katı tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran amaçlayan bir protokol açıklar. Bu hedefe, biz RNA seq ile ebeveyn ve in vitro dirençli modellerin transkriptomik profillerini analiz ve aday genler doğrulamak için bir QRT-PCR tabanlı bir yöntem kurdu.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Kısa antianlamlı oligonucleotides fare beyin bölümlerde alternatif pre-mRNA yapıştırma desenleri algılamak için kullandığı bir in situ hibridizasyon (ISH) protokolü tanımlanır.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Dairesel RNA'lar üreten muhabir genleri klonlayıp analiz ediyoruz. Bu muhabir genler doğrusal birleştirme analiz etmek ve Alu elemanları içeren yapılar daha büyüktür. Dairesel RNA'ları araştırmak için yapılar hücrelere dönüştürülr ve doğrusal RNA çıkarıldıktan sonra RT-PCR kullanılarak ortaya çıkan RNA analiz edilir.

Dairesel RNA'ları Analiz Etmek Için Minigen İçeren Alu Elementin Kullanımı

Bu protokol, cilt fibroblastlarının miyoblastlara dönüşümünü ve farklılaşmalarını miyotüplere açıklar. Hücre hatları nöromüsküler bozukluğu olan hastalardan türetilmiştir ve patolojik mekanizmaları araştırmak ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılabilir.

Nöromüsküler Bozukluklar için Tedavileri Araştırmak için İnsan Fibroblastlarının Myoblastlara Doğrudan Yeniden Programlanması

Bu protokol, kemoterapötik tedaviden sonra alternatif birleştirme regülasyonunda karakteristik olmayan işleve sahip bir proteinin rolünü değerlendirmek için hızlı ve kullanışlı bir araç sunar.

mRNA Birleştirme Değişikliklerini incelemek için E1A Minigene Aracını Kullanma

Alternatif ekleme (AS) ve alternatif poliadenilasyon (APA), transkript izoformlarının ve ürünlerinin çeşitliliğini genişletir. Burada, deneysel koşullar arasında değişen AS ve APA'yı tespit etmek ve görselleştirmek için toplu RNA-seq ve 3' uç dizileme testlerini analiz etmek için biyoinformatik protokolleri açıklıyoruz.

RNA-seq Verilerinde Alternatif Ekleme ve Poliadenilasyonun Tanımlanması

Bu protokol, 5'-splice bölgesi mutasyonlarının birleştirme üzerindeki etkisini izlemek için bir minigene muhabiri testini açıklar ve mutasyona bağlı birleştirme inhibisyonunun kurtarılması için bastırıcı U1 snRNA geliştirir. Muhabir ve bastırıcı U1 snRNA yapıları HeLa hücrelerinde ifade edilir ve birleştirme astar uzantısı veya RT-PCR ile analiz edilir.

Birleştirme Verimliliğini İzlemek için Muhabir Tabanlı Hücresel Test

Hematopoetik kök hücre biyolojisini ve hematolojik maligniteleri daha iyi incelemek için hematopoetik kök ve progenitör hücrelerdeki (HSPC'ler) somatik mutasyonları sadık bir şekilde modellemek için yeni stratejiler gereklidir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanımını ve çift rAAV donör transdüksiyonunu birleştirerek HSPC'lerde heterozigot fonksiyon kazancı mutasyonlarını modellemek için bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerinde Onkojenik Heterozigot Fonksiyon Kazancı Mutasyonlarının Mühendisliği

Bu protokol, etkili bir şekilde, taze izole edilmiş beşeri villöz sitotrofoblastlar siRNA transfekte gözeneklendirilmesinin kullanılarak bu hücrelerde DNA-protein kompleksleri tanımlanması için bir yöntem tarif eder. Transfekte edilen hücreler, Western Blot ile izlenebilir ve EMSA 4-günlük kültür döneminde analiz eder.

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Keşfedin yapay bağlantı faktörleri mühendisliği ile insan hücrelerinde alternatif bağlantı işleme yöntemini. Bu esnek teknik, RNA metabolizması ve kanser hücrelerindeki gen düzenlemesi araştırmalarına yeni kapılar açar.

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

Daha fazla video keşfet