Name: Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Öğrenin, insan kanından CD14 manyetik boncuk ayrımı ile monosit izolasyonu ve dendritik hücrelere farklılaştırma yöntemini. Bu teknik immünoloji araştırmalarında antijen sunumu çalışmaları için yüksek saflıkta hücre elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hijyen ve Tıbbi Mikrobiyoloji Bölümü'nden teknisyenimiz Karolin Thurnes'e ve Kan Transfüzyonu ve İmmünoloji Merkez Enstitüsü Kan Transfüzyonu ve İmmünoloji Bölümü'nden Dr. Annelies Mühlbacher ve Dr. Paul Hörtnagl'a bu makaleyle ilgili değerli yardım ve destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışmayı desteklediği için Avusturya Bilim Fonu'na teşekkür ederiz (P24598'den DW'ye, P25389'dan WP'ye).

Etik deyimi: bilgilendirilmiş onam Yazılı Kan Transfüzyon &amp; İmmünolojik Bölümü, Innsbruck, Avusturya Merkez Enstitüsü tarafından tüm katılımcı kan vericilerden elde edildi. bilimsel amaçlarla anonim artık örneklerinin kullanılması Innsbruck Tıp Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylandı. Periferal Kan Tek Çekirdekli Hücreleri 1. zenginleştirilmesi (PBMC) <ol><li> Santrifüj ile PBMC&#39;lerin konsantre. <ol><li> Alınan kan miktarına göre steril 50 ml santrifüj tüplerine kan paketi ve split kan açın. </li><li> Gerekirse, steril Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS) ile her bir tüp için 50 ml göre ayarlayın. </li><li> Bir santrifüj tüpleri yerleştirilir ve fren oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca 400 x g&#39;de bunları dönerler. </li><li> boundar bırakarak, steril 10 ml serolojik pipet kullanarak plazma ve trombosit içeren üst katman kapalı Beraberliky tabakası rahatsız. Not: FCS yerine otolog plazma kültür ortamının ek kullanılırsa, plazma toplandı gerekir ve bu adımda ısı ile inaktive edilmiş. </li><li> iki adet 50 ml&#39;lik santrifüj tüplerine alınan mononükleer hücreler (sınır tabakaları) toplamak ve bir steril 10 ml serolojik pipet kullanılarak bir steril 50 ml tüp içine transfer edin. </li><li> Steril D-PBS kullanarak her bir tüp için 50 ml ses seviyesini ayarlayın. </li><li> Bir santrifüj tüpleri yerleştirin ve frensiz oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 400 x g&#39;de onları dönerler. </li><li> bozulmamış sınır tabakası bırakarak, steril 10 ml serolojik pipet kullanarak plazma ve trombosit içeren üst katman kapalı çizin. </li><li> 50 ml santrifüj tüplerine alınan mononükleer hücreler (sınır tabakaları) toplamak ve bir steril 10 ml serolojik bir pipet kullanarak, iki steril 50 mi toplama tüpleri içine aktarın. </li><li> Steril D-PBS ile her tüp için 50 ml ses seviyesini ayarlayın. </li></ol></li><li> ayrılıkyoğunluk gradyan santrifüjü ile PBMC&#39;lerin (Şekil 1). <ol><li> Her tüpe yoğunluk gradyan ortamı dört adet 50 ml tüpler ve pipet 15 mi hazırlayın. </li><li> toplama tüpüne (adım 1.1.10) toplanan hücre / kan 25 ml alın ve dikkatle yoğunluk gradyan orta kaplaması. </li><li> Bir santrifüj tüpleri yerleştirilir ve fren RT&#39;de 30 dakika boyunca 700 x g&#39;de bunları dönerler. </li></ol></li><li> Toplama ve PBMC saflaştırılması. <ol><li> steril 10 ml serolojik pipet kullanarak plazma ve trombosit, rahatsız PBMC tabakası bırakarak içeren üst katman kapalı çizin. </li><li> Tüm tüplerden PBMC interfaz toplamak ve steril bir 25 ml serolojik pipet kullanarak, iki steril 50 ml tüpler hücreleri havuz. </li><li> Steril D-PBS ile her tüp için 50 ml ses seviyesini ayarlayın. Bir santrifüj tüpleri yerleştirilir ve fren ile, 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 400 x g&#39;de bunları dönerler. </li><li> Süpernatantı aspire ve yeniden askıyaSteril, D-PBS içinde hücreleri. Her iki tüpe hücreleri havuz ve steril D-PBS ile 50 ml ses seviyesini ayarlamak. </li><li> santrifüj tüpleri yerleştirilir ve fren ile, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de bunları dönerler. </li><li> Süpernatantı aspire ve steril D-PBS hücrelerin yeniden askıya. D-PBS 450 ul ihtiva eden 1.5 ml bir tüp steril D-PBS ile 50 ml ve pipet 50 ul hacim ayarlayın. </li><li> Vortex 1.5 ml tüp şiddetle ve Neubauer odasına veya diğer herhangi bir hücre sayım enstrüman hücreleri saymak. </li><li> santrifüje 50 ml tüpler yerleştirin ve fren ile, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de bunları dönerler. </li></ol></li></ol> Anti-insan CD14 Manyetik Parçacıklar tarafından Monositler 2. izolasyonu <ol><li> Manyetik parçacıklar ile PBMC&#39;lerin etiketleme. <ol><li> Yalıtım tamponu kullanılarak 8 x 10 7 hücre / ml PBMC konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> Vorteks anti-insan CD14 manyetik parçacıklar thoroughly ve her 1 x 10 7 PBMC&#39;ler için parçacıkların 50 ul ekle. </li><li> İyice hücre partikül süspansiyonu karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe. </li></ol></li><li> Pozitif ve negatif fraksiyonların ayrılması. <ol><li> izolasyon tamponu kullanılarak 12 ml hacim kadar ayarlayın. </li><li> Her tüpe, hücre parçacık süspansiyonu altı steril yuvarlak tabanlı tüp ve pipet 2 ml hazırlayın. </li><li> Hemen mıknatıs tüpler yerleştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> mıknatıs üzerinde tüpler tutun ve dikkatle süpernatant çizin. Süpernatan negatif kısmını içerir. </li><li> mıknatıstan tüpü çıkarın ve izolasyon tampon 2 ml ekleyin. </li><li> Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri yeniden askıya. </li><li> geri mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> mıknatıs üzerinde tüpler tutun ve dikkatle süpernatant çizin. Süpernatan negatif kısmını içerir. </li><li>Mıknatıs tüpleri çıkarın ve her bir tüpe yalıtım tamponu 2 ilave edin. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri yeniden askıya. </li><li> steril bir 50 ml tüp pozitif kısmını aktarın ve steril D-PBS kullanarak 50 ml ses seviyesini ayarlamak. </li></ol></li></ol> IL-4 ve GM-CSF ile izole edilmiş monositlerin 3. uyarılması <ol><li> santrifüj tüpü yerleştirin ve fren ile 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 400 xg&#39;de döndürün. </li><li> Aspire süpernatan ve D-PBS, 50 ml hücrelerin yeniden askıya. </li><li> D-PBS 450 ul içeren bir 1.5 ml tüp içine Pipet 50 ul. Vortex 1.5 ml tüp şiddetle ve Neubauer odasına ya da başka bir hücre sayım enstrüman hücreleri saymak. </li><li> santrifüj içine 50 ml tüp yerleştirin ve fren ile 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 400 xg&#39;de döndürün. NOT: periferik kan lenfositleri (PBL) içeren negatif fraksiyon, ayrıca gerekiyorsa, yıkama gerçekleştirmek ve sayma t benzer adımlarPozitif fraksiyonun hortum (3.1-3.5 adımlar). </li><li> Önceden ısıtılmış bir kültür ortamı (RPMI 1640,% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS ve% 1 L-Glutamin çözeltisi ile desteklenen ortamda) ve pipet 3 ml / 6-çukurlu plakalara 1 x 10 6 / ml hücre yoğunluğu ayarlayın. NOT: ısı ile inaktive otolog plazma kullanıyorsanız, deneysel set-up göre,% 1-5 otolog plazma ile% 10 FCS değiştirin. </li><li> Kültür ortamı içine doğrudan sitokin pipetleme rekombinant insan IL-4 (250 U / ml) ve rekombinant insan GM-CSF (1000 U / ml) ile monositlerini uyarma. 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5 CO2. </li><li> Kültür ortamı içine doğrudan sitokin pipetleme 48 saat sonra IL-4 (250 U / ml) ve GM-CSF (1000 U / ml) ile hücrelerin yeniden teşvik eder. NOT: orta pH göstergesi ile gösterilen asitlenme herhangi bir işaret varsa, önceden ısıtılmış kültür ortamı ile orta yarısı değiştirin. </li><li> Hasat için, 5. günde dendritik hücreler olgunlaşmamışaşağı akım 6 oyuklu plaka üzerinden bir 50 ml santrifüj tüpüne kadar kültür ortamı pipetle sonra bir kaç kez aşağı kültürlenmiş hücreler pipetleme deneyler. </li><li> hücrelerin sayısı ve CD11b, CD11c karşı anti-insan antikorları izole monositler bir örnek leke ve birlikte bir hücre canlılığı boya ile DC-SIGN / CD209. Yüzey boyama sırasında antikorların özgül olmayan bağlanma önlemek için, reaktif ya da sığır serum albümini (BSA) tampon Fc reseptör bloke edici kullanılması önerilir. </li><li> Oluşturulan iDH&#39;lerin saflığını ve canlılığını değerlendirmek için akış sitometri gerçekleştirerek, üreticinin protokolüne göre, hücre canlılığı boya kullanılarak örnek analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Steinman, R. M., Hemmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%3A+translating+innate+to+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).</li>
<li>Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+capture%2C+processing%2C+and+presentation+by+dendritic+cells%3A+recent+cell+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies.</a> Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).</li>
<li>Schwarz, J., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+Dendritic+Cell+Haptotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis.</a> Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).</li>
<li>Weber, M., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+chemotactic+dendritic+cell+migration+in+explanted+mouse+ear+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations.</a> Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).</li>
<li>Sixt, M., Lammermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+chemotactic+leukocyte+migration+in+3D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments.</a> Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).</li>
<li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).</li>
<li>Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+promoting+dendritic+cell-mediated+transmission+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV.</a> Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).</li>
<li>Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+levels+of+HIV-1+infection+in+cutaneous+dendritic+cells+promote+extensive+viral+replication+upon+binding+to+memory+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells.</a> J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li>
<li>Pruenster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+lectin-independent+interaction+of+complement+opsonized+HIV+with+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells.</a> Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).</li>
<li>Wilflingseder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+opsonization+of+HIV+impedes+provirus+formation+in+and+infection+of+dendritic+cells+and+subsequent+long-term+transfer+to+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells.</a> J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).</li>
<li>Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic-cell+control+of+pathogen-driven+T-cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization.</a> Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).</li>
<li>Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-dependent+T+cell+activation+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-dependent T cell activation in autoimmunity.</a> Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).</li>
<li>Banki, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+as+an+endogenous+adjuvant+for+dendritic+cell-mediated+induction+of+retrovirus-specific+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000891(2010).</li>
<li>Posch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+attenuate+the+capacity+of+dendritic+cells+to+stimulate+HIV-specific+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes.</a> J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).</li>
<li>Posch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-Opsonized+HIV-1+Overcomes+Restriction+in+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells.</a> PLoS Pathog. 11, e1005005(2015).</li>
<li>Wilflingseder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+T-Helper+17+Polarization+Upon+Triggering+CD11b%2Fc+on+HIV-Exposed+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells.</a> J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).</li>
<li>Grassi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+dendritic+cells+have+a+phenotype+comparable+to+that+of+dermal+dendritic+cells+and+display+ultrastructural+granules+distinct+from+Birbeck+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules.</a> J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol, manyetik nanopartikül bazlı analiz kullanılarak anti-pıhtılaşmış kandan alınan insan monosit yalıtımla monosit türevli dendritik hücreler (MDDCs) üretimini tarif eder. Bu protokol, santrifüj adımları PBMC fraksiyonu bir zenginleşmeye yol açan hücre izolasyon prosedürü, üst baş tarafında ifa edilir. Hücreler santrifüj sırasında kaybolur, ancak, yoğunluk gradyanlı ortamının 200-300 ml gerektirecektir yoğunluk gradyan ortamında bütün bir kan paket içeriğini kaplamak için ve bu nedenle de düşük maliyetli olarak...

Dendritik hücreler (DC), bağışıklık sisteminin en önemli özel antijen sunan hücrelerdir. Olgunlaşmamış DC&#39;ler (iDH&#39;ler) deride veya mukozal dokularda bulunan ve işgalci patojenlere ile etkileşim ilk bağışıklık hücreleri arasında bu nedenle. Bu patojen tespiti, aşağıdaki T- ve B-hücresi tepkilerini aktifleştirme çünkü DH&#39;ler, doğal ve adaptif bağışıklık sisteminin 1 arasında bir köprü oluşturmaktadır. Bundan başka, çünkü bu tür IL-1, IL-6 ve IL-12 gibi sitokinler yüksek miktarda salgılanması pro-enflamatuar bağışıklık tepkilerinin katkıda bulunur. DH&#39;ler NK hücrelerini aktive ederek ve kemotaksi neden olduğu enfeksiyona sitesine başka bağışıklık hücrelerinin çeker. DH&#39;ler olgun olmayan dendritik hücreler (iDH&#39;ler) ve bunların yapısının ve fonksiyonunun göre olgun dendritik hücreler (MDC) 2 ayrılabilir. Birçok örüntü tanıma reseptörlerinin biri (örn, paralı-benzeri reseptörler, C tipi yabancı antijenlerin alımdan sonralektinleri veya bol hücre yüzeyi üzerinde ifade edilen) reseptörleri güzelleştirmek, iDH&#39;ler büyük değişiklikler geçmesi ve olgun başlar. Antijen sunumu için gerekli moleküllerin 3 yukarı regüle edilir ise, bu olgunlaştırma işlemi sırasında, antijen tutma reseptörleri, aşağı regüle edilir. Olgun DH&#39;ler ana histokompatibilite kompleksi I ve II (MHC I ve II) yukarı doğru regüle, T lenfositlerin antijen sunumu ve aktivasyonu için gerekli olan CD80 ve CD86 gibi eş-uyarıcı moleküller. Buna ek olarak, hücre yüzeyi üzerinde kemokin reseptör CCR7 ekspresyonu lenf düğümlerine periferik dokularda DC&#39;lerin geçişini sağlayan, indüklenir. Taşıma lenf düğümlerine 4-6 bir kemokin ligand 19 (CCL19 / MIP-3b) ve kemokin ligandı 21 (CCL21 / SLC) degrade boyunca DClerin &quot;döner&quot; ile kolaylaştırılır. Göç eden, MDC ve böylece ini, CD4 + ve CD8 + T hücreleri naiv işlenmiş antijeniistilacı patojen 7 karşı edinilmiş bağışıklık tepki tiating. Lenf düğümlerindeki T hücreleri ile bu etkileşimi de virüsü 8 yayılması ile ilişkilidir. Diğer in vitro çalışmalar DC&#39;ler verimli yakalamak ve güçlü bir enfeksiyon 9-12 Bu iletim sonuçlarına T hücrelerine ve HIV aktarmak olduğunu ortaya koydu. Bu deneyler lenf düğümlerine çevreden servisleri olarak in vivo HIV patlatır DC&#39;ler vurgulayın. Antijen sunumu sırasında DH&#39;ler efektör T yardımcı hücrelerinin farklılaşmasını şekil ve bu nedenle, mikrop karşı tüm bağışıklık tepkisinin sonucu bu çok etkileşim belirlenir önemli interlökinler salgılar. Yanı sıra tip 1 (Th1) ve tip 2 (Th2) efektör T hücreleri, CD4 + T yardımcı hücreleri (örneğin, tip 17 (Th17) ve tip 22 (Th22) T hücreleri) tarif edilmiştir ve diğer alt-gruplar ve bunların gidiş ve fonksiyon iyice incelenmiştir. DH&#39;ler, ayrıca katılandüzenleyici T hücreleri (Tregs) 13,14 nesil. Bu hücreler bağışıklık ve durdurmak ya da indüksiyon veya efektör T hücrelerinin çoğalmasını aşağı düzenleyen ve böylece bağışıklık ve hoşgörüyü geliştirmek için çok önemli olabilir. İnsan konvansiyonel DC&#39;ler (CDCS) bir miyeloid kökenli hücrelerin çeşitli alt kümelerini oluşturan (yani, Langerhans Hücreleri (LCs) ve dermal ve interstisyel DC&#39;ler) veya lenf kökenli (yani, plazmasitoid DC&#39;ler (PDC)). In vitro deneylerde veya DC aşılama stratejileri, monosit kökenli DH&#39;ler rutin dermal DC&#39;ler için bir model olarak kullanılmaktadır. Bu hücreler, geleneksel miyeloid dendritik hücrelerin fizyoloji, morfoloji ve fonksiyon benzerlikler göstermektedir. Bunlar, sağlıklı vericilerden 12,15-18 izole monositlere interlökin 4 (IL-4) ve granülosit-makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF) eklenerek oluşturulur. Dendritik hücreler, doğrudan dermal ya da mukozal biopsiden izole edilmiş ya da olabilir b edilebilire CD34 + eski utero elde göbek kordonu kan örneklerinden izole edilen hematopoetik progenitör hücrelerden geliştirdi. Burada, monositler izole edilmiş ve yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla periferal kan tek-çekirdekli hücresi (PBMC), zenginleştirme sonra anti-pıhtılaşmış insan kanından uyarılır gösterilmektedir. 5 gün için inkübe edildikten sonra, özel koşullar altında insan monositleri iDH&#39;ler ayrılırlar olmayan bir klinik deney prosedürleri için hazırdır.

<table><tbody><tr><td>APC Fare Anti-İnsan CD19 Klonu HIB19</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>APC Fare Anti-İnsan CD83 Klonu HB15e</td><td>BD Biosciences</td><td>551073</td><td></td></tr><tr><td>BD Imag Anti-İnsan CD14 Manyetik Parçacıklar</td><td>BD Biosciences</td><td>557769</td><td></td></tr><tr><td>BD Imagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Albümin Fraksiyonu V)</td><td>Carl Roth</td><td>EG-Nr 2923225</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 Kuyu Şeffaf TC ile İşlenmiş Çoklu Kuyu Plakaları</td><td>Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunluk gradyan ortamı: Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (D-PBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10&nbsp; ml Serolojik</td><td>Pipet Corning</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 25&nbsp; ml Serolojik</td><td>Pipet Corning</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&nbsp; ml Yüksek Netlik PP Santrifüj Tüpü</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Yuvarlak Tabanlı Tüpler</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FITC Fare Anti-İnsan CD3 Klonu HIT3a</td><td>BD Biosciences</td><td>555339</td><td></td></tr><tr><td>Hayalet Boya Menekşe 510 (Hücre Canlılığı Reaktifi)</td> <td>Tonbo biosciences</td><td>13-0870</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-862</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile İnaktive Edilmiş FBS (Fetal Sığır Serumu), AB Onaylı Menşeli (Güney Amerika)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>Hettich</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 CC</td><td>PromoKine</td><td>C-61401</td><td></td></tr><tr><td>İzolasyon tamponu: BD IMag Tamponu (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>552362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri, 1.5 ml, SuperSpin</td><td>VWR</td><td>211-0015</td><td></td></tr><tr><td>PE Fare Anti-İnsan CD14 Klon M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>555398</td><td></td></tr><tr><td>PE Fare Anti-İnsan CD209 Klonu DCN46</td><td>BD Biosciences</td><td>551265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 orta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr></tbody></table>

tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritik hücreler (DC'ler), hücre yüzeylerinde eksprese edilen çeşitli örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) aracılığıyla virüsler, bakteriler ve mantarlar gibi farklı patojenlerin yabancı yapılarını tanır ve böylece bağışıklığı aktive eder ve düzenler. 
DC'lerin ana işlevi, antijenleri MHC I ve MHC II molekülleri aracılığıyla naif T lenfositlerine sunarak lenf düğümlerinde adaptif bağışıklığın indüklenmesidir. Bu nedenle, DC'ler, enfeksiyon bölgelerinde patojenlerin tanınmasından sonra periferden lenf düğümlerine göç etmek zorundadır. İn vitro deneyler veya DC aşılama stratejileri için monositten türetilmiş DC'ler rutin olarak kullanılır. Bu hücreler fizyoloji, morfoloji ve fonksiyon açısından geleneksel miyeloid dendritik hücrelere benzerlik gösterir. Sağlıklı donörlerden izole edilen monositlerin interlökin 4 (IL-4) ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) stimülasyonu ile üretilirler. Burada, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile periferik kan mononükleer hücre (PBMC) zenginleştirmesinden sonra monositlerin anti-pıhtılaşmış insan kanından nasıl izole edildiğini ve uyarıldığını gösteriyoruz. İnsan monositleri olgunlaşmamış DC'lere ayrılır ve 5 günlük inkübasyondan sonra klinik olmayan bir ortamda deneysel prosedürler için hazırdır.

Bir sükroz yastık kullanılarak anti-pıhtılaşmış kanın santrifüje edilmesinden sonra, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), yoğunluk gradyan ortamı (Şekil 1) üstüne bir arayüz içinde zenginleştirilmiştir. PBMC'ler çekilir sonra FACS analizi soyu belirteçler kullanılarak PBMC (örneğin, CD3 T lenfositlerin, CD14 monositler için ve CD19 B lenfositleri için) olan farklı hücre popülasyonları için gerçekleştirilir. Şekil 2A, toplandı ve yoğunl...

Burada, insan anti-pıhtılaşmış kanının yoğunluk gradyanlı santrifüjlenmesinden sonra periferik kan mononükleer hücrelerinden manyetik boncuk ayrılması ile monositlerin nasıl izole edildiğini gösteriyoruz. 5 günlük inkübasyonun ardından, insan monositleri olgunlaşmamış dendritik hücrelere ayrılır ve klinik olmayan bir ortamda deneysel prosedürler için hazır hale gelir.

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Bu CD14 manyetik boncuk ayırma tekniğinin genel amacı, in vitro olarak dendritik hücrelere veya makrofajlara daha fazla farklılaşmaları için monositleri kandan izole etmektir. Bu yöntem, dendritik hücreler tarafından patojenlerin veya antijenlerin tanınması, işlenmesi ve sunulması ile ilgili immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu izolasyon işleminin temel avantajı, %98 ila 99 oranında saf monosit popülasyonunun elde edilebilmesidir.Prosedürü göstermek, çalışma grubumuzdan bir teknisyen olan Karolin Thurnes olacak. Alınan kan miktarına göre kan paketi hacmini steril 50 mililitrelik santrifüj tüpleri arasında bölerek başlayın. Gerektiği gibi steril Dulbecco'nun PBS'si ile her tüpteki son hacmi 50 mililitreye ayarlayın ve numuneleri santrifüjleyin.Bir laboratuvar vakum pompasına bağlı steril bir mililitrelik serolojik pipet kullanarak, sınır katmanlarını rahatsız etmeden bırakarak plazma ve trombosit katmanlarını çıkarın. Ardından, yeni steril 50 mililitrelik konik tüpteki iki tüpten mononükleer hücre sınır katmanlarını birleştirmek için yeni bir 25 mililitrelik pipet kullanın. Daha sonra, 450 mililitrelik konik tüplerin her birine 15 mililitre yoğu

generation-of-human-monocyte-derived-dendritic-cells-from-whole-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dendritik hücreler tarafından ikincil lenfoid organlara Antijen sunumu T hücre aracılı adaptif immün yanıt başlatılması için çok önemlidir. Burada kemik iliği kültürü elde edilen fare dendritik hücreler, aktivasyon, 2-foton görüntüleme için etiketleme göstermektedir.

Kemik İliği Üretimi 2-foton Görüntüleme Kullanım murin Dendritik Hücreler Türetilmiş

Bu videoda, yetişkin bir farenin kemik iliğinden dendritik hücrelerin (T hücrelerini aktive eden anahtar antijen sunan hücreler) üretilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreler Üretimi: Fare Kemik İliğinden Dendritik Hücreler Üretme Yöntemi

Bu video, insan monositlerinden olgunlaşmamış, olgun ve tolerojenik dendritik hücrelerin veya DC'lerin oluşumunu göstermektedir. Monositlerin büyüme faktörleri ve sitokinlerle inkübasyonu, olgunlaşmamış DC'lerin üretimine yol açar. İmmün düzenleyici moleküllere yanıt olarak, olgunlaşmamış DC'ler tolerojenik ve olgun DC'lere farklılaşır.

Monositlerden Olgunlaşmamış, Olgun ve Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Üretilmesi

Burada, translasyonel uygulamalar için heterojen kemik iliğinden büyük miktarlarda murin monositleri üreten bir protokol sunuyoruz. Diğerleriyle karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem, kurban edilen hayvan sayısını azaltmaya yardımcı olur ve yüksek gradyanlı manyetik hücre ayırma (MACS) gibi pahalı yöntemlerden kaçınarak maliyetleri düşürür.

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

Olgunlaşmamış dendritik hücreler, bağışıklık ve tolerans arasındaki dengeyi düzenlemek için seçici olarak tolerojenik veya olgun dendritik hücrelere farklılaştırılabilir. Bu çalışma, metabolik fenotiplerde farklılık gösteren olgunlaşmamış monosit türevli dendritik hücrelerden (moDC'ler), in vitro tolerojenik ve olgun moDC'lerden üretmek için bir araç sunmaktadır.

Metabolik fenotipleri farklı olarak sahip Olgunlaşmamış, Olgun ve tolerojenik Dendritik Hücrelerinin Üretimi

Bu çalışma, in vitro dendritik hücreler (DC'ler) elde etmek için iki farklı insan monosit izolasyonu yöntemini karşılaştırmaktadır. Monositler yapışma ile seçilir veya manyetik ayırma ile negatif olarak zenginleştirilir. Monosit verimi ve canlılığı ile MDDC canlılığı, proliferasyonu ve CD11c/CD14 yüzey marker ekspresyonu her iki yöntem arasında karşılaştırılacaktır.

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Burada biz belirlenmesi ve GM-CSF myeloid hücrelerin hücre yüksek hızlı sıralama kullanarak tahrik çok sayıda ayırma için bir yöntem sağlar. Beş ayrı nüfus (ortak miyeloid ataları, granülosit/makrofaj ataları, monosit, monosit kaynaklı makrofajlar ve monosit kaynaklı DCs) Ly6C ve CD115 ifade üzerinde göre tespit edilebilir.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Transimmünizasyon (TI) cihaz veya plaka ve ilgili protokoller, deneysel bir ortamda, ekstrorporeal fotokemoterapi (ECP) temel özelliklerini çoğaltmak için geliştirilmiştir, fizyolojik olarak aktif, ayarlanabilir dendritik üretimi için izin kanser immünoterapi için hücreler (DCs).

Fizyoloji Immunogenic dendritik hücreler oluşturma için yeni protokol

Metodoloji, sığır monosit kaynaklı dendritik hücrelerin (MoDC'ler) oluşumunu ve sığırlarda potansiyel veteriner aşılarının geliştirilmesi sırasında antijenik adayların in vitro değerlendirilmesi için uygulamalarını açıklamaktadır.

Sığır Monosit Kaynaklı Dendritik Hücreler Kullanılarak Aşı İmmünojenitesinin Belirlenmesi

Bir sialidaz tedavisi kullanılarak izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) de-sialillenmiş insan monosit türevli dendritik hücreler (mo-DC'ler) oluşturmak için benzersiz, kapsamlı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, mo-DC'lerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunu değerlendirmek ve sialidaz tedavisinin mo-DC'lerin olgunlaşma seviyesini nasıl iyileştirdiğini değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Farklı Sialillenmiş Fenotiplere Sahip Monosit Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Üretimi

Farmakolojik ajanların naif monosit türevli dendritik hücrelerden in vitro olarak tolerojenik dendritik hücreler üretme kapasitesini değerlendirmek ve otolog düzenleyici T hücresi üretimi ile potansiyellerini doğrulamak için bir prosedür tanımladık.

İnsan CD14+ Monositlerinden Tolerojenik Dendritik Hücrelerin Üretilmesi için İmmünomodülatör Ajanları Test Etmek İçin Basit ve Etkili Bir Yöntem

Öğrenin, insan kanından CD14 manyetik boncuk ayrımı ile monosit izolasyonu ve dendritik hücrelere farklılaştırma yöntemini. Bu teknik immünoloji araştırmalarında antijen sunumu çalışmaları için yüksek saflıkta hücre elde edilmesini sağlar.

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Daha fazla video keşfet