İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

Bu tekniğin genel amacı, lipid-proksimal protein-protein etkileşimlerini in vitro olarak yakalamaktır. Bu yöntem, mitokondriyal dış zardaki protein-protein etkileşimlerinin aksesuar lipitlerden nasıl etkilenebileceği gibi mitokondriyal dinamik alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, çözünür protein alanlarının lipit şablonlarına bağlanmasının, daha doğal bir doğrulamanın elde edilebilmesini sağlamasıdır.

Ayrıca, çözünür proteinler ve bağlı ortakları arasındaki karmaşık etkileşimler, tanımlanmış lipid kofaktörlerinin varlığında değerlendirilebilir. Bu yöntemi mitokondriyal fisyon makinesindeki protein etkileşimlerini araştırmak için kullanmamıza rağmen, çeşitli zar bölmelerine lokalize olan diğer protein komplekslerine de uygulanabilir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Ryan olacak.

İlk olarak, istenen lipitlerin kloroform çözeltilerini temiz bir cam test tüpünde birleştirin. İnce bir lipit filmi oluşturmak için tüpü döndürürken çözücüyü kuru nitrojen gazı ile buharlaştırın. Daha sonra kalan çözücüyü santrifüj buharlaştırıcı ile 37 santigrat derecede bir saat boyunca çıkarın.

Bunu takiben, bir ila iki milimolar nihai lipit konsantrasyonu vermek için önceden ısıtılmış tampon A ekleyin. Lipid karışımını tamamen yeniden süspanse etmek için ara sıra girdap ile 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, lipit karışımını plastik bir test tüpüne aktarın ve tüpü tamamen donana kadar yaklaşık 30 saniye sıvı nitrojen içine yerleştirin.

Daha sonra tüpü tamamen çözülene kadar bir ila iki dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Daha sonra, dört filtre desteğini ve bir polikarbonat filtreyi tampon A'ya batırarak ve ekstrüderi üreticinin talimatlarına göre monte ederek bir lipit ekstrüder hazırlayın. Homojen bir boyut dağılımı sağlamak için lipit çözeltisini hafif sabit basınç kullanarak filtreden 21 kez sıkın.

Ekstrüzyon sırasında, lipozom boyutu homojenliğini sağlamak için yavaş sabit basınç kullanın. Bir mikronluk bir filtre ile bu daha az önemlidir. Ancak daha küçük filtre boyutlarıyla, daha belirgin bir heterojenlik ortaya çıkabilir.

Ekstrüde lipozomları dört santigrat derecede saklayın. His etiketli mitokondriyal fisyon faktörünü veya Mff'yi iskele lipozomları ile oda sıcaklığında A ve BME tamponunda en az 15 dakika inkübe edin. Mff içermeyen bir kontrol için, lipozomları, maruz kalan Nikel-NTA'yı bağlamak ve korumak için GFP gibi His etiketli bir kontrol proteini ile inkübe edin.

Lipozom karışımına dinamin ile ilişkili protein bir veya Drp1 ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra, numunenin beş mikrolitresini bir laboratuvar filmi tabakasına aktarın ve numunenin üzerine karbon kaplı bir bakır-rodyum ızgara yerleştirin. Bir dakika inkübe ettikten sonra, fazla sıvıyı filtre kağıdı ile alın ve% 2 uranil asetat ekleyin.

Bir dakika daha inkübe ettikten sonra, fazla lekeyi filtre kağıdı ile çıkarın ve numuneyi bir ızgara kutusuna aktarın. Ertesi gün, protein ve lipozom morfolojilerindeki ultrastrüktürel değişiklikleri gözlemlemek için numuneleri 18.500 ila 30.000X büyütmede bir transmisyon elektron mikroskobu kullanarak görüntüleyin. His etiketli Mff ve Fis1'i iskele lipozomları ile oda sıcaklığında A ve BME tamponunda 15 dakika inkübe edin.

Drp1 ekleyin ve her karışımı oda sıcaklığında 15 dakika daha inkübe edin. Tüpleri 37 santigrat dereceye ayarlanmış termocycler'a aktarın ve GTP ve magnezyum klorür ekleyerek reaksiyonları başlatın. İstenilen zaman noktalarında, magnezyumu şelatlamak ve reaksiyonu durdurmak için her reaksiyon karışımından 20 mikrolitreyi beş mikrolitre 0.5 molar EDTA içeren bir mikrotitre plakasının kuyularına aktarın.

Bunu takiben, sonuçları kalibre etmek için potasyum fosfatı tampon A ve BME'de seyrelterek bir dizi fosfat standardı hazırlayın. Beş mikrolitre 0.5 molar EDTA içeren kuyucuklara her standarttan 20 mikrolitre ekleyin. Her kuyucuğa 150 mikrolitre malakit yeşil reaktifi ekleyin.

Son olarak, her eklemeden beş dakika sonra OD 650'yi okuyun. GTP, asidik malakit yeşil reaktifinin varlığında yavaşça hidrolize olacaktır. Bu nedenle, bu reaktif, gürültüye giden sinyali en üst düzeye çıkarmak için absorbansı ölçtükten sonraki 10 dakika içinde tüm numune kuyucuklarına eklenmelidir.

Drp1'in yokluğunda, ne Mff ne de GFP membran deformasyonu ile sonuçlanmadı. Ve GFP ile dekore edilmiş zenginleştirilmiş iskele lipozomları veya ESL için sadece özelliksiz lipozomlar gözlendi. Bununla birlikte, Mff ile dekore edilmiş ESL şablonlarına Drp1 eklendiğinde, lipozomların yeniden şekillenmesi belirgindi.

SL'nin Mff gelişmiş GTPase aktivitesi ile dekorasyonu. Tersine, maruz kalan NTA kafa grupları His etiketli GFP ile bloke edildiğinde, bu artmış GTPase aktivitesi ablasyon edildi. Transmembran alanından yoksun olan Fis1'in SL'ye bağlanması, Drp1'in GTPaz aktivitesinin uyarılmasını da sağlayamadı.

SL'ye benzer şekilde, SL / Cl'nin Drp1'e eklenmesi, His etiketli Fis1 veya GFP'nin lipozomlara bağlanmasıyla tersine çevrilen GTPaz aktivitesinin hafif bir şekilde stimülasyonuna neden oldu. Drp1'in GTPaz aktivitesi, Mff ile dekore edilmiş SL / CL ile inkübe edildiğinde 2.6 kat uyarıldığı için Mff ve kardiyolipin arasında bir sinerji gözlendi. SL/PE/CL şablonları Mff ile süslendiğinde, Drp1 etkinliği geliştirildi.

Drp1'in lipozomları lipid tübüllerine yeniden modelleme yeteneği, iskele lipozomlarına PE eklenmesiyle arttırıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu iskeleler prosedür uygun şekilde yapılırsa saatler içinde hazırlanabilir ve kullanılabilir. Bu prosedürü takiben, fonksiyonel etkileşimleri karakterize etmek için sedimantasyon ve ışık saçılma testleri gibi diğer protein ve lipid etkileşim yöntemleri gerçekleştirilebilir.

Bu tekniğin uygulanması, proteinlerin tanımlanmış bir biyolojik zara translokasyonunu inceleyen kişilerin, geçici protein etkileşimlerini ve temel hücresel düzeneklerin oluşumu ve stabilizasyonundaki spesifik lipid kofaktörlerinin etkisini keşfetmelerine olanak tanır.