Name: Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı, Dermestes maculatus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Öğrenin Dermestes maculatus böceğinde RNA aracılı gen fonksiyonu incelemeyi. Bu yöntem embriyo ve yetişkinlerde gen fonksiyonunu test ederek gelişim ve evrim biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Alison Heffer ve Yong Lu'ya mikroenjeksiyon cihazını kurdukları ve böcek RNAi'leri ile ilgili paha biçilmez bilgi ve deneyimlerini paylaştıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM113230'den L.P.'ye) tarafından desteklenmiştir.

D. maculatus 1. Yetiştirme NOT: D. maculatus bir üreme kolonisi yetişkinler kullanan yazarların laboratuarında kurmak ve larva ticari satın alındı. Türler kimlik DNA barkodu 53 kullanılarak doğrulanmıştır. <ol><li> Laboratuvarda yeni bir kafes kurmak için, bir orta boy böcek kafes (30.5 x 19 x 20.3 cm 3) içine talaş ince bir tabaka yayıldı. Pupa devresi için larva gizlemek izin kafes içinde strafor bir ~ 10 x 6 x 3 cm 3 yığın yerleştirin. 50 böcekleri (yetişkin veya geç dönem larva ya) - 20 ekleyin. Böcekleri talaş içinde gizler. </li><li> Petri kabı veya bir tartı tekne ıslak kedi maması ekleyin. örgü bezle kafes örtün ve bir kuluçka kafesine yerleştirin. </li><li> Laboratuvarda bir üreme kolonisi korumak için, 25 ve 30 ° C arasında sıcaklığını ayarlamak. D. maculatus hızlı yüksek sıcaklıklarda büyür, ama bu da mantar ve parazitlerinin büyümesini destekler. Bir iyileşmek sağlamak içinhızla koloni genişletilmesi için düzenli stok bakım ve 30 ° C 28 ° C - senin koloni, 25 kullanın. Yaşam döngüsü çevresel faktörlerin 50 (Şekil 2) bağlı dört ay yaklaşık üç hafta sürer. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig2.jpg"> Şekil 2: D. maculatus Lab Colony. Tipik bir D. maculatus böcek kafes Fotoğraf gösterilir. Ahşap talaşı böcekleri gizlemek izin yayılır. Kedi maması küçük bir Petri çanağı veya tartım kabı ilave edilir. Strafor pupa son evre larvaları için bir sığınak olarak kafes yerleştirilir. Burada gösterilen kafes 30.5 x 19 x 20,3 cm 3 ve birkaç yüz larva, pupa ve yetişkin ev sahipliği yapmaktadır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54976/54976fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="4"><li> otlakolgun kafeste yumurta ettik. , Koloni genişletmek yukarıdaki gibi, larva veya yetişkin (Bölüm 2 açıklandığı gibi toplanan) yumurta ile yeni kafeslerin kurmak. D. maculatus özellikle gıda kaynağına yakın, kafes boyunca yumurtalarını. </li><li> haftada iki kez hakkında ıslak kedi maması değiştirin. NOT: Islak kedi maması nahoş koku, alternatif gıda kaynakları da test edildi dolayı (Tartışma). </li></ol> 2. Embriyo Koleksiyon <ol><li> Bir koleksiyon kurmak için, en az 50 erkek ve koloniden 50 kadın ayırın. Genç yetişkinler en iyisidir. Talaş olmadan küçük boyutlu kafes (17.8 x 10.2 x 12.7 cm 3) yerleştirin yetişkinler. Bir tartı tekne kedi maması ekleyin. </li><li> toplama başlamadan önce, mevcut herhangi bir embriyolar için dikkatli kafes kontrol edin ve bunları kaldırın. kafesin içine bir gergin pamuk koyun ve 30 ° C inkübatör kafesi bırakın. Uygun zaman penceresi sonra, pamuk embriyo toplama için hazır olacak. </li><li> Katyarısında siyah inşaat kağıt (A4 boyutunda) bir parça bir kırışık oluşturabilir ve sonra açılmak. </li><li> kafes uzanan pamuk çıkarın. pamuk gelen yetişkin çıkarın ve kafes içine geri koyun. </li><li> çok yavaşça gergin pamuk sıkarken, yumurta, siyah kağıda düşürdüm ince pamuklu iplikler halinde ayrı yavaşça gözyaşı. NOT: D. maculatus embriyolar pamuk görmek kırılgan ve sert. Çok sıkı bir pamuk topu tutan eğer kolayca ezilebilir. </li></ol> 3. dsRNA Hazırlık <ol><li> DsRNA Sentezi için DNA şablonu hazırlama <ol><li> 4 başlat - her ikisi de 5 de T7 hızlandırıcı sekanslar ihtiva eden primerler kullanılarak 6 50 ul PCR reaksiyonları 'üreticinin protokolüne uygun olarak, DNA şablonu amplifiye edilmesi için sona erer. </li><li> imalatçının talimatları izlenerek bir ticari bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak. DNA örneğinin ideal nihai konsantrasyonu ≥ olduğunu100 ng / ml. </li></ol></li><li> Enjeksiyon Tampon hazırlanması <ol><li> Enjeksiyon tamponu 100 ml hazırlama (0.1 mM NaH 2 PO 4, 5 mM KCI). 5 M NaOH ile 6.8'e pH ayarlayın. </li><li> -20 ° C'de saklayın alikotları. </li></ol></li><li> dsRNA sentezi <ol><li> ~ Reaksiyon başına 500 ng şablon kullanılarak, buz üzerinde 0.2 mi PCR tüpü içinde reaksiyonu başlatacak ve imalatçının talimatları izlenerek, T7 polimeraz, bir in vitro transkripsiyon reaksiyonu yürütmek. </li><li> gece boyunca 37 ° C'de tüp inkübe edin. </li><li> üreticinin talimatlarına aşağıdaki DNaz DNA şablonu, sindirmek. </li><li> 94 ° C'ye kadar tüp ısı ve 3 dakika boyunca 94 ° C'de tutun. </li><li> Bu 1 saat sonra 45 ° C'ye ulaşana kadar dsRNA tavlanması için yavaşça 1 ° C / dk, boruyu soğutulur. NOT: 3.3.5 ile 3.3.2 PCR yapılabilir adımlar. </li><li> dsRNA çökelti etanol, 280 ulReaksiyonun RNaz içermeyen su için 20 ul 300 ul bir son hacme kadar ayarlayın. 3 M NaOAc (pH 5.2) ve etanol içinde 650 | il 30 ul ekle. bir gecede -20 ° C derin dondurucuda tüp yerleştirin. </li><li> 4 ° C'de 30 dakika boyunca 15.682 x g'de santrifüj işleminden geçirilmesinden sonra,% 70 etanol ile dsRNA pelet yıkayın. Kuru pelet ve enjeksiyon tampon ul 20 içinde çözülür. </li><li> 260 bir spektrofotometre kullanılarak dsRNA'nın konsantrasyonu ölçümü. 5 ug / ul - İdeal konsantrasyon 3'tür. 30 dakika süre ile 90 V bir% 1 agaroz jeli üzerinde dsRNA 1:25 seyreltme 5 ul çalıştırarak kalitesini kontrol edin. beklenen boyutta tek bir bant kolaylıkla görülebilir. </li><li> -20 ° C veya altında dsRNA saklayın. NOT: Her RNAi demonte deney için, çalışılan süreci etkilemesi beklenmektedir olmaz bir denetim dsRNA içerir. GFP dsRNA çoğu deneyler için mükemmel bir kontroldür. Hazırlayın ve experime kontrol dsRNA yan yana enjektental dsRNA'nın. </li></ol></li></ol> Mikropüskürtücü ve Mikromanipülatör 4. Montaj NOT: Şekil 3 bakınız. <ol><li> pnömatik pompa aracının basınç girişine azot veya diğer hava kaynağını bağlayın. pnömatik pompa mevcut değilse, ince boru bağlı bir 50 ml şırınga ile basınç uygulanır. </li><li> çıkarma basınç akışını kontrol etmek için pompanın uzaktan konnektörüne bir ayak anahtarı bağlayın. </li><li> tüp ile pompanın çıkarma basınç portuna bir cam kılcal tutucu takın. </li><li> Bir mikroskop yakın bir mikromanipülatör kılcal tutucu sabitleyin. </li></ol> 5. Embriyonik RNAi Not: Şekil 4, D. maculatus embriyonik RNAi bir akış şemasını göstermektedir. <ol><li> eRNAi hazırlanması <ol><li> Petri kabı kapağı (90 mm çapında) toplama bir embriyo hazırlayın. c siyah filtre bir parça kağıt yerleştirinKapağın iç bitti. siyah kağıt üzerinde standart bir mikroskop lamı koyun. </li><li> Enjeksiyon tamponu ile uygun bir konsantrasyona kadar dsRNA seyreltilir. İlk deneyler için 3 ug / ul - 2 kullanın. Her zaman enjeksiyondan önce buz üzerinde dsRNA tutun. </li><li> iyice karıştırın dsRNA ve pipet yavaşça birkaç kez 01:40 seyreltme gıda boyası ekleyin. </li></ol></li><li> Enjeksiyon için toplanıyor Embriyolar NOT: 25 ° C'de, embriyoların 6 çekirdekleri - 8 saat Yumurta Döşeme sonra (AEL) 53 çevre yumurtaya doğru göç ederler. 10 saat AEL 53 - Bir hücresel blastoderm 8 içinde kurulmuştur. 3 saat AEL embriyolar kullanım 53 için önerilen - sağlamak için hücresel blastoderm aşamasında önce embriyolar 0, enjeksiyon için kullanılır. cam kapilerleri iyi durumda olup olmadığını Embriyo toplama, hazırlama ve enjeksiyon genellikle az 2 saat sürebilir. Bu nedenle, tüm süreç 5 saat AEL içinde tamamlanabilir. <ol><li> adımlarda açıklandığı gibi embriyolar toplayın 2.2-2.5. </li><li> Petri kabı kapağı toplama içine embriyo transferine siyah inşaat kağıt dokunun. </li><li> slayt kenarı boyunca çift taraflı bant yapıştırın. </li><li> Bir boya fırçası kullanarak, kenarında anterior ve posterior ucu ile slayt kenarına dik kasete embriyolar hizalayın. ortalama yarım ideal arka sonunda enjekte edilecektir böylece üzerinde, erken embriyo anterior ve posterior uçları kolayca ayırt olmadığını unutmayın. </li></ol></li><li> Kılcal cam içine dsRNA yükleniyor <ol><li> 20 ul Microloader pipet içine dsRNA 4 ul - 2 alın. </li><li> önceden çekilmiş cam boru içine ucu takın (iğne olarak da adlandırılır) ve yavaşça kapiller dsRNA solüsyonu pipetle. Mikropipet çektirmenin kullanarak ticari cam kılcal damarlardan iğneler hazırlayın. İdeal çekilmiş iğnenin bir örneği Şekil 5'te gösterilmektedir. uzunluğu ve iğne konik af optimize edilmesi gerekebilirter enjeksiyon denemeleri. </li><li> kılcal cam tutucu içine cam kapiller sabitleyin. </li><li> mikromanipülatör içine kılcal tutucu monte edin. </li></ol></li><li> Embriyolar içine dsRNA enjekte <ol><li> Dikkatle diseksiyon mikroskobu sahneye embriyolar ile slayt aktarın. </li><li> alan ve odak mikroskop merkezine bir embriyo getirmek için slayt taşıyın. </li><li> mikroskop içine bakarken mikromanipülatör ile kılcal ucu yerleştirin. satırdaki ilk embriyonun sonuna yakın ucu getir. </li><li> azot ya da diğer hava beslemesini açın. </li><li> vakum selenoid giriş seçme anahtarını ayarlayın. </li><li> 15 psi - 10 çıkarma basınç regülatörü ayarlayın. aparat bağlı basıncını ayarlayın. </li><li> Gerekirse kılcal açın. ucu açık olduğunda, renkli dsRNA çözüm ucu dolduracaktır. </li><li> e delinme ileri kılcal ucu Taşımbryo. Basınç ayarı idealdir ise, hiçbir embriyonik sıvı kılcal akacaktır. </li><li> çözümün uygun bir miktar çıkarılana dek embriyo içine dsRNA çözüm çıkarmak için ayak anahtarı Adım. Çözümün uygun ve uygun olmayan miktarlarda enjekte edildikten sonra Şekil 5 embriyo morfolojisi örneklerini gösterir. </li><li> ~ 2 saniye embriyo içinde kılcal ucu tutun ve sonra çıkarın. </li><li> Bir sonraki embriyonun kılcal hareket ettirin ve tekrar 5.4.8 adımları - tüm embriyolar enjekte kadar 5.4.10. Tıkanmış veya sonları alırsa cam kapiller değiştirin. </li></ol></li><li> Enjeksiyon sonrası kurtarma ve Kuluçka <ol><li> Enjeksiyondan sonra, bir Petri kabındaki slayt yerleştirin. </li><li> Petri kabı ıslak pamuk ekleyin. pamuk slayt dokunmasına izin vermeyin. </li><li> Petri kabı Kapak ve filmi sızdırmazlık ile sarın. Enjekte dsRNA, konsantrasyon, tarih, saat, sayısı ve adı ile çanak Etiketembriyolar. </li><li> Embriyoların yumurtadan kadar 30 ° C inkübatör Petri kabı yerleştirin. </li></ol></li></ol> 6. Ebeveyn RNAi <ol><li> PRNAi için Pupalar Ayırma <ol><li> koloniden pupa toplayın. </li><li> Sıralama erkek ve mikroskop altında dişi pupa (Şekil 6). Resim birleşme enjeksiyondan önce cereyan etmesini sağlamak üzere 30 ° C kuluçka makinesi içinde, iki ayrı bir Petri tabaklarına tutun. </li><li> eclosed yetişkinler için her gün kontrol edin. 30 ° C 'de 7 gün - pupa devresi, genellikle 5 alır. </li><li> Aktarım eclosed erkek ve kadın iki ayrı Petri kapları (Şekil 6) ve enjeksiyon için hazır olana kadar her gün onları kedi maması yem. </li><li> Yeterince kadın ve uygun yaşta erkek var bir kez enjeksiyon geçin. post-eclosion Dişiler 4 ila 8 gün en iyisidir. Tipik bir analiz için 8-12 kadın kullanılmaktadır. Erkeklerin eşit sayıda 54 çiftleşme için gereklidir. </li></ol></li> Kadın Karın içine dsRNA enjekte <ol><li> buz (5.1.2 ve 5.1.3) üzerinde dsRNA hazırlayın. </li><li> 10 ul şırıngaya 32 gauge iğne takın. </li><li> CO 2 sahnede kadın Anesteziyoloji. </li><li> herhangi bir hava almadan enjektöre dsRNA çözüm yükleyin. </li><li> Bir yandan bir kadın ventral tarafı yukarı tutun ve diğer şırınga tutun. </li><li> Yavaşça iğne ucu ile sternites 2 ve 3 arasında segmacoria (membran) nüfuz eder. Şekil 7, enjeksiyon sırasında bir dişi göstermektedir. İğne kolaylıkla dokuya nüfuz etmezse, açı iğne yukarı ve yavaş yavaş aşağı doğru bastırın. vücuda iğne yaklaşık 2 mm yerleştirin. </li><li> yavaş yavaş dişi başına ~ 2 ul enjekte dalgıç iterken şırınga ölçeğini kontrol edin. </li><li> enjekte ettikten sonra, dişinin karın çıkarmadan önce en az 5 saniye boyunca hareketsiz iğne tutun. </li><li> (Petri kabı enjekte kadın aktarın90 mm çap) ve kedi maması ile beslenirler. </li><li> dsRNA adı, enjekte edilen miktarın, tarih ve dişilerin sayısı ile Petri kabı etiketleyin. </li></ol><li> Enjeksiyon sonrası kurtarma ve Çiftleşme <ol><li> 30 ° C inkübatör Petri kabı kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> 24 saat sonra, transfer mini kafese kadın enjekte edilmiştir. </li><li> Kafesin uninjected genç erkeklerin eşit sayıda ekleyin ve kafesi etiketleyin. </li><li> kafesin içine kedi maması ile tartı tekne ekleyin. </li><li> birleşmesine olanak tanımak için 30 ° C kuluçka makinesi içinde kafes bırakın. 24 saat sonra, dişiler yumurtalarını bırakmak için başlamalı ve embriyolar günlük veya gerekli zaman aralıklarında alınabilir. </li></ol></li></ol> 7. Fenotipik Analizi sonra RNAi NOT: yumurta 50 yumurtadan 30 ° C'de, o ~ 55 saat sürer. <ol><li> eRNAi Canlılık Analizi <ol><li> toplam nu için yumurtadan larva sayısını karşılaştırarak ambar oranını hesaplamakenjekte edilen embriyoların mber. embriyolar zarar veya enjeksiyon prosedürü tarafından öldürülen edilebilir bir negatif kontrol enjeksiyonu dahil emin olun. % 60 - Tipik ambar oranları% 30 arasında değişmektedir. çıkmamış yumurta yeme yumurtadan larva sakının. </li></ol></li><li> pRNAi Canlılık Analizi NOT: kadın canlılığı RNAi tarafından hedeflenen gen tarafından etkilenirse, dişiler belirli dsRNA enjekte değil negatif kontrol dsRNA ölmeye başlayacak. yumurta üretimi veya yumurtlama etkilenirse, dişiler kısmi veya tam kısırlığa sergileyecek. negatif kontrollere kıyasla kadın yaşamını Puan ya da deney ve kontrol kadın (7.2.3) tarafından atılmıştır yumurta sayısını karşılaştırın. <ol><li> Adım 2.2 Aşağıdaki embriyo toplama ayarlayın. </li><li> 2,5-24 saat sonra, adım 2.4 Aşağıdaki embriyolar toplar. </li><li> embriyo sayısını saymak. </li><li> 90 mm petri embriyoların transferi. embriyoların hedeflenen gen, toplama tarihi ve numarası ile Petri kabı etiketleyin. </li> onlar yumurtadan kadar 30 ° C inkübatör embriyolar kuluçkaya yatmaktadır. çıkmamış embriyolar üzerinde yumurtadan larva besleme yana, forseps (Tartışma) kullanılarak çıkmamış embriyolardan Petri kabı sık sık ve ayrı yumurtadan larva kontrol edin. </ol></li><li> yumurtadan embriyoların sayısını ve ambar oranını hesaplamak. </li></ol><li> Yumurtadan larva içinde Kütikül Kusur incelenmesi <ol><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde Yumurtadan Çıkmış Larvalarına toplayın. </li><li> Bir duman başlığı içinde, sabitleme çözeltisi 1 ml. </li><li> Çözelti larva doku nüfuz için en az bir gece süreyle 4 ° C'de mikrosantrifüj tüpü terk. </li><li> görselleştirmek için, mümkün olduğu kadar tüpten kadar fiksatif çıkarın. </li><li> PBST ile durulayın larva en az üç kez. </li><li> PBST sonu olmayan bir P-1000 pipet kullanarak bir çok kuyu cam plaka Transfer larva bunu genişletmek için kesti. </li><li> bir mikroskop altında, kusurları incelemek için forseps kullanarak larva germek. bent sabitleştirici vücutları sözleşme olarak kusurları incelemek için larva germek için kritik öneme sahiptir. </li></ol></li><li> Çıkmamış Larva içinde Kütikül Kusur incelenmesi Not: Bu prosedür özellikle kuluçka için hayatta olmayan embriyolar için, erken embriyonik fenotip incelenmesi için yararlıdır. <ol><li> pRNAi için Petri kabı (7.2.4) içine PBST ekleyin ve son kesti ile P-1000 pipet kullanarak 1.5 ml mikrosantrifüj tüp çıkmamış embriyolar transfer. eRNAi için mikroskop lamı kapalı Petri kabındaki (5.5.4), fırça çıkmamış embriyoların içine PBST ekleyin ve bir mikrosantrifüj tüp aktarabilirsiniz. </li><li> Sabitleme Çözümü ile embriyolar Fix ve adımları 7.3.2 Aşağıdaki görselleştirme PBST ile durulayın - 7.3.6. </li><li> forseps kullanarak, PBST bir mikroskop altında yumurta kabuğu dışarı embriyolar incelemek. </li><li> Lütfen bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü (• Her bir tüp içinde embriyo 200 ul) embriyoların transferi. </li><li> kadar sol kaldırmümkün Katkı. </li><li> % 90 Laktik asit /% 10 EtOH 1 ml ilave edilir. En az gece boyunca 60 ° C'lik bir kuluçka makinesi içinde santrifüj tüpü boş. Not: Embriyolar birkaç gün boyunca 60 ° C 'de bırakılabilir. </li><li> embriyolar monte etmek için, uç kesti ile P-1000 pipet kullanarak bir mikroskop lamı üzerine onları pipetle. </li><li> El ile ideal bir yönelime forseps ile embriyoların yerleştirin. </li><li> Bir kapak kayma ile embriyolar Kapak ve DIC kullanarak mikroskop altında görselleştirmek. </li></ol></li><li> Hücresel ve Moleküler Hataları incelenmesi Not: Bu yordam manikür kusurları eşlik etmez manikür fenotipleri veya letalitesinin yatan nedenleri araştırmak için yararlıdır. <ol><li> pRNAi için uygun gelişim aşamasında pamuk topları ayrı embriyolar ve embriyo toplama sepet içine aktarabilirsiniz. Toplama sepeti, aynı veya Drosophila embriyo koleksiyonları için kullanılana benzer olabilir. <ol><li> Yapmakkaldırıldı şişenin dibinde ile 25 ml'lik plastik sintilasyon flakon yumurta sepeti ve kapağın (kabaca 1 cm çapında) dışında bir daire kesilmiş. süper ince bir daire kapağının iç çapı yaklaşık 2.5 cm örgü yerleştirin ve ardından parıldama ampulünün vida ve baş aşağı kullanın. </li><li> Embriyolar yıkanır sonra ağ kolayca çıkarılabilir de, örgü yapışma bir embriyo kurtarma su ile mikrosantrifüj tüpü içinde örgü bırakın. </li></ol></li><li> eRNAi için, uygun bir aşamada, bir Petri kabı PBST ekleyin. mikroskop lamı kapalı embriyolar fırçalayın ve bir embriyo toplama sepeti aktarabilirsiniz. NOT: Fiksasyon, in situ hibridizasyon, antikor boyama ve nükleer boyanma protokolleri Xiang vd bulunabilir. 2015 53. </li></ol></li>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Gelişmiş model sistemler (fareler, sinekler, solucanlar) az sayıda 20. yüzyılda geliştirilen iken, 21. yüzyılın yeni hayvan sistemlerinin bir dalga tüm dünyada laboratuvarlarında geliştirilen gördü. Bu yeni sistemler bilim yalnızca &#39;standart&#39; modeli sistemleri kullanılarak tanınacak olamaz karşılaştırmalı evrimsel soruları için izin verir. yeni modellerin Bu dağıtım laboratuvar kültürleme, gen tanımlama ve yeni türlerde fonksiyonel yaklaşımları yöntemleri hızla geliştirilmesini gerektirmekt...

1998, yangın ve Mello çift zincirli RNA (dsRNA) Caenorhabditis elegans 1 gen işlevinin engellenmesi uyarabilir bildirmiştir. DsRNA ile tetiklenen Bu yanıt bir RNA interferans (RNAi) olarak adlandırılmıştır, ve RNAi aracılı gen susturma hayvan, bitki ve mantar 2-7 korunmuş olduğu bildirilmiştir. Bitkiler ve bazı hayvanlarda, RNAi fonksiyonları sistemik, yani etkisi (8-10 gözden) dsRNA doğrudan tanıtıldı değil diğer hücre / dokulara yayılabilir. Bilim adamları, böylece doğrudan (11-14 gözden) genomu manipüle etmeden gen fonksiyonu aşağı vurma, ilgi genleri hedef dsRNAs tasarlayarak bu endojen hücresel RNAi tepkisinin kullanımı yaptık. RNAi aşağıdaki avantajları nedeniyle fonksiyonel çalışmalar için güçlü bir araçtır. İlk olarak, daha az gen sekansı bilgileri ile bir gen RNAi kullanılarak hedeflenebilir. Bu st için özellikle önemlidirgenomik veya transkriptomik verileri eksik olmayan model organizmaların udies. İkinci olarak, RNAi yanıtı sağlam sistemik organizmalarda, RNAi aracılı gen yok etme hemen hemen herhangi bir gelişme aşamasında gerçekleştirilebilir. Bu özellik, pleitropik genlerin işlevini çalışmak için çok yararlıdır. Üçüncü olarak, bazı durumlarda, RNAi etkileri fenotipleri yavrular 15,16 görülmektedir, öyle ki gonadlar ve soyu, yayıldı. Tek bir enjekte ebeveyn tarafından üretilen çok sayıda yavru yumurta doğrudan manipülasyonu olmadan muayene edilebilir ebeveyn RNAi (pRNAi) olarak bilinen bu fenomen, embriyonik gelişmeyi etkileyen genler için özellikle avantajlıdır. Bu nedenlerden dolayı, pRNAi tercih edilen bir yöntemdir. pRNAi etkisiz, ancak oogenez için gerekli olan genlerin, örneğin, daha sonra embriyonik RNAi (eRNAi) kullanılmalıdır. Dördüncü olarak, RNAi mutlaka kusurlar zayıf üretilmesi için dsRNA miktarı aralığında değişebilir teslim edilen bir alelik dizi eşdeğer oluşturmak için kullanılabilir. fenotipleri Böyle bir derece geni ölümcül bir kompleks süreci ve / veya fonksiyon tam kaybı söz konusu olduğunda gen fonksiyonu anlamak için yararlı olabilir. Beşinci olarak, dsRNA teslim özellikle sağlam sistemik RNAi yanıtları gösteren hayvanlarda genellikle kolay ve mümkündür. dsRNA mikroenjeksiyon 1,5, beslenme / yutma 17,18, ıslatma, 19,20 ve virüs / bakteri aracılı teslim 21,22 sokulabilir. Altıncı, bazı gen hedefleme / düzenleme yöntemlerin aksine, mutasyonu taşıyan organizmalar için ekrana veya RNAi kullanırken homozigotlarını üretmek için genetik haçlar yürütmek için gerek yoktur. Bu nedenle, gen fonksiyonu incelemek için pek çok teknikler ile karşılaştırıldığında, RNAi ucuz, hızlı ve büyük ölçekli ekranlar 23-25 için uygulanabilir. RNAi geniş bir kullanım Beyon çalışma için uygun türlerin yelpazesini genişleterek, organizmaların geniş bir fonksiyonel çalışmalar yapmak için bir araç sağlarGenetik araçlar geliştirilmiştir olan geleneksel model sistemler d. Örneğin, sigara modeli sistemleri kullanılarak çalışmalar farklı gelişim modları temsil veya farklı morfolojik özellikler 26-29 sergileyen türlerden ortologlarda işlevlerini karşılaştırarak genler ve gen ağlarının evrimi anlayışlar vermek zorundadırlar. Bu tür çalışmalar uygulamalı ve temel hem de araştırma için etkileri olan, biyolojik çeşitliliğin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Gezegendeki en büyük hayvan grubunda olmak, böcekler mekanizmaları altta yatan çeşitliliğini keşfetmek için büyük bir fırsat sağlamaktadır. Ayrıca, böcekler, genellikle küçük, kısa yaşam döngüleri, yüksek doğurganlığını var ve laboratuarda arka kolaydır. Son yirmi yılda, RNAi başarıyla Diptera (gerçek sinekler) 5, Lepidoptera (Kelebekler) 30 olmak üzere, emirleri kapsayan böceklerde tatbik edilmiştir, Coleoptera (böcekleri) 16,31, Hymenoptera (sawfyalan, Arı, karınca ve arılar) 32, Hemiptera (gerçek böcek), Isoptera (termitler) 34, Blattodea (hamamböceği) 35, Orthoptera (cırcır, çekirge, çekirgeler ve çekirgeler) 36 ve Phthıraptera (bitler) 37. RNAi başarılı bir uygulama, ekdison 42 sinyalizasyon, erken embriyogenez desenleme çalışmaları için fonksiyonel verileri (ön-arka eksen 32, dorsal-ventral eksen 28, segmentasyon 26,38), cinsiyet tayini 39,40, kitin / manikür biyosentezini 41 sağladı sosyal davranış 43, ve daha fazlası. Farklı böcek türleri için geliştirilmiş RNAi yöntemler de (44-46 gözden) haşere kontrolü için yararlı olması muhtemeldir ki ek bir fayda olabilir. RNAi etkileri olmayan korunmuş bölgeler hedefleme için seçilen sürece, gene özel ve türe özgü olacaktır. yaşaması için hayati genleri hedef bal arıları ve ipek böceği gibi yararlı böcek türlerinin, içinenfeksiyon kontrol etmek için virüs veya parazitler bu türlerin 47,48 korumak için yeni bir strateji sağlayabilir. Dermestes maculatus (D. maculatus), ortak adı gizlemek böceği, Antarktika hariç tüm dünyada dağıtılır. Bir holometabolous böcek gibi, D. maculatus yaşam döngüsü embriyonik larva, pupa ve erginleri (Şekil 1) içerir. O eti beslenir, çünkü D. maculatus ölü hayvanları iskeletini için müzelerde kullanılan ve adli entomologlar ölüm 49,50 zamanını tahmin etmek için kullanabilirsiniz. D. maculatus gövdeleriçin, kurutulmuş et, peynir ve pupa / diğer böceklerin koza de dahil olmak üzere hayvansal ürünlerde beslenir ve böylece hane zarar, depolanmış gıda ve ipek, peynir ve et endüstrileri 51,52 neden olur. Bu böceği de RNAi uygulayarak ekonomik etkisini en aza indirmek için etkin ve çevre dostu bir şekilde sağlayabilir. Bizim laboratuvar, yeni bir m olarak D. maculatus kullandıodel böcek segmentasyonu 53 incelemek için. O kısa ve uzun mikrop gelişimi arasındaki geçişi incelemek için kullanışlı bir tür yapma, bir ara-germ geliştiricisi olarak laboratuvar yetiştirme mükellef olmasının yanı sıra, D. maculatus temel araştırmalar için ilgi çekicidir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg"> Şekil 1: D. maculatus Yaşam Döngüsü. Belirtildiği gibi farklı yaşam evrelerinde D. maculatus Fotoğraf,. yetişkine yumurtadan ömrü daha düşük sıcaklıklarda, üç ila 30 ° C 'de hafta ama daha uzun sürer. (A, K) Yeni bırakılmış embriyolar yaklaşık olarak boyuna 1.5 mm, açık sarı ve oval beyazdır. Embriyo ~ 30 ° C 'de 55 saat sürer. (B, C ve G) Larva koyu pigmentli çizgili ve kıl ile kaplıdır. Larva 1 üzerinde cm'ye kadar uzatabilirsiniz çevre ve uzunluklarına bağlı olarak birkaç instars geçmesi. (D, H) (E, ben), koyu pigmentasyon yetişkin böceği vücut üzerinde görünür. Yetişkin birkaç ay kadar yaşayabilir ve bir kadın yaşamı boyunca embriyo yüzlerce düzenleyebilirsiniz. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Daha önce, RNAi D. maculatus 53 gen fonksiyonunu aşağı vurma etkili olduğunu göstermiştir. İşte laboratuvarda D. maculatus kolonileri yetiştirme deneyim embriyonik ve ebeveyn hem RNAi set-up, enjeksiyon, enjeksiyon sonrası bakım ve fenotipik analizi için adım-adım protokolleri ile birlikte paylaşılır. Burada tanıtılan dsRNA aracılı gen demonte ve analiz yöntemleri D. maculatus soruları ele almak için ayrıntılı bilgi sağlar, fakat aynı zamanda fo potansiyel öneme sahip değilr olmayan diğer modeli böceği / böcek türlerinde RNAi uygulamak.

<table><tbody><tr><td>Dermestes maculatus canlı böcekler</td><td>Laboratuvarımız veya Carolina Biyolojik Kaynağı</td><td>#144168</td><td>Laboratuvar suşumuz COI barkodlaması ile doğrulandı; Carolina'dan gelen suş varyasyonu göz ardı edilemez</td></tr><tr><td>Islak kedi maması</td><td>Süslü Ziyafet</td><td></td><td>Soslu et parçaları. Çoğu evcil hayvan maması ve marketten satın alabilir</td></tr><tr><td>Kuru köpek maması</td><td>Purina Puppy Chow</td><td></td><td>Çoğu evcil hayvan maması ve marketten satın alabilir</td></tr><tr><td>Böcek kafesi (orta boy, 30,5 x 19 x 20,3 cm)</td><td>Exo Terra</td><td>PT2260</td><td>Koloni bakımı için. Gerekirse daha büyük kafes kullanabilir</td></tr><tr><td>Böcek kafesi (boyut mini, 17,8 x 10,2 x 12,7 cm)</td><td>Exo Terra</td><td>PT2250</td><td>Embriyo toplama için</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk topu</td><td>Fisher</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 transkripsiyon kiti</td><td>Fisher</td><td>AM1334</td><td>40 reaksiyon için</td></tr><tr><td>Pnömatik pompa</td><td>WPI</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal tutucu</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>NARISHIGE</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Siyah filtre kağıdı (90&nbsp; mm)</td> <td>VWR</td><td>28342-010</td><td></td></tr><tr><td>Gıda boyası (yeşil)</td><td>McCormick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal</td><td>Hilgenberg</td><td>1406119</td><td></td></tr><tr><td>İğne çektirmesi (mikropipet çektirmesi)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop cam slayt</td><td>WorldWide Yaşam Bilimleri Bölümü</td><td>41351157</td><td></td></tr><tr><td>Sızdırmazlık filmi (Parafilm M)</td> <td>Fisher</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Model 801 Şırınga (10&nbsp; &mikro; l)</td> <td>Hamilton</td><td>7642-01</td><td></td></tr><tr><td>İğne (32 gauge) &nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>Fiksasyon Çözümü (Pampel's)</td><td>BioQuip Products, Inc.</td><td>1184C</td><td>Toksik, çeker ocakta kullanılması gerekiyor</td></tr><tr><td>Forcep (DUMONT #5)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Kapak kaymağı (24 x 50 mm, No. 1.5)</td><td>Globe Scientific</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader pipet ucu</td><td>Fisher</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Embriyo enjeksiyonu için diseksiyon mikroskobu</td><td>Leica</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>Larva fenotipik görselleştirme için diseksiyon mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discover. V12</td><td></td></tr><tr><td>DIC mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Görüntüleyici. M1</td><td></td> Sınıfı</tr></tbody></table>

yetiştirme ve gizle böcek rna aracılı gen demonte çift sarmallı, dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Genomikteki ilerlemeler, biyoçeşitliliği benzeri görülmemiş bir ölçekte araştırma olasılığını artırdı. Bununla birlikte, gen fonksiyonunu incelemek için araçlar olmadan tek başına dizi bilgilendirici olmayacaktır. Bu nedenle, laboratuvarlarda yeni model sistemlerin kurulması ve fonksiyonel çalışmaların yürütülmesi için araçların geliştirilmesi ve paylaşılması, genomiğin gücünden yararlanmak için çok önemlidir. Coleoptera (böcekler) en büyük böcek grubudur ve gezegendeki hemen hemen her tür habitatı işgal eder. Temel araştırmalar için ideal modeller sağlamanın yanı sıra, böcekler üzerinde yapılan çalışmalar, genellikle hanehalklarının, tarımın ve gıda endüstrilerinin zararlıları oldukları için haşere kontrolü üzerinde etkilere sahip olabilir. D. maculatus laboratuvar kolonilerinin yetiştirilmesi ve bakımı ve D. maculatus'ta dsRNA aracılı girişimin gerçekleştirilmesi için ayrıntılı protokoller sunulmuştur. Aparat kurulumu, hazırlama, enjeksiyon ve enjeksiyon sonrası iyileşme dahil olmak üzere hem embriyonik hem de ebeveyn RNAi prosedürleri açıklanmaktadır. Yumurtadan çıkmamış larvalar için canlılık, desen kusurları ve yumurtadan çıkmamış larvalar için kütikül preparatları dahil olmak üzere embriyonik fenotipleri analiz etmek için yöntemler de sunulmaktadır. Bu tahliller, moleküler belirteçler için in situ hibridizasyon ve immün boyama ile birlikte, D. maculatus'u temel ve uygulamalı araştırmalar için erişilebilir bir model sistem haline getirir. Ayrıca, ortaya çıkan diğer böcek model sistemlerinde prosedürler oluşturmak için yararlı bilgiler sağlarlar.

Yazarların laboratuar böcekler 53,55 yılında segmentasyon düzenleyen genlerin fonksiyonel evrimini incelemek için RNAi teknolojisini kullandı. Tüm böcekler Parçalara edilirken, bu süreci düzenleyen genlerin böcek radyasyonlar 26,38,56-63 sırasında ayrılmaktadır görünmektedir. Drosophila genetik ekranlar vücut segmentlerinin 64-70 oluşumunu teşvik sorumludur dokuz çift-kural segmentasyon genlerinin bir dizi belirledi. Burada, bu genlerin birinin o...

Burada, laboratuarda bir ara-germ böceği, Dermestes maculatus (D. maculatus) yetiştirme için protokolleri sunuyoruz. Biz de bu türün gen fonksiyonunu incelemek için embriyonik fenotipleri analiz etmek için embriyonik ve ebeveyn RNAi için protokolleri ve yöntemleri paylaşır.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli böcek dallarını temsil eden ve temel ve uygulamalı araştırma sorularının incelenmesini kolaylaştıran yeni bir böcek model sistemi olan Dermestes maculatus'taki gen fonksiyonunu araştırmaktır. Bu yöntem, Dermestes embriyolarında ve yetişkinlerde gen fonksiyonunu test etmeyi mümkün kılarak gelişim biyolojisi, evrimsel biyoloji ve diğer alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, RNA girişiminin, tam bir genom dizisinin yokluğunda bile, yalnızca dizi bilgisine dayalı olarak herhangi bir geni hedeflemek için kullanılabilmesidir.Burada tanıtılan yöntemler sadece Dermestes'teki gen fonksiyonunu incelemek için bir yaklaşım sağlamakla kalmaz. Ayrıca yeni böcek model sistemleri geliştirmek ve potansiyel olarak böcek zararlılarını kontrol etmek için de uygulanabilirler. Bir D.maculatus için bir yetiştirme kafesi hazırlamak için, önce orta büyüklükte bir böcek kafesine ince bir tabaka odun talaşı yayın.Larvaların pupa olacağı bir ortam sağlamak için kafese bir strafor bölümü yerleştirin. Kafese yirmi ila elli yetişkin böcek veya geç instar larvaları ekleyin. Islak kedi mamasını bir besin kaynağı olarak bir Petri ka

rearing-double-stranded-rna-mediated-gene-knockdown-hide-beetle

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu protokolü biz bir ile RNAi-aracılı gen susturulması...

RNAi-aracılı Gene Nakavt ve<em&gt; In Vivo</emYetişkin Kadınlar&gt; diürez Testi<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Sivrisinekler

Bu protokol, biz aynı anda bal arıları iki gen (çift gen demonte) bastırmak iki strateji açıklar. Sonra bal arısı tat algısı çift gen demonte etkisini incelemek için burnumun uzantısı yanıt (PER) testi nasıl kullanılacağı mevcut.

Bal Arısı RNAi-aracılı Çift Gen demonte ve tat Algı Ölçüm (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

DsRNA C. beslerken elegans büyük ölçekli besleme ekranlar için geçerli protokoller değişken devirme verimleri elde gen fonksiyonunu değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Bu gen ifadesinin oldukça etkili ve yeniden üretilebilir bir devirme ile sonuçlanan büyük ölçekli RNAi besleme ekranları yerine getirmek için geliştirilmiş bir protokol açıklar.

Büyük ölçekli Gen demonte olarak<em&gt; C. elegans</em&gt; Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma

RNA enterferans (RNAi) tabanlı gen demonte teknikleri Tribolium araştırma özünde vardır. Burada, biz Tribolium castaneum'ların bizim larva RNAi tekniğinin bir bakış sağlar. Larva RNAi araştırmacılar farklı bağlamlarda gen fonksiyonlarını incelemek için izin, kayıp fonksiyon-fenotiplerine hızlı erişim sağlayan basit, ama güçlü bir tekniktir.

Kırmızı Un Beetle Larva RNA Girişim, Tribolium castaneum

Burada larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri / kitosan kullanımı yoluyla hastalık taşıyıcıları sivrisinek gen fonksiyonunun inhibe edilmesine müdahale için bir prosedür tarif eder.

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

RNA girişimi (RNAi), gen fonksiyonunu ortaya çıkarmak için son derece değerli bir araçtır. Bununla birlikte, yetişkinlik öncesi aşamalarda RNAi kullanarak genleri hedefleme yeteneği, başlıca insan sıtma vektörü Anopheles gambiae'de sınırlıdır. Pupa gelişimi sırasında doğrudan enjeksiyon yoluyla gen fonksiyonunu azaltmak için bir RNAi protokolü tanımladık.

içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

Burada kriket yumurtaları enjekte etmek için bir protokol salıyoruz, kriketteki birçok deneyde temel bir yöntem olarak hizmet veren bir teknik, RNA paraziti ve genomik manipülasyon dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere.

Enjekte Gryllus bimaculatus Yumurta

RNA paraziti, gen ekspresyonunu belirli gelişimsel evrelerde manipüle etmek için yaygın olarak uygulanabilir ve güçlü bir tekniktir. Burada, sudalış böceği Thermonectus marmoratusbu tekniğiuygulamak için gerekli adımları açıklar , gen dizilerinin edinimi gelen yapı veya davranışı etkileyen genlerin yıkılması.

Belirli Gelişimsel Zaman Noktalarında Gen İfadesi Manipüle Etmek Için Güçlü Bir Araç Olarak Su Böcekleri RNA Girişim

Biz sipariş Odonata (yusufçuk ve damselflies) mavi kuyruklu damselfly kullanarak(Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) ve pied skimmer yusufçuk(Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera) kullanarak sipariş Odonata böceklerde elektroporasyon aracılı RNA girişim için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Odonata'da Elektroporasyon aracılı RNA Girişim Yöntemi

Burada CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi tarafından oluşturulan Helicoverpa armigera (Hübner) embriyo mikroenjeksiyonu ve nakavt mutant tanımlama protokolü sunulmaktadır. Mutant böcekler, in vivo'daki farklı genler arasında gen fonksiyonu ve etkileşiminin daha fazla araştırılmasına olanak tanır.

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

Mevcut protokol, P. americana'daki RNAi operasyon teknikleri için adım adım kılavuzları açıklamaktadır.

Amerikan Hamamböceğinde RNA Girişiminin Uygulamaları

Öğrenin Dermestes maculatus böceğinde RNA aracılı gen fonksiyonu incelemeyi. Bu yöntem embriyo ve yetişkinlerde gen fonksiyonunu test ederek gelişim ve evrim biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı, Dermestes maculatus

Daha fazla video keşfet