Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı, Dermestes maculatus

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli böcek dallarını temsil eden ve temel ve uygulamalı araştırma sorularının incelenmesini kolaylaştıran yeni bir böcek model sistemi olan Dermestes maculatus'taki gen fonksiyonunu araştırmaktır. Bu yöntem, Dermestes embriyolarında ve yetişkinlerde gen fonksiyonunu test etmeyi mümkün kılarak gelişim biyolojisi, evrimsel biyoloji ve diğer alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, RNA girişiminin, tam bir genom dizisinin yokluğunda bile, yalnızca dizi bilgisine dayalı olarak herhangi bir geni hedeflemek için kullanılabilmesidir.

Burada tanıtılan yöntemler sadece Dermestes'teki gen fonksiyonunu incelemek için bir yaklaşım sağlamakla kalmaz. Ayrıca yeni böcek model sistemleri geliştirmek ve potansiyel olarak böcek zararlılarını kontrol etmek için de uygulanabilirler. Bir D.maculatus için bir yetiştirme kafesi hazırlamak için, önce orta büyüklükte bir böcek kafesine ince bir tabaka odun talaşı yayın.

Larvaların pupa olacağı bir ortam sağlamak için kafese bir strafor bölümü yerleştirin. Kafese yirmi ila elli yetişkin böcek veya geç instar larvaları ekleyin. Islak kedi mamasını bir besin kaynağı olarak bir Petri kabına veya tartı teknesine koyun.

Kafesi file bir bezle örtün ve bir kuluçka makinesine yerleştirin. Embriyo toplamaya başlamadan önce, kafeste mevcut embriyo olup olmadığını dikkatlice kontrol edin ve çıkarın. Kafes temizlendikten sonra, gerilmiş bir pamuğu kafese yerleştirin ve koloniyi 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Uygun zaman penceresinden sonra, pamuğu toplayın ve mevcut yetişkinleri çıkarın ve tekrar kafese koyun. Bir parça siyah inşaat kağıdının üzerine, pamuğu nazikçe sıkıştırın ve yavaşça ince filament halinde yırtın, böylece mevcut yumurtalar siyah kağıdın üzerine düşer. Standart bir Petri kabı kapağı alın ve içini kaplamak için bir parça siyah filtre kağıdı kullanın.

Standart bir mikroskop lamının kenarı boyunca bir parça çift taraflı bant yapıştırın. Mikroskop slaytını Petri kabı kapağındaki siyah filtre kağıdına yerleştirin. Toplanan embriyoları içeren kağıdı alarak, embriyoları Petri kabı kapağına aktarmak için hafifçe vurun.

Bir boya fırçası kullanarak, embriyoları ön veya arka ucu kenara doğru olacak şekilde slayta dik olarak bant üzerinde hizalayın. RNAi'ye başlamak için önce 20 mikrolitrelik bir mikro yükleyici pipet ucuna 2-4 mikrolitre dsRNA alın. Ucu, iğne olarak adlandırılan önceden çekilmiş bir cam kılcal damara yerleştirin ve solüsyonu iğneye nazikçe pipetleyin.

İğneyi bir cam kılcal tutucuya sabitleyin ve ardından kılcal tutucuyu mikromanipülatöre monte edin. Daha sonra, embriyoların bağlı olduğu slaytı, diseksiyon mikroskobunun aşamasına dikkatlice aktarın. Bir embriyoyu alanın merkezine getirmek için slaydı hareket ettirin ve mikroskobu odaklayın.

Diseksiyon kapsamına bakarken, kılcal damarın ucunu mikromanipülatör ile konumlandırın. Ucu sıradaki ilk embriyonun sonuna yaklaştırın. Nitrojen veya hava beslemesini açın ve ardından solenoid giriş seçici anahtarını vakuma ayarlayın.

Cihaza bağlı olarak çıkarma basınç regülatörünü 10-15 psi'ye ayarlayın. Kılcal damarı açın ve renkli dsRNA çözeltisi enjeksiyona hazır olarak ucu dolduracaktır. Kılcal ucu ileri doğru hareket ettirin ve embriyoyu nazikçe delin.

İdeal basınç ayarları altında, kılcal damara hiçbir embriyonik sıvı akmaz. Uygun miktar dağıtılana kadar dsRNA'yı embriyoya atmak için ayak pedalına basın. Ucu embriyonun içinde yaklaşık iki saniye bırakın ve ardından dikkatlice çıkarın.

Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, slaytı bir Petri kabına yerleştirin. Tabağa ıslak bir pamuk topu ekleyin, slaytla temas etmemesine dikkat edin. Petri kabını örtün ve sızdırmazlık filmi ile sarın.

dsRNA tipi, konsantrasyonu, tarihi, saati ve enjekte edilen embriyo sayısı ile etiketleyin. Son olarak, çanağı embriyolar yumurtadan çıkana kadar 30 santigrat derecede bir kuluçka makinesine yerleştirin. pRNAi'yi gerçekleştirmek için önce koloniden pupa toplayın.

Erkek ve dişi pupaları iki ayrı tabağa ayırın ve bunları 30 derecelik bir Celcius inkübatöre yerleştirin. Kapalı böcekler için plakaları günlük olarak kontrol edin ve bu bireyleri erkek ve dişi yetişkinler için iki ayrı Petri kabına aktarın. Bu yetişkinleri besleyin ve enjeksiyona başlamak için yeterli yetişkin kapanana kadar plakaları her gün koruyun.

Yetişkin havuzu tamamlandıktan sonra, bir dişi böceği uyuşturun ve bir elinizle tek tek ventral tarafı yukarı kaldırın, şırıngayı diğer elinizle tutun. Sternit 2 ve 3 arasındaki segmacoria zarına nazikçe nüfuz edin. Şırınga ölçeğini kontrol edin ve dişi başına yaklaşık iki mikrolitre yavaşça dağıtın.

Enjeksiyondan sonra iğneyi en az 5 saniye sabit tutun ve ardından dikkatlice geri çekin. Enjekte edilen dişileri kedi maması içeren bir Petri kabına aktarın. Çanağı uygun şekilde etiketleyin.

Çanağı 30 derecelik bir Celcius inkübatöre yerleştirin. 24 saat sonra, enjekte edilen dişileri mini bir kafese aktarın ve enjekte edilmemiş genç erkeklerden eşit sayıda ekleyin. Kafesi etiketleyin ve kedi maması ekleyin.

Çiftleşmeye izin vermek için kafesi 30 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Elde edilen yavrular daha sonra pRNAi'nin etkilerini belirlemek için incelenebilir. Bu görüntü, kontrol olarak yeşil floresan proteini olan DS GFP enjekte edilen bir pRNAi bireyinin yavrularını göstermektedir.

Burada, vahşi tip bireylerde olduğu gibi, yavrular segment başına bir pigmentli şeritle yumurtadan çıktı. Komşu pigmentli şeritler, pigmentli olmayan bir boşlukla ayrıldı. Eşleştirilmiş pRNAi'yi takiben, etkilenen yavrular, kusurlu segmental sınırları gösteren kaynaşmış komşu pigmentli şeritlerle yumurtadan çıktı.

Fenotipik şiddet değişkendi, ancak füzyonlar sürekli olarak belirli sınır bölgelerinde ortaya çıktı ve bu da çift kuralı benzeri kusurları gösterdi. Benzer şekilde, eşleştirilmiş knockdown sonrası yumurtadan çıkmamış embriyoların kütikül fenotipleri, abdominal segmentlerin kaybının yanı sıra vücut uzunluğunun kısaldığını gösterdi. Moleküler kusurları incelemek için erken embriyoların engrailed antikor ile boyanması, kontrol bireylerinde her segmentte eşit yoğunlukta ekspresyon şeritleri gösterdi.

Buna karşılık, Dmac eşleştirilmiş dsRNA enjekte edilen dişilerin yavrularında alternatif şeritlerde azalmış ekspresyon tespit edildi. Bu azaltılmış ekspresyon paterni, etkilenen yumurtadan çıkmış larvalarda gözlenen kusurlu kütikül paterni ile tutarlıdır. Burada, ilk kez, Dermestes maculatus'taki erken embriyonik gelişim sırasında, RNA girişimini kullanarak, ilgilenilen bir geni parçalamak için protokolümüzü sunuyoruz.

Bu prosedürleri denerken, uygun aşamada embriyoları veya dişi yetişkinleri kullanmayı unutmamak önemlidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, yaklaşık 100 embriyo veya 10 dişi yetişkinin enjekte edilmesi yarım saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, gen düzenleyici mekanizmalar hakkında ek soruları yanıtlamak için embriyo boyama veya kantitatif PCR gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir Dermestes laboratuvar kolonisinin nasıl kurulacağını iyi anlamalı ve bu böcekte hem embriyonik hem de ebeveyn RNA girişimini gerçekleştirmelisiniz. Şu anda, fonksiyonel çalışmalar için sadece az sayıda böcek modeli mevcuttur. Burada sunulan teknikler, araştırmacıların Dermestes'i bir model sistem olarak kullanmalarının önünü açmakta ve moleküler genetik analize uygun böceklerin kapsamını genişletmektedir.