X-ışını Floresan (XRF)

1. Silisyum Nitrür Pencerelerinin Hazırlanması

1. Bir pencereyi almak için ters cımbız kullanın (silikon nitrür pencereler düşürülürse parçalanır).
2. Pencereyi düz tarafı yukarı bakacak şekilde bir cam kaydırağın üzerine yerleştirin.
3. Pencerenin kenarlarına küçük parçalar halinde Scotch bant yapıştırın ve bunları pencereleri kültür kabının dibine yapıştırmak için kullanın.
4. Kültür kaplarındaki pencereleri UV radyasyonu ile sterilize edin. Bu, bir UV çapraz bağlama kabinindeki otomatik çapraz bağlama ayarı ve ardından laminer akış başlığındaki UV lambası altında yaklaşık 1 saat boyunca daha fazla UV ışınlaması ile gerçekleştirilebilir.

2. Hücrelerin Sterilize Edilmiş Silisyum Nitrür Pencereleri Üzerine Kaplanması

1. Çanağı yaklaşık 45° açıyla eğik halde tutun.
2. Tabağın kenarına doğru pipetleyerek ortam ekleyin ve pencereyi ortamla kaplamak için eğim açısını yavaşça azaltın.
3. Hücreleri aynı şekilde kültür kabına ekleyin ve inkübe edin.
4. Ne zaman kullanıma hazır olduklarını belirlemek için hücreleri ara sıra bir ışık mikroskobu kullanarak gözlemleyin.

3. Hücrelerin Sabitlenmesi ve Kurutulması

1. Laminer akış başlığında, tabağı yukarıda açıklandığı gibi eğerken yumuşak bir aspirasyonla ortamı çıkarın.
2. Açılı olarak tutarken tabağın kenarına doğru pipetleyerek PBS'yi ekleyin. Pencereyi PBS ile kaplamak için eğim açısını yavaşça azaltın.
3. PBS'yi hafif aspirasyonla çıkarın.
4. Tabağın kenarına doğru pipetleyerek ve belirli bir açıyla tutarak, hücreleri kaplamak için %4 PFA/PBS, pH 7 ekleyin. Bu solüsyonda oda sıcaklığında 20 dakika bekletin.
5. PFA/PBS karışımını çıkarın ve tehlikeli madde olarak atın.
6. Yukarıda açıklandığı gibi pipetleme yaparak PBS ekleyin.
7. 3.5 ve 3.6 adımlarını iki kez tekrarlayın.
8. PBS'yi hafif aspirasyonla çıkarın.
9. 20 mM BORU, 200 mM sükroz, pH 7 ekleyin.
10. BORULARI/sakarozları nazikçe aspire ederek çıkarın.
11. 2.8 ve 2.9 adımlarını iki kez tekrarlayın.
12. Pencerenin kenarlarını ve arka girintisini bir Kimwipe ile hızlı bir şekilde kurulayın, ardından pencereyi kuruması için kauçuk ızgara paspası gibi temiz bir yüzeye koyun.

4. Hücrelerin X-ışını floresan görüntülemesi

1. Numune kuruduktan sonra, bir ışık mikroskobu kullanarak pencerelerdeki hücrelerin varlığını doğrulayın.
2. Pencereleri kiriş hattı tarafından sağlanan alüminyum bir tutucuya sabitlemek için oje kullanın.
3. Alüminyum tutucuyu kinematik bir yuvaya yerleştirin ve ardından X-ışını mikroskobundaki optiklerin odak noktasında ve gelen X-ışını ışınına yaklaşık 45°'lik bir açıyla, numune nano konumlandırma aşamalarına monte edilmiş bir konuma yerleştirin.
4. X-ışını mikroskobu cihaz alanından (genellikle kurşun duvarlardan yapılmış bir kulübe) çıkın ve deklanşörü açın. Kalan adımları uzaktan gerçekleştirin.
5. Bir bölge plakası veya Kirkpatrick-Baez aynaları kullanarak, monokromatik X-ışını ışınını (genellikle 10 keV enerji) mikron altı nokta boyutuna odaklayın.
6. Nano konumlandırma numune aşamalarını kullanarak ve önceden kalibre edilmiş bir aşağı akış sintilatör kamera ile numune üzerindeki X-ışını demetinin konumunu görüntülemek, numunenin verilerini yakalamak için raster taramanın uygun genişliğini ve yüksekliğini belirleyin.
7. Dalga boyu dağılımlı silikon sürüklenme dedektörü ile gelen ışına 90°'de ve numuneden yaklaşık 3 mm veya daha az uzakta, 1-2 saniyelik bir bekleme süresine sahip bir test spektrumu toplayın.
8. Test spektrumunu görüntülerken, ilgilenilen öğeler için yeterli sinyal-gürültü sağlamak için tarama için uygun bir bekleme süresi seçin.
9. Tarama için, numune üzerindeki ışının nokta boyutundan önemli ölçüde daha küçük olmayan veya numunedeki ilgilenilen özelliklerden daha büyük olmayan uygun bir çözünürlük seçin.
10. Taramayı tarama yazılımına programlayın ve görüntüyü toplayın.