Name: Kullanımı Ex Vivo Tüm organ Görüntüleme ve Kantitatif Doku Histoloji floresan etiketli Moleküllerin Biyo-dağılımını belirlemek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Öğrenin, ex vivo tüm organ görüntüleme yöntemiyle floresan etiketli bileşiklerin biyo-dağılımını hızlıca karakterize etmeyi. Bu düşük maliyetli teknik, protein bazlı terapötiklerin dağılımını değerlendirmek için araştırmacılara hızlı ve doğru karşılaştırmalar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

GLB için kısmi maaş desteği NIH hibe R01HL121527 tarafından sağlanmaktadır. JWDM, Nöroloji Currier Bursu tarafından desteklenmektedir.

NOT: Bu protokol tüm hayvan kullanımı Mississippi Tıp Merkezi Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Hayvanlar ve Doku 1. Tedavi <ol><li> Yönetim ve Kurban <ol><li> 5 dakika için% 3 izofluran ile hayvanların anestezisi ve ayak parmağı sıkıştırma refleksinin yokluğu gözlemleyerek anestezi derinliğini kontrol edin. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözlere veteriner merhem sürün. </li><li> hayvan tartılır ve 1.5 ml tüp içine ya da rodamin etiketli ELP, SynB1-ELP veya Tat-ELP bir 50 mg / kg dozda pipetle. sonraki adımda standart eğrilerin formülasyonu için tatbik edilen işaretlenmiş bileşiklerin 100 uL kaydedin. Not: standartlar floresan etiketleme etkinliğindeki değişkenlik nedeniyle farklılıklarını önlemek amacıyla hayvanlara uygulanabilir etiketli protein, aynı partiden elde edilmiş olması çok önemlidir. düzgün bir arka Fluores ortadan kaldırmak içinDaha sonra fluoresans ölçümleri ile ilgili artmasına neden olmuştur, işlem görmemiş hayvanlar ile tedavi edilen hayvanlarda da aynı yöntemler / reaktifler kullanılarak kurban gerekir. </li><li> Daha önce kuyruk ven ya da (kasıkta 1 cm kesi üzerinden erişilen) femoral ven kullanılarak 1 açıklandığı gibi bir IV enjeksiyon yönetme. kasık kesi durumunda analjezi için, 5 mg / kg bir dozda deri altından karprofen uygulanması ve yara bandı ile kapatılmasından önce insizyon noktasına sensorcaine uygulanır. burun (IN) yoldan yönetmek için, yatar pozisyonda hayvan yerleştirin. </li><li> 2 uL pipet kullanarak, etiketli bileşim bir 1-ul damla yaparlar. Kısaca burun erişmesine izin vermek için anestezi yaka hayvanın kafasını kaydırın. </li><li> Tek bir Nare açılması pipet ucu yerleştirin ve yavaşça damlacık burun boşluğuna Nare aşağı çalışmasına izin veren, piston bastırın. tam doz reklamı kadar burun her damla alternatif, her 1 dakikada bir tekrarlayınızhizmet ettiler. Not: IN üzerinden uygulanan maksimum hacmi 10 geçmemelidir - fareler için 15 mcL. </li><li> bağımsız bir kafes içine, her hareket önce son uygulamadan sonra 10 dakika süre ile anestezi altında yatar pozisyonda hayvanlar bırakın. Not: sternum yatma muhafaza edilmesi için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz hayvanları bırakmayın. </li><li> 1 saat sonra, daha önce olduğu gibi hayvanlar yeniden anestezi en (PO4, 9,000.0 mg / L NaCl, 726 mg / L Na 2 HPO 4 .7H 2 O 210.0 mg / l KH 2) PBS kullanarak transcardial perfüzyon yoluyla kurban 20 ml&#39;lik bir toplam 10 mL / dakika. Not: kurban perfüzyonundan dokular tüm kan çıkarmak için etiketli bileşiklerin ekstravasküler konsantrasyonlarını belirlemek için gereklidir. Perfüzyon reaktifler eşiğe değişikliklere neden olabilir ve tutarlı tutulmalıdır. Kurban yöntem tutarlı olmalıdırgruplar içinde. Kurban farklı yöntemler, damar içindeki kan düzeyleri değişen dokuların arka floresan değiştirerek neden olabilir. </li></ol></li><li> Dokuların Koleksiyonu <ol><li> dokularının durulanması için yukarıda tarif edildiği gibi PBS hazırlayın. Not: başka bir tampon perfüzyon sıvısı olarak kullanılır ise, aynı tampon içinde doku yıkayın. </li><li> Basit diseksiyon ile kalp, akciğerler, mide, karaciğer, dalak, böbrekler ve çıkarın. laboratuvarı kullanarak kurulayın veya aşırı nem fitil ve görüntüleme hasır üzerine dokuları yerleştirerek mendil kısa bir süre önce PBS içinde yıkayın. </li><li> fare başını kesmek ve kemik kesiciler veya rongeurs kullanarak kafatasının üst kaldırın. forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde bozulmamış koku ampuller tutarak, beyin kaldırmak. Kuru durulayın ve sağlanan görüntüleme mat üzerine yerleştirin. </li><li> Hızlı ejeksiyon 7 vasıtasıyla omurilik kaldırmak için, PBS ile 10 ml şırınga doldurun ve bir dulled 18-iğne takın. Not: 18 ayar uyuyorBirçok fare hatları yetişkin spinal kanal. gerekli çap boyutu, hayvan ile değişecektir. </li><li> decapitation yerinde spinal kanalın açılması temiz kesilmiş ve kan serbest edilmesini sağlamak, yüzükoyun pozisyonda hayvan yerleştirin. </li><li> omurga çevresindeki deri çıkarın. keskin kemik kesiciler veya makas kullanarak, kalça doğrudan rostral bel bölümünde omurga kesti. </li><li> Kısaca spinal kanalı görselleştirmek için PBS ile durulayın. Yavaşça spinal kanal içine iğne takın. Not: İğne rahat hissetmeniz gerekir ve ileri geri yerleştirilmesi sırasında bazı yavaş haddeleme gerekebilir. İğne gevşek hissetmeniz gerekir, bir daha rostral kesim yapılabilir ya da daha geniş çaplı bir iğne gerekebilir. </li><li> başparmak ve işaret parmağı kullanarak, eklenen iğnenin etrafında omuriliğe baskı uygulamak. orta ve sabit basınç ile piston bastırın. Omurilik spinal rostral açıklığın bozulmamış out çıkarırsütun. Not: uygun 5 içinde tamamlanabilir tüm önemli organların tamamen çıkarılmasını, durulama ve kurutma - 7 dakika. Bu kısa süre, aşırı ışığa maruz kalma ve dokudan etiketli proteinlerin liç neden olabilir PBS içinde genişletilmiş depolama ihtiyacını engeller. </li></ol></li></ol> 2. Tüm organ Ex Vivo Floresans Görüntüleme <ol><li> Görüntüleme Parametreleri <ol><li> görüntü elde etme yazılımını başlatın. iktisap kontrol panelinin sağ alt tarafındaki, &quot;başlatılamadı.&quot; tıklayın </li><li> Altında &quot;görüntüleme modu,&quot; &quot;floresan&quot; onay kutusunu işaretleyin. Altında &quot;maruz kalma süresi&quot;, &quot;AUTO&quot; i seçin. </li><li> Altında &quot;binning&quot;, &quot;küçük&quot; seçin ve 2 F / Stop ayarlayın. </li><li> 535-nm uyarma ve 580 nm emisyon filtreleri seçin. Not: Bu, kullanılan etiket bağlı olarak değişecektir. </li><li> &quot;Görünüm B Alan&quot; seçin ve targe ayarlamak0.3 cm t yüksekliği. Not: Bu, görüntülenecek doku bağlı olarak değişecektir. </li><li> sıcaklık göstergesi (makine anlamına tamamen başlatılmış olan) yeşil döndüğünde, dokular tamamen birbirinden ayrılır sağlanması, sağlanan siyah arka plan hasır üzerine dokuları yerleştirin. Tüm dokular Seçilen alan ızgara içinde olmasını sağlamak, kamera içinde mat yerleştirin. lobların örtüşme azaltacak şekilde bu tür bütün karaciğer gibi büyük ve homojen olmayan dokular, ortaya konmalıdır. Not: Dokular, tek bir hayvan veya benzer tipteki tüm dokularını karşılamak için bir resim izin tek bir grupta birlikte düzenlenebilir. Bu daha kolay, daha sonra analiz ve organizasyon yapar. floresans yoğunluğunu büyük farklılıklar, çeşitli dokular arasında varsa, tek bir maruz kalma süresi tüm doku yoğunlukları için ideal olmayabilir gibi, bu görüntü bunları ayrı ayrı ya da aynı doku tipindeki grupları en iyisidir. </li><li> Tıklayın &quot;edinin.&quot; </li><li> görüntüleme hemen sonra, dokuların kaldırmak ve saklamak veya 4. adımda belirtildiği gibi, nicel histoloji için onları dondurmak. </li></ol></li></ol> 3. Standartlar ve Görüntü İşleme <ol><li> Standartlar <ol><li> PBS içinde 15 dilüsyonları toplam orijinal konsantrasyonda başlayarak hayvanların tedavisinde kullanılan her proteininin iki kat seri dilüsyonları oluşturabilir. Not: konsantrasyon aralığı, beklenen doku konsantrasyonları içerir hedeflemelidir ve başlangıç ​​konsantrasyonuna bağlı olarak, orijinal numune ek seyreltmeler gerektirebilir. </li><li> siyah 96 oyuklu plakanın her oyuğuna her bir standart Pipet 100 uL. eşiğe bir ölçü elde etmek için saf PBS bir kuyu yer alır. </li><li> Görüntü doku görüntüleme için kullanılan aynı parametrelerle standartları. </li><li> görüntü elde etme yazılımı altında &quot;Aracı Paleti&quot; &quot;ROI Araçları&quot; seçeneğini İlgi &quot;Bölge (ROI) &quot;Daire ve iyi birinin etrafında ROI çizin. ROI diğer dolu kuyulara tüm kopyalamak ve tıklayın &quot;İB&#39;leri ölçün.&quot; </li><li> diğer standartlar değerlerden saf PBS ortalama radyant verimlilik değeri çıkarma; Bu arka plan floresan kaldırır. Bir dağılım arsa üzerinde bilinen konsantrasyonda karşı değerleri çizilir. Not: Doğrusal eğilim çizgisinin ortaya çıkan denklem daha sonra göreceli floresan değerini hesaplamak için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Görüntü işleme <ol><li> görüntü elde etme yazılımı olarak, serbest biçimli ROI aracını seçin ve bireysel dokuların her etrafında İB&#39;leri çizin. &quot;Önlem&quot; i tıklayın. </li><li> Elde edilen ortalama radyant verimlilik ölçümleri ile, her bir doku tipi işlenmemiş hayvandan ölçülen değerleri çıkarmak ve önceden oluşturulan standart eğri üzerinde bu değerleri çizmek. Not: Elde edilen nispi floresan değerleri hızlı ve doğru bir anlık sağlamaketiketli bileşimin biyolojik dağılım. </li></ol></li></ol> 4. Kantitatif Doku Histoloji <ol><li> Dilimleme için Dokuların hazırlanması ve Donma <ol><li> Oluşturma veya kullanım için yeterli seçilen dokular donmaya boyut ve kriyostat kapları satın. uygun büyüklükte bir ve şekilli nesnenin etrafında sarma alüminyum folyo iyi çalışıyor. </li><li> kuru buz ile 500 ml beher yarısını dolduran kısmen dondurma kabı daldırın kuru buz üzerinde yeterli miktarda sıvı olacak şekilde izopropanol ~ 350 mL ilave edilerek izopropanol ve kuru buz karışımı hazırlayın. Not: Sıvı azot genellikle optimum kesim sıcaklık bileşik (OKT) ve gömülü dokuların kırık sonuçlanır ve kaçınılmalıdır. </li><li> Mevcut hiçbir kabarcıkları vardır sağlanması, OCT ile kısmen dondurma doldurun. kabarcıkları varsa, forseps kullanarak çözümün dışına kabarcıklar çalışmak ya da benzer bir uygulamaya. </li><li> doku çıkarmakPBS ve kuru iyice ya nazikçe mendil bir laboratuar ya da bir laboratuara hassas dokuların kenarları silin dokunmadan ve sıvı uzak fitil izin vererek onu okşamaya. </li><li> dokuda altında kabarcıklar tanıtmak için sağlanması, dondurma kabının içine OCT içine yavaşça doku yerleştirin. Doku yerleştirildikten sonra doku tamamen kaplıdır kadar, OCT ekleyin. </li><li> izopropanol kabın içinde maruz OCT ile temas etmesine izin vermeden mümkün olduğu kadar dondurma kabı Batmak. gerektiği sürece için -80 ° C&#39;de depolamadan önce, tamamen donmasına OKT ve doku için 90 s (ya da daha büyük dokular için potansiyel olarak daha fazla) - 30 izin verir. </li></ol></li><li> Dilimleme Standartlar hazırlanması. <ol><li> Hazırlama ve uygun haznenin ucunu kaldırarak 1 mL&#39;lik tek kullanımlık şırıngalar etiket, şırınga tüm uzunluğu bir çapı olacak şekilde. Bu donmuş silindir daha sonra dışarı itti olmasını sağlayacaktır. </li><li> BizeDaha önce PBS ile yapıldı okt, uygulanan bileşiklerin bir 15 adımlı, iki kat seri seyreltme oluşturmak ing fakat 1 mL&#39;lik bir son elde edilen hacmi. eşiğe değerleri çıkarmak için saf OCT bir örnek sayılabilir. </li><li> OCT viskozitesi yeterli karıştırma zorlaştırır. tüpleri ters çevirin ve Ekim tamamen yeniden tersini önce yerleşmek için izin verir. homojen bir karışım sağlamak için 20 kez - bu 10 tekrarlayın. Karıştırma sırasında ışıktan 4 ° C&#39;de ve uzak standart çözümler tutun. </li><li> Karıştırma işleminden sonra, daha önce olduğu gibi, izopropanol ve kuru buz karışımı hazırlandı. Not: Sıvı azot da izopropanol / kuru buz karışımı yerine kullanılan bu donup sonra şırınga hızlı bir şekilde çıkarılır sağlanabilir. </li><li> mümkün olduğunca az kabarcıklar tanıtmak için özen, enjektöre Ekim standardını çizin. Ekim çözümü çizdikten sonra, hemen izopropanol doğrudan şırınga daldırma ve çözüm tamamen donmasına izin20 sn - 10 şırınga içinde. gerektiği kadar -80 ° C &#39;de şırınga saklayın. </li></ol></li><li> Dokuların ve Standartların Kesme <ol><li> -20 ° C hem de doku ve standartlar yerleştirin ve tüm numuneler sıcaklığına gelmesi için yeterli bir zaman tanır. Not: ideal kesme sıcaklığı genellikle en dokular için -10 ° C aralığında etrafında düşer, ama sonuçta doku boyutu ve yağ içeriğine bağlıdır ve ampirik olarak rafine edilmesi gerekir. </li><li> Daha önce 8 açıklandığı gibi bir Kriyostat kullanarak, 20 mikron kalınlığında dilimler halinde dokuları kesmek ve slaytlar üzerine takar. -20 ° C&#39;de slaytlar Mağaza ve kesme sırasında ve tarama kadar uzakta mümkün olduğunca ışık onları tutmak. Not: Bölümler uygun doku bütün kalınlığı boyunca dağıtılan ölçülecek burada önemlidir. </li><li> Kriyostat mandren üzerine standartları monte etmek için, dondurucudan şırıngayı alıp 3 dışında sıcak - hol ile 5 sding o elinde. Ekim silindir kısa bir bölüm (~ 1 cm) kadar pistonu itin şırınga dışındadır. <ol><li> Bir jilet kullanarak, silindir kesti ve yerinde tutmak için OCT kullanarak, aynanın üzerine dik ortaya çıkan silindir bölümüne yerleştirin. iyi tanımlanmış çevreler yol açmalıdır Bu yapılandırma kesilmiş. </li></ol></li><li> bir slayt tüm standart eğri temsil edecek şekilde, tek bir slayt üzerine her seyreltme birer dilim yerleştirerek, 20 mikron silindir dilimleyin. Tarama için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de slaytlar saklayın. </li></ol></li><li> Tarama ve miktar tayini <ol><li> Tarama dizi yazılımını başlatın ve lazer başlangıç ​​prosedürü başlatmak için &quot;543 lazer&quot; i tıklayın. Lazer hazır hale getirilmesi için 15 dakika bekleyin. </li><li> Lazer hazır olduğunda, -20 ° slaytlar kaldırmak ve sıcaklığına gelmesi için büyük bir ışık korumalı konteyner içine taşıyın ve 3 dakika boyunca kurumaya. Bu sli nem oluşumunu engellerde tarayıcı. </li><li> slayt tarayıcı slayt yuvasına slayt yükleyin. Click &quot;tarama&quot; ve &quot;kolay tarama çalıştırın.&quot; </li><li> 50 um tarama çözünürlüğünü ayarlayın. </li><li> &quot;Florofor&quot; altındaki ilk &quot;kullan&quot; onay kutusunu seçin ve &quot;TRITC.&quot;% 80 PMT Gain ayarlayın. Not: Bu ayarlar florofor ve işaretli moleküllerin konsantrasyonuna bağlı olarak değişecektir. </li><li> Sol tarafta, tarama alanı tüm slayt içerdiğinden emin olun. Tıklayın &quot;başlatın.&quot; </li><li> Taramadan sonra, &quot;Dosya&quot; seçin ve &quot;olarak kaydetmek&quot; ve sonra bir .tif olarak kaydetmek. Not: Doku ve standartların Slaytlar aynı ayarlara taranmalıdır. </li><li> ImageJ içine sonuçlanan görüntüleri yüklemek ve dokular ve standartları çevresinde İB&#39;leri seçin. &quot;Analiz&quot; sekmesi altında, &quot;ölçümleri set&quot; i seçin ve &quot;gri ortalama değer.&quot; Tıklayın220; tedbir &quot;. Not: Önceki tekniği gibi, arka plan flüoresan tüm ölçülen değerlerden çıkarılmalıdır. </li><li> bir standart eğri oluşturmak için bilinen konsantrasyonuna karşı standartları ortalama gri değeri ölçümleri çizilir. Not: dokulardan elde edilen ölçümler, her doku içinde ortalaması ve doku içinde konsantrasyonunu belirlemek için standart bir eğri çizilmiştir olmalıdır. </li></ol></li></ol>

<ol><li>George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Polypeptide+Drug+Carrier+for+Maternal+Delivery+and+Prevention+of+Fetal+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Drug+Target%22%5BJournal%5D)">A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure.</a> J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).</li>
<li>George, E. M., Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+purification+and+delivery+systems+%28PADS%29+for+therapeutic+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc.+Cell%22%5BJournal%5D)">Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis.</a> Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+Targeted+Delivery+of+a+c-Myc+Inhibitory+Polypeptide+Inhibits+Tumor+Progression+and+Extends+Survival+in+a+Rat+Glioma+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model.</a> PLoS One. 8 (1), (2013).</li>
<li>Liu, H., Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+improved+blood%E2%80%93brain+barrier+permeability+of+endomorphin-1+using+the+cell-penetrating+peptide+synB3+with+three+different+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages.</a> Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).</li>
<li>Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+absorption+of+macromolecules+studied+by+quantitative+autoradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography.</a> Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).</li>
<li>Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+characterization+of+human+ovarian+cancer+cells+in+a+rat+model+of+intraperitoneal+antineoplastic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy.</a> J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).</li>
<li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li>
<li>Currle, D. S., Monuki, E. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+Freezing+and+Cryosectioning+E12.5+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198(2007).</li>
<li>Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+penetrating+peptides+fused+to+a+thermally+targeted+biopolymer+drug+carrier+improve+the+delivery+and+antitumor+efficacy+of+an+acid-sensitive+doxorubicin+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative.</a> Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).</li>
<li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).</li>
<li>Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+toxicology+of+therapeutic+proteins%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges.</a> World J. Biol. Chem. 3 (4), 73(2012).</li>
<li>Stumpf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+microscopic+autoradiography+to+determine+tissue+distribution+of+biopharmaceuticals+-+Target+discoveries+with+receptor+micro-autoradiography+engendered+new+concepts+and+therapies+for+vitamin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).</li>
</ol>

GLB, ELP tabanlı ilaç dağıtım teknolojisi geliştirmek için çalışan özel bir şirket olan Leflore Technologies, LLC'nin sahibidir. Leflore Technologies, bu makalenin yayınlanması veya içinde veri oluşturulması için herhangi bir destek sağlamamıştır.

Ex vivo bütün organ görüntüleme genellikle basit olmakla birlikte, bazı temel kavram ve tekniklerine bağlılık biyo-dağıtım ölçümlerin doğruluğunu artırabilir. Işık deneyimi kısa dalga boyları çoğu dokularda saçılma ve absorbans yüksek derecede anlamlı olan etkileri kısa dalga boylu fluorophores yarar. Bu fluorophores derin doku çalışmalarında uygulama sınırlı, ama onlar yüzey dokuları ya da göz içine bakarak deneylerde etkin olarak kullanılmaktadır. Tersine, ışığın uzun dalga boyları daha penetrasyon ve daha ka...

Floresan etiketleme bileşiklerin biyo-dağılımını belirlemek birçok laboratuvar için ortak olan bir ekipman kullanılarak çeşitli için kolaylıkla kullanılabilir ve etkili bir yöntemdir. Fluorophores nispeten ucuz, yaygın olarak kullanılabilir ve birden etiketli moleküller müdahalesi olmadan aynı anda kullanılabilir şekilde dalga boylarında, çeşitli gelir. Çoğu fluorophores hedef bileşiklere farklı reaktif gruplara konjugasyon için kimyaları bir dizi var ve konjugasyon süreci reaktif sitelerin çoğu türleri için genellikle basittir. Buna ek olarak, floresan etiketli bileşiklerin ölçümü için gerekli olan ekipmanın birçok laboratuvar yaygındır. Floresan mikroskoplar, kameralar, ve slayt tarayıcıları tüm florasan etiketleme kullanımı son derece erişilebilir hale farklı durumlarda kullanılabilir. Floresan etiketler sıklıkla viv in vivo ve ex hem bileşiklerin biyo-dağılımı ve kinetiklerini belirlemek için kullanılırBöyle IVIS Spektrum Imager olarak ve kantitatif doku histolojisi 2,3 canlı görüntüleme cihazları ile o. Canlı görüntüleme cihazları kullanılarak ex vivo olarak bütün organ görüntüleme kullanımı nedeniyle kullanımı ve hızlı bir şekilde tissues4 daha işlem gerektirmeden etiketli bileşiklerin nispi konsantrasyonlarının doğru bir karşılaştırma oluşturma yeteneği kolaylıklan zamanla artmıştır. Ex vivo olarak bütün organ görüntüleme kolay analiz ve karşılaştırma için izin verebilir ancak bununla birlikte, bir doku içinde, mutlak bileşik konsantrasyonları bir nicel ölçümünü oluşturmaz. Bu dokunulmamış organlar içindeki ışık dağıtma etkilerine bağlıdır. (Daha az bir ölçüde, absorbans ve) ışık saçılımı doku büyüklüğüne ve yoğunluğuna göre değiştiğinden, bütün organın görüntülenmesi büyük veya yoğun organlarda doku düzeylerini hafife. bir kalınlığa taklit gerekir çünkü mutlak konsantrasyon ölçümleri için uygun standartlar formüle da zordurve her bir organ yoğunluğu. Diğer taraftan, bütün organın görüntülenmesi bir maddenin göreli doku seviyelerini elde etmek için bir hızlı bir yöntemdir ve bu (örneğin ilaç hedefleme çalışmalarda olduğu gibi) çok sayıda ilgili moleküllerin nispi biyo-dağılımı karşılaştırma için idealdir. Alternatif bir diğer strateji, kantitatif fluoresans histolojisi, kantitatif otoradyografi için açıklanan yöntemle elde edilen bir teknik kullanmak için bir deney maddesinin 5,6 mutlak doku düzeylerini elde etmektir. Aksine bir hayal cihaz içine bütün bir hayvan ya da bir organ yerleştirerek daha, nicel doku histolojisi her doku taranan slaytlar, üzerine monte edilmiş, dilimlenmiş ve bireysel analiz gerektirir. Test maddesinin Standartları hazırlanmış ve organ örnekleri gibi aynı kalınlıkta dilimlenir. Aynı kalınlığa tüm organ ve standartlar keserek ışını tarama ya da emiş nedeniyle değişkenlik ortadan kalkar, ve doku floresan yoğunluğu, mutlak konsantrasyonlarda belirlemek için standart eğriye uydurulmuş olabilirrasyon. doğru yapılan bu yöntem, kantitatif olsa da, aynı zamanda, emek-yoğun ve kolay bir şekilde hatalı olduğunu. Bütün organ görüntüleme ile karşılaştırıldığında nicel histoloji ve emek önemli ölçüde daha yüksek maliyetle daha karmaşık doğası göz önüne alındığında, her süreç floresan etiketli bileşiklerin biyo-dağılımını incelerken kullanmak en pratik olduğu incelemek için değerli hale gelir. Bu protokol ile, bu yöntemler ya da SynB1 veya TAT hücre nüfuz peptitlerinin ilavesi olmadan etkili bir şekilde rodamin etiketli elastin gibi polipeptit (ELP) biyo-dağılımı karşılaştırma birlikte kullanılabilir dair ayrıntılı bir açıklama sağlar intranazal (İN) ve damar içi (IV) uygulama yolları.

<table><tbody><tr><td>Reaktifler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maleimid türevli floroforlar (örn., tetrametilrodamin-5-maleimid, AlexaFluor 633-C5-maleimid)</td><td>Thermo Fisher</td><td>T6027, A20342</td><td>Protein etiketleme için tiyol reaktif floresan boyalar</td></tr><tr><td>Durulama için Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Sigma</td><td>1002243569</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Tamponu Optimum Kesim Dondurma</td><td>ve montaj için kullanılan</td> Sıcaklık Bileşiği <td>Tissue-Tek</td><td>4585</td></tr><tr><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spektrumu</td><td>ex vivo tüm organ görüntüleme için</td><td>Perkin Elmer</td><td></td></tr><tr><td>Kriyoseksiyon için</td><td>Kriyomikrotom</td><td>Termo</td><td></td></tr><tr><td>Floresan slayt tarayıcı</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Slayt için Tarama</td></tr></tbody></table>

kullanımı ex vivo tüm organ görüntüleme ve kantitatif doku histoloji floresan etiketli moleküllerin biyo-dağılımını belirlemek için

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Floresan etiketleme in vitro ve hem de in vivo deneysel koşullar altında çeşitli işaretli moleküllerin kaderini incelemek için iyi bilinen bir işlemdir. Floresan probları bir küçük moleküllü floresan işarete ilave kinetiği ya da bu bileşiğin biyo-dağılımı etkileyecek olası değildir tatbik büyük moleküllerin biyolojik dağılımını belirlenmesinde özellikle yararlıdır. çeşitli yöntemler gerekli çaba miktarda önemli ölçüde değişebilir ve biyo-dağılımını incelemek ana kadar elde edilen ölçümler, tam miktar, ancak biyo-dağılımı analiz etmek için hızlı ve etkili bir sistem sağlayabilir bağlantılı olarak, çeşitli yöntemler kullanılarak ister. Ex vivo bütün organ görüntüleme hızlı doku içinde ve doku veya tedavi gruplarının çok tip arasındaki flüoresan moleküllerinin görece konsantrasyonlarının karşılaştırma kullanılabilecek bir yöntemdir. Bir görüntüleme plat kullanılmasıdokulara içinde canlı hayvan veya bütün organ görüntüleme, floresan için tasarlanmış form genel biyo-dağılımının doğru bir resim sağlarken zamandan ve işçilikten tasarruf, başka bir işleme tabi belirlenebilir. Bu işlem, bir bileşiğin doku özgüllüğünü belirlemeye çalışan deneylerde veya birden fazla farklı bileşiklerin karşılaştırma için idealdir. Öte yandan kantitatif doku histolojisi etiketli bileşiklerin nicel ölçü oluşturmak üzere dokuların detaylı ilave işlem gerektirmektedir. doğru biyo-dağılımını değerlendirmek için, ilgilenilen tüm dokular, dilimlenmiş taranır ve dokular veya gruplar arasında karşılaştırmalar yapmak için standart eğrileri göreli analiz edilmelidir. Kantitatif doku histoloji dokuları içinde mutlak bileşik konsantrasyonlarını belirlemek için altın standarttır. Burada, her iki yöntem, farklı uygulama yöntemleri, bir yeteneğinin tayin edilmesi için bir arada etkin bir kullanım şeklini açıklarnd bileşik değişiklikler hedef ve merkezi sinir sisteminde 1&#39;e floresan etiketli molekülleri teslim etmek.

Hücre nüfuz peptidler (SynB1-ELP ve Tat-ELP) 9 ile modifiye ELP ve ELP iki sürümü olarak bilinen bir ilaç aktarım vektörü: Bu veriler, üç bileşiğin verilmesini açıklamaktadır. Her üç bileşikler tetramethylrhodamine-5-maleimid ile etiketlenmiş ve iki uygulama yolları aracılığıyla teslim edildi (IN ve IV). Bu deneylerin amacı, merkezi sinir sistemi (MSS) 3 içine en iyi nüfuz neden olur, bu bileşik ve uygulama yoluna belirlemekti. Şekil 1A görüntüler temsi...

Ex vivo bütün organ görüntüleme içinde ve doku veya tedavi grupları arasında floresan etiketli bileşiklerin görece konsantrasyonlarının belirlenmesi için hızlı bir yöntem. Daha fazla emek yoğun ise aksine, kantitatif fluoresans histolojisi, işaretli moleküllerin mutlak doku seviyelerinin ölçümü için izin verir.

Kullanımı Ex Vivo Tüm organ Görüntüleme ve Kantitatif Doku Histoloji floresan etiketli Moleküllerin Biyo-dağılımını belirlemek için

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Bu prosedürün genel amacı, floresan etiketli bileşiklerin bütün hayvanlarda biyo-dağılımını hızlı bir şekilde karakterize etmektir. Bu yöntem, protein bazlı terapötiklerin biyo-dağılımını tanımlamak ve hedeflenen moleküllerin inspirasyon dağılımı üzerindeki etkilerini belirlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin avantajları, gerekli reaktiflerin genel olarak düşük maliyetini ve farklı bileşikler arasında doğru karşılaştırmaların yapılabilme hızını içerir.Biyolojiklerin geliştirilmesindeki hızlı ilerleme göz önüne alındığında, bu teknikler çeşitli hayvan modellerinde bileşiklerin biyolojik dağılımını belirlemek için uygun ve doğru bir yol sağlar. Tüm organların ex vivo görüntülenmesi için önce görüntü alma yazılımını açın ve başlat'a tıklayın. Görüntüleme modu altında, floresan onay kutusunu seçin.Pozlama süresi altında, otomatik'i seçin. Gruplama'nın altında küçük'ü seçin ve F/Stop'u iki olarak ayarlayın. Deneyde kullanılan etiketler için uygun uyarma ve emisyon filtrelerini seçin.Ardından görüş alanı B'yi seçin ve hedef yüksekliği görüntülenen dokuya göre uygun derinliğe ayarlayın. Sıcaklık göstergesi yeşile döndüğünde, numunelerin birbirinden tamamen ayrılmasına dikkat ederek doku

the-use-ex-vivo-whole-organ-imaging-quantitative-tissue-histology-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bitki viral nanopartiküller (VNPs) biyomedikal uygulamalar için platformlar umut vericidir. Burada, biz bitki VNP yayılımı, saflaştırma, karakterizasyon ve bioconjugation ilişkin prosedürler anlatılmaktadır. Son olarak, biz bir fare ksenogreft model ve floresan görüntüleme kullanılarak tümör homing ve görüntüleme için VNPs uygulama göstermektedir.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

Bu yazıda, dinamik kontrastlı floresan videomikroskopi kullanarak in vivo tümör mikrodamarlar analiz etmek için bir yöntem mevcut. İki sayısal parametreler elde edilmiştir: işlevsel tümörün damarlanma yansıtan kılcal yoğunluk ve endotel duvarın bir sızıntının yansıtma indeksi sızıntı.

Flüoresans Konfokal videomikroskopi kullanılarak tümör Angiogenesis İn vivo

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Farelerde floresan haberci kullanılarak, akciğer metastazı olan tümör hücre stromanın etkileşimleri ex vivo canlı görüntüleme için nispeten basit bir yöntem tarif eder. iplik disk konfokal mikroskopi kullanılarak, bu teknik, en az 4 saat boyunca canlı hücre görüntülenmesini sağlayarak ve diğer enflamatuar akciğer koşulları incelemek için adapte edilebilir.

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

Hedef özgü probları protein ifade çeşitli hastalık (Örneğin, iltihap, enfeksiyon ve tumorigenesis) gibi moleküler mekanizmaları analiz etmek için yenilikçi bir araç temsil eder. Bu çalışmada, bağırsak makrofaj infiltrasyonu F4/80 özel tomografi Floresans aracılı kullanarak kolit, fare modeli üç boyutlu bir nicel tomografik değerlendirilmesi açıklar.

Floresan-aracılı tomografi algılama ve fare bağırsak iltihabı makrofaj ile ilgili miktar

Bu protokol, organ yapısında değişiklik olmadan lenf düğümlerini boşaltmada farklı hücre popülasyonlarını görüntüleyen bir tekniği tanımlar.

Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi

Açıklanan yaklaşım, akciğerlerdeki metastaz sayısı ve boyutunun ölçülmesine ek olarak meme kanseri metastazı oluşumunun ve büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlamak için deneysel kuyruk ven metastazı tahlillerini in vivo canlı hayvan görüntülemeile birleştirir.

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Eksvivo görüntüleme sistemlerini kullanan hücre penetran peptidler ile transdüksiyon derecesini değerlendirmek için protokolleri, parafin katıştırma, kesitleme ve konfokal floresan mikroskopisi kalp hedefleme peptidini örnek olarak kullanarak açıklıyoruz. Protokolümüzde, tek bir hayvan aynı organların her iki tür de görüntüleme değerlendirmesini elde etmek için kullanılabilir ve bu da çalışmalar için gerekli hayvan sayısını yarı yarıya azaltabilir.

Kardiyak Hedefleme Peptidin Transdüksiyon Verimlerinin Vivo Görüntülemesinde

Bu protokolün amacı, floresan olarak etiketlenmiş lipozomları sentezlemek ve lipozomların hücresel düzeyde in vivo lokalizasyonunu tanımlamak için akış sitometrisini kullanmaktır.

Floresan Boya Etiketli Lipozomların İn Vivo Dokuya Özgü Hücresel Alımının Hazırlanması, Uygulanması ve Değerlendirilmesi

Spektral Yinelemeli Ağartma Çoklamayı Genişletir (IBEX), spesifik olmayan bağlanmayı en aza indirmek için heparin blokajı ekleyerek ve otofloresansı bastırmak için hesaplamalı karıştırma ile spektral algılamadan yararlanarak temel IBEX tekniğini temel alır. Bu yaklaşım, arka plan kaynaklarını azaltırken görüntü elde etmeyi hızlandırır ve sağlam, çok yönlü, yüksek parametreli uzamsal proteomik analizlere olanak tanır.

Spesifik Olmayan Doku Floresansını En Aza İndirmek için Spektral Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Yüksek Pleks Görüntüleme

Öğrenin, ex vivo tüm organ görüntüleme yöntemiyle floresan etiketli bileşiklerin biyo-dağılımını hızlıca karakterize etmeyi. Bu düşük maliyetli teknik, protein bazlı terapötiklerin dağılımını değerlendirmek için araştırmacılara hızlı ve doğru karşılaştırmalar sunar.

Kullanımı Ex Vivo Tüm organ Görüntüleme ve Kantitatif Doku Histoloji floresan etiketli Moleküllerin Biyo-dağılımını belirlemek için (Video) | JoVE Journal

Kullanımı Ex Vivo Tüm organ Görüntüleme ve Kantitatif Doku Histoloji floresan etiketli Moleküllerin Biyo-dağılımını belirlemek için

Daha fazla video keşfet