İşitsel Ayrımcılık Öğrenme sonra Fare Beyin Bölgeler Yüksek Çözünürlüklü Sayısal Synaptic Proteome Profil

Bu proteomik yaklaşımın genel amacı, temel mekanizmaları ve sinyal yollarını anlamak için öğrenme ve bellek oluşumundan sonra sinapslardaki moleküler yeniden organizasyonun karakterize edilmesidir. Bu tekniğin temel avantajı, sinaptik proteomlar içindeki translasyon sonrası modifikasyonların geniş ölçekli kantifikasyonuna ve karakterizasyonuna olanak tanıyan hipotezden bağımsız bir yaklaşım sunmasıdır. Kurduğumuz iş akışı, belirli bir moleküler değişim ile belirli bir davranış arasında korelasyon kurulmasına imkan tanır.

Öğrenme ve bellek oluşumu, sinaptik etkinliğin değişimlerine dayanır; bu nedenle proteomik çalışmalar, beyin dokusu homojenatlarından ziyade sinaptozomlar gibi sinaptik yapıların analizine daha fazla odaklanmalıdır. Proteomik sonuçlar oldukça karmaşık veri setlerini temsil eder, bu nedenle biyoinformatik işleme gerektirir. Eğitime, test faresini ses yalıtımlı bir oda içerisindeki loş ışıklı bir mekik kutusuna yerleştirerek başlayın.

İşitsel ayırt etme öğrenimi için tamamen bilgisayar kontrollü bir öğrenme çizelgesi kullanın. Eğitim oturumuna başlamadan önce üç dakikalık bir sessizlikten oluşan alıştırma dönemi ile başlayın. "Go" denemeleri sırasında, hayvanın bir isabet puanı kazanması için ton sunumundan sonraki altı saniye içinde engeli geçmesi gerekir.

No-go denemeleri sırasında hayvan, altı saniyelik ton sunumu boyunca shuttle box'ın mevcut bölmesinde kalmalıdır. Bir oturum 60 denemeden oluşacak ve yaklaşık 25 dakika sürecek şekilde, denemeler arası 20 saniyelik bir aralıkla, psödo-rastgele bir sırada 30 go denemesi ve 30 no-go denemesi gerçekleştirin. Tüm denemeler tamamlandıktan sonra, eğitilen fareyi sakrifiye edilene kadar ana kafesine geri koyun.

Fareyi sakrifiye edip beyni çıkardıktan sonra, kan damarları ve yüzey şekli gibi görsel işaretçileri kullanarak işitsel korteksi lokalize edin. Ardından, işitsel korteksi dikdörtgen bir doku bloğu şeklinde bilateral olarak diseke etmek için bir skalpel ve iğne kullanın. İşaretçi olarak chiasma opticum'u kullanarak, frontal korteksi Bregma 3.56 ile 1.54 arasında bir beyin kesiti olarak diseke edin.

Striatumu, Bregma 1.54 ile 0.5 arasında bir beyin kesiti şeklinde diseke edin. Kortikal dokuyu dikkatlice uzaklaştırın. Beyni, serebellum üzerinden bir iğne ile sabitleyerek ve korteksi oksipital lobdan başlayarak çözerek hipokampusu diseke edin.

Disekte edilmiş beyin örneklerini sıvı azot içerisinde şok dondurma işlemine tabi tutun. Disekte edilen beyin dokusunu, bir mililitre buz gibi soğuk Tampon A içeren homojenizasyon kaplarına aktararak sinaptozom saflaştırma işlemine başlayın. Ardından dokuyu, yaklaşık 12 strok kullanarak 900 RPM hızında homojenize edin. Örnekleri 1.000 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüjden sonra süpernatantları saklayın. Peleti daha önce olduğu gibi yeniden homojenize edin ve süpernatantları birleştirin. Birleştirilmiş süpernatantları 12,000 ×g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Peletleri bir mililitre homojenizasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve 900 RPM'de altı strok ile homojenize ettikten sonra 1,200 ×g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.

P2 peletlerini üretmek için gerçekleştirilen santrifüj işlemi sırasında, ultrasantrifüj tüplerinde sukroz basamak gradyanları hazırlayın. 2.5 milliliters 1.0 molar sukroz tamponu ile başlayın ve ardından 1.5 milliliters 1.2 molar sukroz tamponunu alt katman olarak eklemek için cam bir Pasteur pipeti kullanın. Santrifüj işleminin ardından, P2 peletlerine 0.5 milliliters 0.32 molar sukroz tamponu ekleyin.

Ardından altı darbe kullanarak yeniden homojenize edin. Homojenize edilmiş fraksiyonları gradyanların üzerine yükleyin. Yüklenen gradyanları sallanan kova tipi bir rotora yerleştirin ve ardından bir ultrasantrifüjde iki saat boyunca 85,000 ×g hızında döndürün.

Santrifüj işlemi tamamlandığında, 1.0 molar sukroz tamponu ile olan ara yüzeydeki materyal de dahil olmak üzere üstteki 0.32 molar sukroz tabakasını atın. Sinaptozomları, 1 ile 1.2 molar sukroz tamponu ara yüzeyinden toplayın. Sinaptozomal fraksiyona 1.1 oranında 0.32 molar sukroz tamponu ekleyin.

Dikkatlice karıştırın ve 150,000 ×g hızında bir saat boyunca santrifüjleyin. Sinaptozomlar pellet kısmında yer alır ve daha ileri işlemler için bir tampon çözeltide yeniden süspanse edilebilir. Bir hayvanın her beyin bölgesinden elde edilen sinaptozomları, bir ultrasonik banyoda buz üzerinde bir saat inkübe ederek 20 ila 50 µL 8 M üre içerisinde çözün.

Final konsantrasyonun 2 M urea olmasını sağlamak için %1 oranında uzaklaştırılabilir bir deterjan ile seyreltin. SDS-PAGE kullanarak göreceli protein miktarlarını belirledikten sonra, her örneğin kalan kısmının üçte birini yeni bir tüpe pipetleyin. 2 mM DTT ve 25 mM amonyum bikarbonat ekleyerek çözelti içi sindirimi gerçekleştirin ve örneği hafifçe vorteksleyin.

Numuneleri 20 °C'de 45 dakika boyunca indirgeyin. Sistein kalıntılarını karbamidometillemek için 10 mM iota acedomide ekleyin ve karıştırın. 20 °C'de, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.

Son olarak, bir mikrolitre tripsin stok çözeltisi ekleyin ve 20 °C'de 12 saat boyunca inkübe edin. Asitle parçalanabilen deterjanı uzaklaştırmak için, son konsantrasyon yüzde bir olacak şekilde trifloroasetik asit ekleyin ve 20 °C'de bir saat daha inkübe edin. Numuneleri 16.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, süpernatanları dikkatlice toplayın.

Katı faz ekstraksiyon kolonunu bir rafa yerleştirin ve matrisi iki mililitre metanol ile dengeleyin. Yıkama işleminden sonra, iki mililitre daha Tampon B ekleyin ve örneği yükleyin. Tampon B ile üç kez yıkadıktan sonra, 200 mikrolitre %70 asetonitril ve %0,1 trifloroasetik asit ekleyerek peptidleri elüe edin.

Ardından, saflaştırılmış örnekleri vakumlu bir santrifüjde kurutun. Bu örnekte, FM ton ayrımı görevi üzerine eğitilen hayvanlar, eğitim oturumları boyunca artan bir isabet oranı ve azalan bir yanlış alarm oranı göstermektedir. Anlamlı ayrım, dördüncü oturumdan itibaren gerçekleşmektedir.

Seçili proteinlerin göreceli sinaptik bollukları, FM tonu ayırt etme görevinde eğitilen fareler ile eğitimden 24 saat sonraki saf kontrol fareleri arasında karşılaştırılır. Eğitimden sonra, incelenen tüm bölgelerde CYFP2 protein seviyeleri değişir. Hayvanların sıklıkla birey içi değişkenlikler sergilediğini unutmayın.

Bu nedenle, çalışmaya iyi eşleştirilmiş hayvan gruplarından en az beş veya daha fazla biyolojik tekrarın dahil edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Bir kez kurulduğunda, bu teknik diğer türlere kolayca uyarlanabilir. Örneğin, tekil meyve sineği beyinlerinde öğrenmeye bağlı protein ekspresyon değişikliklerini izlemek için kullanılmıştır.