Name: İşitsel Ayrımcılık Öğrenme sonra Fare Beyin Bölgeler Yüksek Çözünürlüklü Sayısal Synaptic Proteome Profil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Öğrenin, farelerde işitsel ayrımcılık öğrenmesi sonrası sinaptik proteomlarda moleküler reorganizasyonu karakterize etmek için proteomik analiz yöntemlerini. Bu hesaplamalı yaklaşım, bellek oluşumundaki sinyal yollarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mükemmel teknik yardım için Yvonne Ducho ve Kathrin Pohlmann'a teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 779) ve Davranışsal Beyin Bilimleri Merkezi (CBBS) aracılığıyla Saksonya-Anhalt Eyaleti / Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Lamprecht, R., LeDoux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity and memory.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (1), 45-54 (2004).</li>
<li>Bingol, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+protein+degradation+by+the+ubiquitin+proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic protein degradation by the ubiquitin proteasome system.</a> Curr Opin Neurobiol. 15 (5), 536-541 (2005).</li>
<li>Richter, J. D., Klann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+synaptic+plasticity+and+memory+last%3A+mechanisms+of+translational+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Making synaptic plasticity and memory last: mechanisms of translational regulation.</a> Genes Dev. 23 (1), 1-11 (2009).</li>
<li>Rosenberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+protein+expression+in+synaptic+plasticity+and+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The roles of protein expression in synaptic plasticity and memory consolidation.</a> Front Mol Neurosci. 7, 86(2014).</li>
<li>Scheich, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+semantics+of+learning+and+crossmodal+processing+in+auditory+cortex%3A+the+semantic+processor+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral semantics of learning and crossmodal processing in auditory cortex: the semantic processor concept.</a> Hear Res. 271 (1-2), 3-15 (2011).</li>
<li>Kähne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+proteome+changes+in+mouse+brain+regions+upon+auditory+discrimination+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Synaptic proteome changes in mouse brain regions upon auditory discrimination learning.</a> Proteomics. 12 (15-16), 2433-2444 (2012).</li>
<li>Reichenbach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+dopamine+signalling+on+long-term+memory+formation+and+consolidation+in+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential effects of dopamine signalling on long-term memory formation and consolidation in rodent brain.</a> Proteome Sci. 13, 13(2015).</li>
<li>Kähne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+rearrangements+after+auditory+learning%3A+high-resolution+profiling+of+synapse-enriched+protein+fractions+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Proteome rearrangements after auditory learning: high-resolution profiling of synapse-enriched protein fractions from mouse brain.</a> J Neurochem. , (2016).</li>
<li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+proteomics+of+rat+synaptic+proteins%3A+correlation-profiling+by+isotope-coded+affinity+tagging+in+conjunction+with+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+to+reveal+post-synaptic+density+specific+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Organelle proteomics of rat synaptic proteins: correlation-profiling by isotope-coded affinity tagging in conjunction with liquid chromatography-tandem mass spectrometry to reveal post-synaptic density specific proteins.</a> J Proteome Res. 4 (3), 725-733 (2005).</li>
<li>Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+postsynaptic+densities+from+various+brain+regions%3A+enrichment+of+different+types+of+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities.</a> J Cell Biol. 86 (3), 831-845 (1980).</li>
<li>Smalla, K. H., Klemmer, P., Wyneken, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmalla%2C+KH+%22The+Cytoskeleton+-+Imaging%2C+Isolation%2C+and+Interaction%22">The Cytoskeleton - Imaging, Isolation, and Interaction</a>. Dermietzel, R. , Humana Press. 265-282 (2012).</li>
<li>Smalla, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+glycoprotein+neuroplastin+is+involved+in+long-term+potentiation+at+hippocampal+CA1+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The synaptic glycoprotein neuroplastin is involved in long-term potentiation at hippocampal CA1 synapses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (8), 4327-4332 (2000).</li>
<li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal Chem. 68 (5), 850-858 (1996).</li>
<li>Thingholm, T. E., Larsen, M. R., Ingrell, C. R., Kassem, M., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TiO%282%29-based+phosphoproteomic+analysis+of+the+plasma+membrane+and+the+effects+of+phosphatase+inhibitor+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">TiO(2)-based phosphoproteomic analysis of the plasma membrane and the effects of phosphatase inhibitor treatment.</a> J Proteome Res. 7 (8), 3304-3313 (2008).</li>
<li>Carmona-Saez, P., Chagoyen, M., Tirado, F., Carazo, J. M., Pascual-Montano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENECODIS%3A+a+web-based+tool+for+finding+significant+concurrent+annotations+in+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">GENECODIS: a web-based tool for finding significant concurrent annotations in gene lists.</a> Genome Biol. 8 (1), 3(2007).</li>
<li>Bonn, S., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+alpha-+and+gamma-protocadherins+alters+their+presenilin-dependent+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of alpha- and gamma-protocadherins alters their presenilin-dependent processing.</a> Mol Cell Biol. 27 (11), 4121-4132 (2007).</li>
<li>Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+post-translational+modifications+on+synaptic%2C+nuclear%2C+and+histone+proteins+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain.</a> J Proteome Res. 8 (11), 4966-4982 (2009).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+hippocampal+phosphoproteome+of+Apodemus+sylvaticus+paralleling+spatial+memory+retrieval+in+the+Barnes+maze%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The differential hippocampal phosphoproteome of Apodemus sylvaticus paralleling spatial memory retrieval in the Barnes maze.</a> Behav Brain Res. 264, 126-134 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Çalışma, öğrenme ve farelerin farklı beyin bölgelerinde bellek konsolidasyon sırasında sinaptik protein ekspresyon değişiklikleri doğru bir kantitatif profil için optimize edilmiş bir metodolojik iş akışı sunuyor. Kurulum kütle spektrometrik analizi için numune başına en az üç teknik çoğaltır gerekli uygulama rağmen tek hayvanın düzeyde protein ifadesini incelemek için bir fırsat sağlar. metodoloji dikkate yüksek molekül ağırlıklı iskele proteinlerinden oluşan öncesi ve postsynapse özel protein bileşimi alır ama aynı zamanda orta ve düşük molekül ağırlıkları taşıyan önemli bir aracı proteinlerin. sinaptozomal preparasyonlar arasında çözeltisi dijestleri etkin üretimi ile sonuçlanabilir ve bu nedenle, skafold türetilen peptidlerin aşırı gösterimi. Bu durum, daha küçük ya da daha düşük fazla proteinler analizi baskılayabilir. Bir gelen SDS-PAGE fraksiyonların önerilen hazırlanmasıparalel bir in-jel sindirim işlemi ile kombine her numunenin kısım orta ve düşük bolluk proteinlerin analizi kolaylaştırır ve bir tavsiye tamamlayıcı bir yöntem temsil eder. Numuneden türetilen tüm fraksiyonlar ayrı kitle spektrometrik uygulamasından sonra (içi çözelti, sindirimi örn jel birleştirildi fosfo-zengin fraksiyonlar, özet) karşılık gelen, MS / MS verileri birleştirilmiş ve daha fazla zirvelere protein tespit edilmek ve nicelendirilmek üzere hesaplanabilir yazılım veya alternatif popüler yazılım paketleri. Seçenek olarak ise, in-çözeltisi ile sindirilmiş numunenin üretilen-jel-sindirim-türetilmiş bir örnek fraksiyon (örnek şerit ayrı ayrı işlenmiş jel alanları) ve kısımların her birinin ayrı bir artırabilir kütle spektrometrisine (iyon değişim kromatografisi ile) analitik derinliği. Ancak, bu genişletilmiş iş akışı önemli ölçüde LS-MS / MS veri toplama için gerekli süreyi artırır. Generatio içinproteomik profil belirli bir zaman sürecini öğrenme ve hafıza oluşumu sırasında sinaptik proteinin yeniden düzenleme ayrıntılı bir molekül dizisinin N gereklidir. Hayvanların performans yakl öğrenme eğrisi asimptotik seviyesine ulaşana kadar bu sefer ders sonra veya hatta ilk antrenman sırasında hemen başlaması ve yakın örgülü zaman çerçevesi kapsar olabilir. 8 - Eğitimin 10 gün (ayrıntılar için bakınız Şekil 2). sinaptik proteinlerin fosforilasyon değişiklikleri analiz FMTD öğrenme sırasında seçilen zaman dilimlerinde belirli bir odak gerektirir. Protein fosforilasyon ve dephosphorylations tetiklediği bilinen sinaptik protein düzenlenmeleri başlatarak bir yandan sinyal iletim hayvan eğitimi çok erken aşamalarında bekleniyor. Öte yandan, S olan bağlantı ve montaj düzenleyen bilinen çok fosforile sinaptik proteinlerin uzun süreli değişiklikler vardırynaptic mimarisi 19, 20. Bu posttranslasyonel değişiklikler bile hafıza konsolidasyon sonraki zaman noktalarında bekleniyor. Bu proteomik iş akışı tarafından oluşturulan karmaşık veri setleri moleküler yollar ve anahtar molekülleri katılan tanımlamak için biyoinformatik işlem gerektirir. Meta-analizi, öğrenme ve hafıza süreçlerinde rol oynayan önemli bir yoğunlaştığından yolları göstermektedir.

Öğrenme bellek izleri ve bunların bakım oluşumu dayanmaktadır. Yaygın bir altta yatan mekanizma nöronlar arasındaki sinaptik mevcut temasların yeni ve / veya yeniden düzenlenmesi bir aktivite bağımlı oluşumunu temsil edebilir olduğu kabul edilmektedir. Moleküler seviyede, çeşitli protein modifikasyonları, hücre içi relocalizations ve sinaptik proteinlerin devir değişiklikler 1-4 (Lamprecht, 2004 # 8) tarif edilmiştir. Ancak, çoğu şimdiye kadar yapılan çalışmalar oldukça küresel ancak karmaşık sinaptik proteom kompozisyon daha seçilen proteinler üzerinde duruldu. Mevcut yaklaşım öğrenme deneyinde sonra fare beyin bölgelerinde sinaptik proteom değişiklikler için tarafsız bir tarama sağlar. Sinaptik mimarisinin öğrenme kaynaklı yeniden yapılanma zaman noktası bağımlı moleküler anlık işlemek için uygundur. açıklanan iş akışı hayvan davranışları, protein biyokimyası, kütle spektrometresi ve bioi farklı uzmanlar belirli bir ekip çalışması gerektirirnformatics. Seçilen öğrenme paradigması, yani frekans modüle ton ayrımcılık (FMTD), kemirgenler 5 iyi karakterize işitsel ayrımcılık iştir. Bu mekik kutusunun Git / öğrenme ve uzun süreli bellek oluşumu No-Go-görev artmış kortikal dopamin sinyalizasyon ve protein sentezi bağlı mekanizmaları içermektedir. Buna göre, Gerbils ve fareler üzerinde son proteomik çalışmalar, dopamin ve kortikal sinaptik bileşenlerin öğrenme kaynaklı plastik yeniden düzenlemeleri, aynı zamanda sözde FMTD öğrenme ve hafıza 6-8 sırasında etkileşim daha bazal beyin bölgelerinde ortaya çıkardı. Bu bellek oluşumu, çeşitli beyin bölgelerinde karmaşık bir etkileşim gerektirir ve bu nedenle, farklı şekilde proteom düzeyinde bu bölgeler içinde düzenlenir olabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, seçilen kortikal ve subkortikal fare beyin bölgelerinin diseksiyonu iş akışında yer almaktadır. Ayrıca güvenilir characterizatiHatta sinaptik protein bileşimi zayıf değişiklikler üzerinde öncesi ve postsinaptik bölmeleri bir zenginleştirme yerine homojenatlarında veya ham membran fraksiyonları 9 analizini gerektirir. Önceden proteomik analiz nedenle, sinaptozomlarda hazırlanması kurulan kullanılabilme protokolleri tespit seviyesi ve sinaps özgü protein 10,11 dinamik aralığını artırmak amacıyla tarif edilmektedir. Nicel amaçlar için etiket ücretsiz yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanmak için önemli bir ön koşul protein örneklerinin yüksek bir benzerlik derecesidir. Olarak sinaptik protein bileşimi oldukça küçük değişiklikler, bir etiket içermeyen bir yaklaşım eğitimli ve naif farelerden elde edilen protein örneklerinin gelen karşılaştırmak uygun olacaktır öğrendikten sonra gerçekleşmesi bekleniyor. Seçenek olarak ise, sabit izotopları (örneğin, TMT, iTRAQ, ICPL ve SILAC) ve MS2 temelli etiket bilgilerini nereye kullanılarak protein / peptid durumu spesifik bir etiket stratejilerintification (SWATH) faydalıdır, ancak seçilen etiket içermeyen bir yaklaşımla daha pahalıdır ya da özel kitle spektrometresi donanım gerekir. proteomik gösterimleri genellikle karmaşık veri kümelerini verim beri, biyoinformatik işleme uygun veri yorumlanması için tavsiye edilir. Ek meta-analizler paradigma ilgili değişiklikler ve tutulan anahtar hücresel süreçleri ve sinyal yollarının belirlenmesini altında yatan potansiyel moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını destekleyebilir. Uygun yöntemler, aynı zamanda, aşağıda tarif edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>3 M Empore Katı Faz Ekstraksiyonu - Filtre</td><td>3M Biyoanalitik Teknolojiler</td><td>4245SD 7</td><td>mm/3 ml</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td>164564</td><td>100 &mikro; m x 2 cm, C18</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td>164569</td><td>75 & mikro; m x 25 cm, C18</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3738.1</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril (ACN)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE70.2</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid (%30)</td><td>AppliChem</td><td>A0951</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum hidrojen karbonat&nbsp; &nbsp;</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit&nbsp;</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>44273</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat&nbsp; (APS)</td><td>AppliChem</td><td>A2941</td><td></td></tr><tr><td>Biyofüj pico</td><td>Heraeus GmbH</td><td>75003280</td><td></td></tr><tr><td>Mavi R-250&nbsp;</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>17525</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>17132901</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J fareler</td><td>Charles River&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cantharidin</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3322.1</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 Beckman</td><td>Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr> için <tr><td>santrifüj tüpleri TLA 100.1 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> için santrifüj tüpleriAppliChem <td></td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R santrifüj</td><td>VWR</td><td>22636138</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf A-8-11 rotor</td><td>VWR</td><td>5407000317</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Fluka</td><td>14265</td><td></td></tr><tr><td>GeneCodis</td><td>http://genecodis.cnb.csic.es/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gephi</td><td>https://gephi.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gliserol</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>AppliChem</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>HALT Fosfataz İnhibitör Kokteyli&nbsp;</td><td>Pierce /Thermo Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Tampon çözeltisi&nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH</td><td>S11-001</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizasyon kabı 2 ml</td><td>Sartorius AG</td><td>854 2252</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Yaratıcılık Yolu Analizi</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid (IAA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar sondaj tahriki &nbsp; K-KontrolTLC 4957&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Kaltenbach & Vogt GmbH</td><td>182997</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos Pro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macs-mix tüp döndürücü</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Magic Scan 4.71</td><td>UMAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AE71.2</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>364300</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Önceden Boyanmış Protein Merdiveni</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS 7.5</td><td>Biyoinformatik Çözümler&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfataz İnhibitörü Kokteyli 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>FosfoRS 3.1</td><td>IMP/IMBA/GMI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>PTFE'den yapılmış piston/havan tokmağı</td><td>Sartorius AG</td><td>854 2651</td><td></td></tr><tr><td>PotterS homojenizatör</td><td>Sartorius AG</td><td>853 3024</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü komple mini</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Bir Adet 4.5.1</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Sular</td><td>186002122</td><td></td></tr><tr><td>Mekik kutusu</td><td>Coulbourne Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesilsülfat (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>A1112</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum molibdat</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>274.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum tartrat dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>SONOREX RK 156 Ultrasonik Banyo</td><td>BANDELIN electronic GmbH & Co. KG</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>Ses geçirmez oda</td><td>Endüstriyel Akustik Şirketi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametil etilen -1,2-diamin (TEMED)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer basic</td><td>CallMedia</td><td>111000</td><td></td></tr><tr><td><a name="RANGE! A60">Titansphere TiO 5 ve mikro; m</a></td><td>GL Sciences Inc. Japonya</td><td>502075000</td><td></td></tr><tr><td>TLA 100.1 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>Trifloro asetik asit&nbsp; (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan (TRIS)</td> <td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin Altın</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Ultra HPLC ve nbsp;</td><td>Dionex/Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpü</td><td>Beckman Coulter</td><td>343776</td><td></td></tr><tr><td>Unijet II Soğutmalı Aspiratör</td><td>Uniequip Laborger&auml; te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UNIVAPO 100 H Yoğunlaştırıcı Santrifüj&nbsp;</td><td>Uniequip İşçi&auml; te- und Vertriebs GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>AppliChem</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>Su (yüksek kaliteli arıtılmış)</td><td></td><td></td><td>Direnç: > 18,2 M&Omega;*cm, 25 &°C; C&nbsp; Pirojenler: < 0.02 EU/ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; İçindekiler: < 10 ppb</td></tr><tr><td>Xcalibur 3.0.63</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18 Pipet Uçları</td><td>MILLIPORE</td><td>ZTC18S960</td><td></td></tr></tbody></table>

İşitsel ayrımcılık Öğrenme sonra fare beyin bölgeler yüksek Çözünürlüklü sayısal synaptic proteome profil

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

İşitsel öğrenme ve hafızanın altında yatan moleküler sinaptik mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada, farelerde işitsel ayrımcılık öğrenimi üzerine proteomik bir çalışmanın iş akışı açıklanmaktadır. Bu öğrenme paradigmasında, fareler, hafif bir elektrik ayak şokunu önlemek için yükselen ve düşen frekans modülasyonlu tonlar arasında ayrım yapmak için bir mekik kutusu Go / NoGo görevinde eğitilir. Protokol, eğitimin farklı aşamalarında işitsel korteks, frontal korteks, hipokampus ve striatum olmak üzere dört beyin bölgesinden sinaptozomların zenginleştirilmesini içerir. Eğitimli farelerden elde edilen sinaptik protein ekspresyon paternleri, proteomik bir yaklaşım kullanılarak naif kontrollerle karşılaştırılır. Yeterli analitik derinliğe ulaşmak için numuneler, kütle spektrometresinden önce 1D SDS-PAGE/jel içi sindirim, çözelti içi sindirim ve fosfo-peptit zenginleştirme olmak üzere üç farklı şekilde fraksiyonlanır. 
 Sinaptozomal protein örneklerinin fosfo-peptit tükenmiş ve fosfo-peptitten zenginleştirilmiş fraksiyonlarındaki sinaptik protein profillerini incelemek için kütle spektrometresi üzerinde yüksek çözünürlüklü proteomik analiz ve etiketsiz miktar tayini kullanılır. Önemli ölçüde düzenlenmiş nispi sinaptik bolluk seviyelerine (eğitimli/saf kontroller) sahip proteinleri ve fosfo-peptitleri ortaya çıkarmak için ticari bir yazılım paketi kullanılır. Eğitimden sonra farelerin araştırılan beyin bölgelerinde sinaptik proteom için ortak ve diferansiyel düzenleme modları gözlendi. Daha sonra, altta yatan hücresel fonksiyonları ve biyolojik yolları tanımlamak için çeşitli veri tabanları kullanan meta-analizler kullanılır.

Şekil 1 işitsel ayrımcılık öğrendikten sonra fare beyin bölgelerinde kantitatif sinaptik proteom profil tam iş akışı özetlenmektedir. Bir mekik kutusunun hayvan eğitimi ile başlar. Şekil 2&#39;de gösterilen örnekte, farenin etkin öğrenme gösteren, 4. antrenman önemli FM sesi ayrımı göstermeye başladı. Hayvanlar beyin bölgesi diseksiyon için seçilen zaman noktalarında kurban edilmiştir. Sinaps gerekli zenginleştirilmesi ya sinaptozomlarda hazırlanması ile elde edilebilir ya PSD zenginleştirme yöntem şöyle ki düşük doku miktarları için geliştirilmiştir alternatif olarak bir PSD zenginleştirilmiş fraksiyonun hazırlanması, her iki Şekil 3&#39;te detaylı olarak tarif, örneğin, 1 - sıçan beyninde 12, 18 2 hipokampal dilim. Küçük tüpler, bu tüplere uydurma PTFE havan ve havan tokmağı güç sağlamak için bir laboratuvar delme sürücü gerektirir. Nedeniyle Sinaptozomlarda özel bir protein bileşimine, kuvvetle iki farklı fakat birbirini tamamlayıcı şekilde numune hazırlama gerçekleştirmek için tavsiye edilir. PİO&#39;lara iskeleleri genellikle yüksek stoikiometride meydana gelen, çok yüksek moleküler ağırlıklı proteinler bulunmaktadır. In-çözelti sindirimi verimli onları ayıklamak için ancak üretilen peptid karışımı bir oversampling yol açabilir en iyi yoldur. -jel, bu yüksek molekül ağırlıklı proteinler dahil, orta ve düşük molekül ağırlığına sahip proteinlerin analizi destekleyebilir paralel aynı örnek gerçekleştirilir sindiremez. Kapsamlı bir analiz için proteolitik sindirimi her iki tip tavsiye edilir. olan beyin alanlarında dokuların farklı miktarlarda iyi karşılaştırma için uygulanan malzemeden bir ayarlanmalıdır. Dört incelenen beyin alanları içerisinde işitsel korteks genellikle sınırlayıcı bir gerçektirveya. Diğer tüm beyin alanlarının malzeme dikkatlice sinaptozomlarında veya PSD zenginleştirilmiş fraksiyonların hazırlandıktan sonra işitsel korteks miktarına göre ayarlanmalıdır (3.1.1 bkz.). şu şekilde farelerden taze hazırlanmış beyin alanlarının tipik ağırlıkları: işitsel korteks (AC): ~ 50 mg; hipokampus (HIP): ~ 90 mg; striatum (STR): ~ 120 mg ve frontal korteks (FC): ~ 100 mg. Bölüm 2.3&#39;te tarif edilen PSD zenginleştirme yöntemi yaklaşık 1500 farklı protein ve tek bir hayvana (Tablo 1) düzeyinde beyin bölgesi başına yaklaşık 250 farklı fosfo-peptidlerin tanımlanmasına izin verdi. 24 saat ilk antrenmandan sonra proteomik analizi tespit proteinlerin% 7.3 ve fosfo-peptidlerin% 5.8 anlamlı (p &lt;0.05) naif kontrollerle (Tablo 1) ile karşılaştırıldığında onların sinaptik ifade kantitatif değişiklikler gösterdi olduğunu ortaya koydu. aşağı termostatın için göze çarpan eğilimsinaptik iskelelerinin yon FMTD öğrenme erken dönemlerinde sinaptik mimarisi belirgin yeniden düzenlenmesi işaret edebilir. Sadece% 22, iki ya da daha fazla beyin bölgelerinde düzenlenir bulunmuştur ise düzenlenmiş proteinlerin büyük bir kısmı, bir beyin bölgesi özel bir şekilde değiştirildi. Altı Seçilen örnekler Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. &quot;RhoA Sinyal&quot;, &quot;Notch Sinyal&quot; Klatrin aracılı endositoz Sinyal &quot;,&quot; aksonal Rehberlik Sinyal &quot;,&quot; Kalsiyum Sinyali: &quot;IPA karmaşık sonuçların meta-analizi aşağıdaki kanonik yolların belirli katılımı / manipülasyon için kanıt sağlar &quot;,&quot; Epitel adherens Eklemlerinin Yaptırma &quot;,&quot; Glutamat Reseptör Sinyalizasyon &quot;,&quot; GABA Reseptör Sinyalizasyon &quot;,&quot; Dopamin Reseptör Sinyalizasyon &quot;ve&quot; Synaptic Uzun Vadeli potansiyelize &quot;. <p class="jove_content" fo:keep-together.withsayfa = &quot;1&quot;&gt; Tek zenginleştirme analizi protein taşıma, hücre yapışması, fosforilasyon, endositoz, vezikül aracılı taşıma, ön beyin gelişimi ve axonogenesis (Şekil 5) ile ilgili frontal korteks önemli yoğunlaştığından biyolojik süreçleri ortaya çıkardı. iyon taşıma, çeviri, mRNA taşıma dahil olmak üzere işitsel korteks biyolojik süreçlerde protein taşıma ve öğrenme fark vardı. hipokampus protein fraksiyonunun analizi anlamlı iyon taşıma, hücre döngüsü, çeviri, fosforilasyon ve sinir sistemi gelişimi ile ilgili zenginleştirilmiş süreçleri algılar. striatum mRNA nakliye, vezikül aracılı taşıma, axonogenesis, proteoliz, protein taşınmasına ve endositoz dahil olmak üzere biyolojik işlemler bulunmuştur aşırı temsil. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig1.jpg" /> Şekil 1: Sistematik WorkfloMetodolojik Yaklaşım w. Bu rakam şematik beyin alana özgü sinaptik protein bileşiminin yüksek çözünürlüklü sayısal profilleme iş akışını özetlemektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54992/54992fig2.jpg" /> Şekil 2: FM Ton Ayrımcılık Görev içinde Fare Performans örneği. Hayvanlar hit artan oranı (mavi eğri) ve eğitim oturumları sırasında yanlış alarm azalan oranı (siyah eğri) gösterir. Önemli ayrımcılık dördüncü oturumda gerçekleşir. Hata çubukları SEM olarak verilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig2large.jpg" target="_blank">Bir LAR görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın ger sürümü. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54992/54992fig3.jpg" /> Şekil 3: sinaptozom ve PSD zenginleştirilmiş Kesir hazırlanması. C: sinaptozom hazırlanması. B: PSD zenginleştirilmiş fraksiyon hazırlanması. Her iki rakamlar beyin dokularından sinaptozomlarında veya alternatif PSD zenginleştirilmiş fraksiyonların hazırlanması detaylı iş akışını açıklar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54992/54992fig4.jpg" /> Şekil 4: Seçilen Kantitatif proteomik Sonuçları. Seçilen proteinlerinin nispi sinaptik bolluğu farenin tra arasında karşılaştırıldı(AV n = 6) FMTD görev ve naif kontrol fareleri (NV, n = 6) 24 saat sonra ilk eğitim oturumu çağırın. bolluğu değerleri proteininin üç en yoğun peptidlerin pik alanlarının ortalaması olarak hesaplanmıştır. önemli bolluk değişiklikleri (AV / NV; t-testi) ile Proteinler araziler içinde işaretlenmiştir: * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.005. Hata çubukları SD olarak verilmektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54992/54992fig5.jpg" /> Şekil 5: GeneCodis / Gephi tarafından Frontal Cortex Biyolojik Pathways Görselleştirme. Üç minimum protein sayısı ile &quot;Biyolojik süreci&quot; ile ilgili Gen Ontoloji (GO) veritabanı (http://geneontology.org) tek önemli terimler<html> burada gösterilmektedir. Düğümler GO terimleri temsil düğümün büyüklüğü, belirli bir düğümün bağlantı çizgi genişliği ve sayı diğer düğümlerle bu GO terimi paylaşan proteinlerin sayısını tasvir. Nedeniyle Gephi ve &quot;Kuvvet Atlası&quot; yöntemine, ilgili düğümleri birlikte yakından kümeleme vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54992/54992fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> beyin bölgesi </td><td> AC </td><td> FC </td><td> KALÇA </td><td><html> 000 &quot;face =&quot; Calibri &quot;size =&quot; 3 &quot;&gt; STR </td><td> Σ </td></tr><tr><td> tanımlanan proteinler </td><td> 1435 </td><td> 1758 </td><td> 1572 </td><td> 1507 </td><td> 6272 </td></tr><tr><td> düzenlenmiş proteinler (p &lt;0.05) </td><td> 59 </td><td> 130 </td><td> 162 </td><td> 108 </td><td>face = &quot;Calibri&quot; size = &quot;3&quot;&gt; 459 </td></tr><tr><td> ↑ AV / NV </td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 76 </td><td> 35 </td><td> 123 </td></tr><tr><td> ↓ AV / NV </td><td> 51 </td><td> 126 </td><td> 86 </td><td> 73 </td><td> 336 </td></tr><tr><td> tespit phosphomoti<html> fs </td><td> 197 </td><td> 361 </td><td> 273 </td><td> 278 </td><td> 1109 </td></tr><tr><td> düzenlenmiş phosphomotifs (p &lt;0.05) </td><td> 8 </td><td> 22 </td><td> 21 </td><td> 14 </td><td> 65 </td></tr><tr><td> ↑ AV / NV </td><td> 4 </td><td>00000 &quot;face =&quot; Calibri &quot;size =&quot; 3 &quot;&gt; 17 </td><td> 5 </td><td> 9 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> ↓ AV / NV </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 16 </td><td> 5 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Proteomik Sonuç Özeti. Bu tablo eğitimli fareler temsilcisi proteomik deneyi özetler (AV n = 6) kendi saf kontrollerle karşılaştırıldığında ilk antrenmandan sonra 24 saat (NV, n = 6).459 düzenlenmiş proteinlerin toplamı örtüşen düzenlemeler içermektedir. 283 farklı düzenlemeler beyin özgü olarak belirlendi. Ayrıntılı olarak, 57 proteinler iki beyin bölgelerinde düzenlenir, 18 protein düzenlemeleri üç beyin bölgelerinde tespit edildi ve sadece 2 proteinler dört incelenen beyin bölgelerinde düzenlenir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Hata toleransı </td></tr><tr><td> haberci kütlesi (Fourier dönüşüm kütle spektrometresi) </td><td> 10 ppm </td></tr><tr><td> fragmanı iyon kütle (lineer iyon tuzağı) </td><td> 0.6 Da </td></tr><tr><td> Peptid başına maksimum cevapsız bölünmeler </td><td> 3 </td></tr><tr><td> sabit değişiklikler </td></tr><tr><td> in-jel sindirilmiş numuneler </td><td> Sistein karbamido </td></tr><tr><td> ile ilgili olarak numunelerde çözeltisi sindirilmiş </td><td> MethylthiolatioSistein n </td></tr><tr><td> değişken modifikasyonlar </td><td> Metionin oksidasyonu </td></tr><tr><td></td><td> Asparagin ve / veya Glutamin Deamidations </td></tr><tr><td> veritabanı </td><td> Unıprot / Sprot </td></tr><tr><td> Taksonomi </td><td> fare </td></tr><tr><td> İstatistiksel tanımlama-kabul ayarları </td></tr><tr><td> de novo ortalama yerel güven (ALC) </td><td> &gt;% 50 </td></tr><tr><td> Peptit-yanlış keşif oranı (FDR, est dayalı. Tuzak-füzyon) </td><td> &lt;% 1 </td></tr><tr><td> Protein önemi (-10logP, modifiye T-testine göre) </td><td> &gt; 20 </td></tr><tr><td> özgü peptidler / protein </td><td> ≥ 1 </td></tr><tr><td> Niceleme ayarları: </td></tr><tr><td> ölçümü durumunda kullanılan peptitler: </td></tr><tr><td> Peptit önemi (-10logP) </td><td> &gt; 30 </td></tr><tr><td> Peptid kimliği </td><td> Numunelerin ≥% 50 </td></tr><tr><td> Peptit sinyal kalitesi </td><td> &gt; 1 </td></tr><tr><td> Peptit ortalama alan </td><td> &gt; 1E5 </td></tr><tr><td> Peptit tutma süresi tolerans </td><td> &lt;5 dakika </td></tr><tr><td> normalleştirme </td><td> toplam iyon akımı (TIC) </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Protein tanımlanması için Ayarlar (adım 4.2.2).

Sinaptik plastisiteyi ve hafızayı kontrol eden moleküllerin ve yolakların tanımlanması, sinirbilimde hala büyük bir zorluktur. Burada, işitsel bir öğrenme paradigmasında öğrenme ve hafıza konsolidasyonu sırasında sinapsların moleküler yeniden düzenlenmesinde rol oynadığı varsayılan sinaptik proteinlerin göreceli nicelleştirilmesini ele alan bir iş akışı açıklanmaktadır.

İşitsel Ayrımcılık Öğrenme sonra Fare Beyin Bölgeler Yüksek Çözünürlüklü Sayısal Synaptic Proteome Profil

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Bu proteomik yaklaşımın genel amacı, temel mekanizmaları ve sinyal yollarını anlamak için öğrenme ve bellek oluşumundan sonra sinapslardaki moleküler yeniden organizasyonun karakterize edilmesidir. Bu tekniğin temel avantajı, sinaptik proteomlar içindeki translasyon sonrası modifikasyonların geniş ölçekli kantifikasyonuna ve karakterizasyonuna olanak tanıyan hipotezden bağımsız bir yaklaşım sunmasıdır. Kurduğumuz iş akışı, belirli bir moleküler değişim ile belirli bir davranış arasında korelasyon kurulmasına imkan tanır.Öğrenme ve bellek oluşumu, sinaptik etkinliğin değişimlerine dayanır; bu nedenle proteomik çalışmalar, beyin dokusu homojenatlarından ziyade sinaptozomlar gibi sinaptik yapıların analizine daha fazla odaklanmalıdır. Proteomik sonuçlar oldukça karmaşık veri setlerini temsil eder, bu nedenle biyoinformatik işleme gerektirir. Eğitime, test faresini ses yalıtımlı bir oda içerisindeki loş ışıklı bir mekik kutusuna yerleştirerek başlayın.İşitsel ayırt etme öğrenimi için tamamen bilgisayar kontrollü bir öğrenme çizelgesi kullanın. Eğitim oturumuna başlamadan önce üç dakikalık bir sessizlikten oluşan alıştırma dönemi ile başlayın. "Go" denemeleri sırasında, hayvanın bir isabet puanı kazanması için ton sunumundan sonraki altı saniye içinde engeli geçmesi gerekir.No-go denemeleri sırasında hayvan, altı saniyelik ton sunumu boyunca shuttle box'ın mevcut bölmesinde kalmalıdır. Bir oturum 60 denemeden oluşacak ve yaklaşık 25 dakika sürecek şekilde, denemeler arası 20 saniyelik bir aralıkla, psödo-rastgele bir sırada 30 go denemesi ve 30 no-go denemesi gerçekleştirin. Tüm denemeler tamamlandıktan sonra, eğitilen fareyi sakrifiye edilene kadar ana kafesine geri koyun.Fareyi sakrifiye edip beyni çıkardıktan sonra, kan damarları ve yüzey şekli gibi görsel işaretçileri kullanarak işitsel korteksi lokalize edin. Ardından, işitsel korteksi dikdörtgen bir doku bloğu şeklinde bilateral olarak diseke etmek için bir skalpel ve iğne kullanın. İşaretçi olarak chiasma opticum'u kullanarak, frontal korteksi Bregma 3.56 ile 1.54 arasında bir beyin kesiti olarak diseke edin.Striatumu, Bregma 1.54 ile 0.5 arasında bir beyin kesiti şeklinde diseke edin. Kortikal dokuyu dikkatlice uzaklaştırın. Beyni, serebellum üzerinden bir iğne ile sabitleyerek ve korteksi oksipital lobdan başlayarak çözerek hipokampusu diseke edin.Disekte edilmiş beyin örneklerini sıvı azot içerisinde şok dondurma işlemine tabi tutun. Disekte edilen beyin dokusunu, bir mililitre buz gibi soğuk Tampon A içeren homojenizasyon kaplarına aktararak sinaptozom saflaştırma işlemine başlayın. Ardından dokuyu, yaklaşık 12 strok kullanarak 900 RPM hızında homojenize edin. Örnekleri 1.000 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüjden sonra süpernatantları saklayın. Peleti daha önce olduğu gibi yeniden homojenize edin ve süpernatantları birleştirin. Birleştirilmiş süpernatantları 12,000 ×g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Peletleri bir mililitre homojenizasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve 900 RPM'de altı strok ile homojenize ettikten sonra 1,200 ×g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.P2 peletlerini üretmek için gerçekleştirilen santrifüj işlemi sırasında, ultrasantrifüj tüplerinde sukroz basamak gradyanları hazırlayın. 2.5 milliliters 1.0 molar sukroz tamponu ile başlayın ve ardından 1.5 milliliters 1.2 molar sukroz tamponunu alt katman olarak eklemek için cam bir Pasteur pipeti kullanın. Santrifüj işleminin ardından, P2 peletlerine 0.5 milliliters 0.32 molar sukroz tamponu ekleyin.Ardından altı darbe kullanarak yeniden homojenize edin. Homojenize edilmiş fraksiyonları gradyanların üzerine yükleyin. Yüklenen gradyanları sallanan kova tipi bir rotora yerleştirin ve ardından bir ultrasantrifüjde iki saat boyunca 85,000 ×g hızında döndürün.Santrifüj işlemi tamamlandığında, 1.0 molar sukroz tamponu ile olan ara yüzeydeki materyal de dahil olmak üzere üstteki 0.32 molar sukroz tabakasını atın. Sinaptozomları, 1 ile 1.2 molar sukroz tamponu ara yüzeyinden toplayın. Sinaptozomal fraksiyona 1.1 oranında 0.32 molar sukroz tamponu ekleyin.Dikkatlice karıştırın ve 150,000 ×g hızında bir saat boyunca santrifüjleyin. Sinaptozomlar pellet kısmında yer alır ve daha ileri işlemler için bir tampon çözeltide yeniden süspanse edilebilir. Bir hayvanın her beyin bölgesinden elde edilen sinaptozomları, bir ultrasonik banyoda buz üzerinde bir saat inkübe ederek 20 ila 50 µL 8 M üre içerisinde çözün.Final konsantrasyonun 2 M urea olmasını sağlamak için %1 oranında uzaklaştırılabilir bir deterjan ile seyreltin. SDS-PAGE kullanarak göreceli protein miktarlarını belirledikten sonra, her örneğin kalan kısmının üçte birini yeni bir tüpe pipetleyin. 2 mM DTT ve 25 mM amonyum bikarbonat ekleyerek çözelti içi sindirimi gerçekleştirin ve örneği hafifçe vorteksleyin.Numuneleri 20 °C'de 45 dakika boyunca indirgeyin. Sistein kalıntılarını karbamidometillemek için 10 mM iota acedomide ekleyin ve karıştırın. 20 °C'de, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.Son olarak, bir mikrolitre tripsin stok çözeltisi ekleyin ve 20 °C'de 12 saat boyunca inkübe edin. Asitle parçalanabilen deterjanı uzaklaştırmak için, son konsantrasyon yüzde bir olacak şekilde trifloroasetik asit ekleyin ve 20 °C'de bir saat daha inkübe edin. Numuneleri 16.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, süpernatanları dikkatlice toplayın.Katı faz ekstraksiyon kolonunu bir rafa yerleştirin ve matrisi iki mililitre metanol ile dengeleyin. Yıkama işleminden sonra, iki mililitre daha Tampon B ekleyin ve örneği yükleyin. Tampon B ile üç kez yıkadıktan sonra, 200 mikrolitre %70 asetonitril ve %0,1 trifloroasetik asit ekleyerek peptidleri elüe edin.Ardından, saflaştırılmış örnekleri vakumlu bir santrifüjde kurutun. Bu örnekte, FM ton ayrımı görevi üzerine eğitilen hayvanlar, eğitim oturumları boyunca artan bir isabet oranı ve azalan bir yanlış alarm oranı göstermektedir. Anlamlı ayrım, dördüncü oturumdan itibaren gerçekleşmektedir.Seçili proteinlerin göreceli sinaptik bollukları, FM tonu ayırt etme görevinde eğitilen fareler ile eğitimden 24 saat sonraki saf kontrol fareleri arasında karşılaştırılır. Eğitimden sonra, incelenen tüm bölgelerde CYFP2 protein seviyeleri değişir. Hayvanların sıklıkla birey içi değişkenlikler sergilediğini unutmayın.Bu nedenle, çalışmaya iyi eşleştirilmiş hayvan gruplarından en az beş veya daha fazla biyolojik tekrarın dahil edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Bir kez kurulduğunda, bu teknik diğer türlere kolayca uyarlanabilir. Örneğin, tekil meyve sineği beyinlerinde öğrenmeye bağlı protein ekspresyon değişikliklerini izlemek için kullanılmıştır.

high-resolution-quantitative-synaptic-proteome-profiling-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, ayrışmış nöronal kültür ve immünsitokimya kullanarak beyin bölümlerinde de sinaps sayısını ölçmek için nasıl ayrıntıları. Kompartman-spesifik antikorların kullanarak, presinaptik terminalleri yanı sıra postsinaptik uzmanlık siteleri etiket. Biz bu belirteçler tarafından oluşturulan sinyaller arasındaki sinaps ko noktaları olarak tanımlar.

Sinapslar miktarının: Synapse Numarası ölçmek için bir İmmünositokimya tabanlı Testi

Bu video, belirli bir presinaptik proteinin dağılımını ölçmek için bir fare beyin diliminin immünofloresan boyamasını göstermektedir. İşlem, spesifik olmayan bölgelerin bloke edilmesini, hedef protein için birincil antikorların ve bir referans işaretleyicinin uygulanmasını, ardından ikincil antikor etiketlemesini ve nükleer karşı boyamayı içerir. Referans işaretleyici, tutarlı bir taban çizgisi sağlayarak doğru niceleme sağlar ve presinaptik proteinin dağılımı, konfokal mikroskopi kullanılarak...

İmmünofloresan Kullanarak Fare Beynindeki Bir Presinaptik Proteinin Dağılımının Ölçülmesi

Bu videoda, aşağı akış analizleri için donmuş fare beyin dokusu kesitlerinin hazırlanmasına yönelik ayrıntılı bir adım adım protokol gösterilmektedir.

Aşağı akış analizi için bir fare beyninin işlenmesi

Bu protokol, fareler öğrenme ve hafıza görevleriyle meşgulken ayrı beyin bölgelerindeki nöronal aktivitenin geçici olarak ve uzaktan nasıl susturulacağını açıklar. Yaklaşım, farmakogenetiği (Tasarımcı-Reseptörler-Özel-Tasarımcı-Tarafından-Aktive Edilen-İlaçlar), öğrenmenin farklı bileşenlerini ayırt etmek için tasarlanmış davranışsal bir paradigma (duyusal ön koşullandırma) ile birleştirir.

Öğrenmenin Ayrık Aşama sırasında Kemirgenler uzaktan suskunluğu Sinir Aktivitesi Bir Yöntem

Biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için bir immünohistokimya protokol açıklar. Bu protokol bilişsel karakterize hem genetik ya da farmakolojik fare modellerine uygulanabilir.

Nörogelişimsel Bozukluklar Fare Modeli Mekansal Öğrenme ardından Hipokampal Nöron Faaliyet immünohistokimyasal Görselleştirme

Burada, bir sinaptik protein ayirt boyama kullanarak işaret protein, confocal mikroskobu ve bilgisayar tabanlı analiz göre dağılımını belirlemek için nicel bir yaklaşım açıklar.

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

Bu yazıda normal farelerde morfolojik özellikleri ve kurdele sinüslerinin fonksiyonel durumunu değerlendirmek için deneysel bir protokol açıklanmaktadır. Bu model aynı zamanda gürültüye bağlı ve yaşa bağlı Cochlear synaptopathy-kısıtlanmış modeller için de uygundur. Önceki fare çalışmalarından gelen göreli sonuçlar da tartışılmaktadır.

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Bu protokol, kemirgen beynin farklı hücresel bölmeler içinde Ubiquitin-proteasome sistemi (UPS) etkinliğini verimli bir şekilde ölçmek için tasarlanmıştır. Kullanıcılar, aynı hayvanlarda nükleer, sitoplazmik ve sinaptik fraksiyonlar içinde çalışan UPS 'i inceleyebilir, bu karmaşık analizleri gerçekleştirmek için gereken zaman ve hayvan sayısını azaltır.

Subcellular Ubiquitin ölçümü-kemirgen beyinde proteasom aktivitesi

Erişkin farelerden gelen akut dilimlerde tek kortikostatal glutamaterjik sinapslarda glutamat salınımı ile açıklık arasındaki dengeyi değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Bu protokol glutamat tespiti için floresan sensör iGluu, sinyal alımı için bir sCMOS kamera ve odak lazer aydınlatma için bir cihaz kullanır.

Normal ve Huntington Farelerden Akut Beyin Dilimlerinde Glutamat Salınımı ve Alımının Tek Sinaps Göstergeleri

Bu protokol, yerel alan potansiyellerini kaydetmek ve fare hipokampusu ve prefrontal korteksindeki bilgi akışını araştırmak için özel olarak tasarlanmış bir kayıt cihazının ve elektrotların kullanımını ana hatlarıyla belirtir.

Fare Hipokampusu ve Prefrontal korteksinde ikili hücre dışı kayıtlar

Öğrenin, farelerde işitsel ayrımcılık öğrenmesi sonrası sinaptik proteomlarda moleküler reorganizasyonu karakterize etmek için proteomik analiz yöntemlerini. Bu hesaplamalı yaklaşım, bellek oluşumundaki sinyal yollarını anlamaya yardımcı olur.

İşitsel Ayrımcılık Öğrenme sonra Fare Beyin Bölgeler Yüksek Çözünürlüklü Sayısal Synaptic Proteome Profil

Daha fazla video keşfet