İşitsel Ayrımcılık Öğrenme sonra Fare Beyin Bölgeler Yüksek Çözünürlüklü Sayısal Synaptic Proteome Profil

Bu proteomik yaklaşımın genel amacı, temel mekanizmaları ve sinyal yolaklarını anlamak için öğrenme ve hafıza oluşumundan sonra sinapslarda moleküler yeniden düzenlemenin karakterizasyonudur. Bu tekniğin ana avantajı, sinaptik proteomlar içindeki translasyon sonrası ve modifikasyonların büyük ölçekli nicelleştirilmesine ve karakterizasyonuna izin veren hipotezsiz bir yaklaşımdır. Yerleşik iş akışımız, belirli bir moleküler değişiklik ile belirli bir davranış arasında bir korelasyon sağlar.

Öğrenme ve hafıza oluşumu sinaptik etkinlikteki değişikliklere dayanır ve bu nedenle proteomik çalışmalar, beyin dokusundaki homojenatlardan ziyade sinaptozomlar gibi sinaptik yapıların analizine odaklanmalıdır. Proteomik sonuçlar oldukça karmaşık veri kümelerini temsil eder, bu nedenle biyoinformetik işleme gerektirir. Test faresini ses geçirmez bir oda içinde loş ışıklı bir mekik kutusuna yerleştirerek eğitime başlayın.

İşitsel ayrımcılıkla öğrenme için tamamen bilgisayar kontrollü bir öğrenme programı kullanın. Egzersiz seansına başlamadan önce üç dakikalık sessizlik alışkanlığı ile başlayın. Go denemeleri sırasında, hayvanın bir isabet elde etmek için ton sunumundan sonraki altı saniye içinde engeli geçmesi gerekir.

Hareketsiz denemeler sırasında, hayvanın altı saniyelik ton sunumu sırasında mekik kutusunun mevcut bölmesinde kalması gerekir. Bir oturumun 60 denemeden oluşması ve yaklaşık 25 dakika sürmesi için 20 saniyelik bir deneme arası aralıkla, sözde randomize bir sırayla 30 deneme ve 30 denemesiz deneme gerçekleştirin. Tüm denemeler yapıldıktan sonra, eğitimli fareyi kurban edilene kadar ev kafesine geri koyun.

Fareyi feda ettikten ve beyni çıkardıktan sonra, kan damarları ve yüzeyin şekli gibi görsel yer işaretlerini kullanarak işitsel korteksi lokalize edin. Daha sonra işitsel korteksi dikdörtgen bir doku bloğu olarak bilateral olarak incelemek için bir neşter ve iğne kullanın. Kiasma opticum'u bir dönüm noktası olarak kullanarak, frontal korteksi Bregma 3.56 ve 1.54 arasında bir beyin dilimi olarak inceleyin.

Striatumu Bregma 1.54 ve 0.5 arasında bir beyin dilimi olarak inceleyin. Ve kortikal dokuyu dikkatlice çıkarın. Beyni iğne ile beyincik boyunca stabilize ederek ve oksipital lobdan başlayarak korteksi çözerek hipokampusu inceleyin.

Sıvı nitrojen içinde şok dondurma disseke beyin örnekleri. Diseke beyin dokusunu bir mililitre buz gibi soğuk Tampon A içeren homojenizasyon kaplarına aktararak sinaptozom saflaştırmasına başlayın. Daha sonra dokuyu yaklaşık 12 vuruş kullanarak 900 RPM'de homojenize edin. Numuneleri 10 dakika boyunca 1.000 kez G'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra süpernatanları saklayın. Peletleri daha önce olduğu gibi yeniden homojenize edin ve süpernatanları birleştirin. Kombine süpernatanları 12.000 kez G'de 20 dakika boyunca döndürün, Peletleri bir mililitre homojenizasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve 900 RPM'de altı vuruşla homojenize edin, ardından 20 dakika boyunca 1.200 kez G'de santrifüjleyin.

Santrifüjleme sırasında, P2 peletlerini üretmek için, ultrasantrifüj tüplerinde sakaroz adım gradyanları hazırlayın. 2,5 mililitre 1,0 molar sükroz tamponu ile başlayın ve ardından 1,5 mililitre 1,2 molar sükroz tamponunu alt katmanlamak için bir cam Pasteur pipeti kullanın. Santrifüjlemeyi takiben, P2 peletlerine 0,5 mililitre 0,32 molar sükroz tamponu ekleyin.

Ardından altı vuruş kullanarak yeniden homojenize edin. Homojenize fraksiyonları gradyanların üzerine yükleyin. Yüklü gradyanları sallanan bir kova rotoruna yerleştirin ve ardından bir ultrasantrifüjde iki saat boyunca 85.000 kez G'de döndürün.

Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, 1.0 molar sükroz tamponunun arayüzündeki malzeme de dahil olmak üzere üst 0.32 molar sükroz tabakasını atın. Sinaptozomları bir ila 1.2 molar sükroz tampon arayüzünde toplayın. Sinaptozomal fraksiyona 1.1 oranında 0.32 molar sükroz tamponu ekleyin.

Dikkatlice karıştırın ve bir saat boyunca 150.000 kez G'de döndürün. Sinaptozomlar peletin içindedir ve daha sonraki işlemler için bir tampon içinde yeniden süspanse edilebilir. Bir hayvanın her bir beyin bölgesinin sinaptozomlarını, ultrasonik bir banyoda bir saat boyunca buz üzerinde inkübe ederek 20 ila 50 mikrolitre 8 molar üre içinde çözün.

İki molar ürenin nihai konsantrasyonunu sağlamak için çıkarılabilir bir deterjanın yüzde biri ile seyreltin. SDS-PAGE kullanarak nispi protein miktarlarını belirledikten sonra, her numunenin geri kalanının üçte birini taze bir tüpe pipetleyin. İki milimolar DTT ve 25 milimolar amonyum bikarbonat ekleyerek çözelti içi sindirimi gerçekleştirin ve numuneyi nazikçe girdaplayın.

Numuneleri 20 santigrat derecede 45 dakika azaltın. Karbamidometilat sistein kalıntılarına 10 milimolar iota asedomid ekleyin ve karıştırın. Karanlıkta 20 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Son olarak, bir mikrolitre tripsin stok çözeltisi ekleyin ve 20 santigrat derecede 12 saat inkübe edin. Asitle bölünebilir deterjanı çıkarmak için, yüzde birlik nihai konsantrasyona trifloroasetik asit ekleyin ve 20 santigrat derecede bir saat daha inkübe edin. Numuneleri 10 dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüjledikten sonra, süpernatanları dikkatlice toplayın.

Katı faz ekstraksiyon kolonunu bir rafa yerleştirin ve matrisi iki mililitre metanol ile dengeleyin. Yıkadıktan sonra, iki mililitre daha Tampon B ekleyin ve numuneyi yükleyin. Tampon B ile üç kez yıkadıktan sonra, 200 mikrolitre yüzde 70 asetonitril ve yüzde 0.1 trifloroasetik asit ekleyerek peptitleri elüte edin.

Daha sonra saflaştırılmış numuneleri bir vakum santrifüjünde kurutun. Bu örnekte, FM ton ayırt etme görevi üzerinde eğitilen hayvanlar, eğitim seansları boyunca artan bir isabet oranı ve azalan bir yanlış alarm oranı göstermektedir. Dördüncü oturumdan itibaren önemli bir ayrımcılık meydana gelir.

Seçilen proteinlerin nispi sinaptik bollukları, FM ton ayırt etme görevi üzerine eğitilen fareler ile ilk eğitim seansından 24 saat sonra saf kontrol fareleri arasında karşılaştırılır. Eğitimden sonra, incelenen tüm bölgelerde CYFP2 proteininin seviyeleri değiştirilir. Hayvanların genellikle birey içi değişkenlikler sergilediğini unutmayın.

Bu nedenle, çalışmaya iyi eşleşen hayvan gruplarının en az beş veya daha fazla biyolojik kopyasının dahil edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Bir kez kurulduktan sonra, bu teknik diğer türlere kolayca uyarlanabilir. Örneğin, tek meyve sineği beyinlerinde öğrenmeye bağlı protein ekspresyon değişikliklerini izlemek için kullanılmıştır.