Saptamak için deneysel protokol Siyanobakteri Bir Antikor Mikroarray Chip ile Sıvı ve Katı Örneklerinde

Bu prosedürün genel amacı, bir floresan mikroarray immünolojik test kullanarak sıvı ve katı numunelerde çoklu siyanobakteri suşlarının varlığını belirlemektir. Bu yöntem, çiçekler çıplak gözle görülmeden önce protoksin üreten bakteriler tarafından üretilen toksinlerin varlığı gibi çevre, izleme ve su yönetimi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çoklu siyanobakteri suşunun ve çoklu numunelerin hem yerinde hem de laboratuvarda üç, dört saatlik bir süre içinde aynı anda izlenebilmesidir.

Dolayısıyla, bu yöntem biyolojik çeşitlilik hakkında fikir verebilir. Tarımsal tesislerin izlenmesi, gergin ortamlarda yaşam tespiti veya gezegen araştırmaları gibi diğer alanlara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler mücadele etmeyecektir.

Numune işlemedeki basitlik ve sonuçların yorumlanması daha kolay olduğu için. Metin protokolüne göre antikorlar üretildikten ve saflaştırıldıktan sonra, etiketleme için boya, bir miligram protein içeren ticari bir şişeye 100 mikrolitre DMSO ekleyin. Boya çözündükten sonra, her bir antikor preparatının 50 mikrolitresine iki mikrolitre boya ekleyerek saflaştırılmış antikorları etiketleyin.

Etiketleme reaksiyonlarını, titreşimli bir platform üzerinde sürekli çalkalama altında bir saat boyunca ortam sıcaklığında tutun. Etiketli antikorları metin protokolüne göre saflaştırdıktan sonra, bir spektrofotometreye küçük bir alikot yükleyin ve absorbansı 280 ve 650 nanometrede ölçün. Tedarikçi tavsiyelerine uyarak etiketleme verimliliklerini hesaplayın.

Bir CYANOCHIP yapmak için, mililitre antikor başına bir miligramı 1X protein baskı tamponunda Tween 20 hacmi başına% 01 hacimle karıştırarak her saflaştırılmış antikorun 30 mikrolitresini hazırlayın. Aşağıdaki yazdırma solüsyonlarından 30 mikrolitreyi kontrol olarak hazırlayın. Tween 20'nin hacmi başına %01 hacim ile 1X protein baskı tamponu.

Her protein: % 01 Tween 20 ve mililitre başına bir miligram BSA ve% 01 Tween 20 ile 1X protein baskı tamponunda mililitre başına bir miligram saflaştırılmış preimmün serum. Hazırlanan baskı solüsyonlarının her bir oyuğuna 30 mikrolitreyi yüksek kaliteli 384 kuyulu mikroplakalara ekleyin. Baskı robotunu ve slayt alt tabakalarını metin protokolüne göre ayarladıktan sonra, tüm antikorları ve kontrolleri slaytlar üzerine yaklaşık 180 ila 200 mikron spot çapında üçlü bir spot deseninde yerleştirin.

Ortamda numune almak için, bir ila 100 mililitre sıvı toplamak için steril bir şırınga kullanın ve numuneyi üç mikron gözenek boyutunda bir filtreden geçirerek hücreleri konsantre edin. Gerekirse, kayalardan veya topraklardan katı örnekler toplayın ve bunları steril tüplerde saklayın. Numuneler küçük bir saha laboratuvarında test edilebilir.

Filtrede toplanan biyokütleyi geri kazanmak için bir mililitre ekstraksiyon inkübasyon tamponu ekleyin ve filtreyi 15 mililitrelik bir tüpe kazımak için bir spatula kullanın. El tipi bir ultrasonik işlemci ile veya birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, bu numuneyi toplar ve homojenize eder. Ek olarak, 10 mililitrelik ayrı bir tüpte 0,5 grama kadar katı numuneyi tartın ve iki mililitreye kadar ekstraksiyon tamponu ekleyin.

Bir sonicator probunu tüpe daldırın ve elde taşınan bir ultrasonik işlemci veya başka bir ultrasonikasyon cihazı ile sonikasyon. Numuneyi buz üzerinde tutarken, 30 kilohertz'de en az beş 30 saniyelik döngü gerçekleştirin ve sonikasyonlar arasında 30 saniye durun. İmmünoassay için bir süzüntü ekstraktı hazırlamak için, çözeltiyi kum, kil ve diğer kaba malzemeleri çıkarmak için 1.5 mililitrelik bir tüpe filtrelemek için beş ila 20 mikron gözenek boyutunda naylon filtre tutucuya bağlı 10 mililitrelik bir şırınga kullanın.

Mikrodizi noktaları aşağı bakacak şekilde, slaytı 100 ila 200 mikrolitrelik bir engelleme çözeltisi damlası üzerine yerleştirin ve üç ila beş dakika inkübe edin. Plastik uçlu forseps kullanarak ve mikrodizi bölgelerinden kaçınarak slaytı dikkatlice alın. Slaytı yeni bir bloke etme solüsyonuna daldırın ve slaytı 30 dakika boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin.

Slaytı kurutmak için, mikroskop slaytları için uyarlanmış bir santrifüje koyun ve kısaca döndürün. Sağlayıcının talimatlarını izleyerek slaydı üçe sekiz kuyulu bir mikrodizi hibridizasyon kasetine yerleştirin. Alternatif olarak, antikor baskı modelini değiştirdikten sonra, burada gösterildiği gibi özel yapım bir kaset kurun veya kurulum için sadece kapak slaytları kullanın.

Slayt ve kaset montajını takiben, her bir numune ekstraktından 50 mikrolitreye kadar pipetleyin veya ekstraksiyon inkübasyon tamponunda kasetin her bir oyuğuna seyreltin. Alternatif olarak, numuneleri diğer inkübasyon cihazlarına yükleyin veya sadece kapak slaytları kullanın. Boş bir kontrol olarak, 50 mikrolitre TBSTRR tamponunu kasetin en az iki ayrı kuyucuğuna pipetleyin.

Numuneleri ortam sıcaklığında bir saat inkübe edin ve her 15 dakikada bir pipetleyerek karıştırın veya dört santigrat derecede 12 saat inkübe edin. Mikrodizileri yıkamak için kaseti yere yerleştirin ve temiz emici kağıda dikkatlice vurun. Daha sonra her birine 150 mikrolitre ekstraksiyon inkübasyon tamponu ekleyerek kuyuları yıkayın ve daha önce olduğu gibi emici kağıda vurarak tamponu çıkarın.

Yıkamayı üç kez daha tekrarlayın. Her oyuğa, 17 anti-siyanobakteriyel suş antikoru içeren 50 mikrolitre floresan antikor karışımı ekleyin. Numuneleri ortam sıcaklığında bir saat veya dört santigrat derecede 12 saat inkübe edin.

Mikrodizileri yıkamak için kaseti dikkatlice yere yerleştirin ve temiz emici kağıda hafifçe vurun. Ardından, bir kağıt havluya hafifçe vurarak çıkarmadan önce 150 mikrolitre ekstraksiyon inkübasyon tamponu ekleyin. Yıkamayı üç kez tekrarlayın.

Ardından kaseti sökün ve hızlı bir durulama için slaytı 0.1X PBS solüsyonuna daldırın. Slaytı kurutmak için daha önce olduğu gibi hızlı bir şekilde santrifüjleyin. Bir floresan tarayıcı kullanarak, uzak kırmızı floresan boya için maksimum emisyon zirvesinde floresan için slaydı tarayın.

Kazanç değerini değiştirerek farklı tarama parametrelerinde mikrodizilerin birkaç görüntüsünü alın. Son olarak, ızgarayı yükleyin, nicelleştirin, ardından verileri metin protokolüne göre işleyin ve analiz edin. Bu videoda gösterilen CYANOCHIP multipleks immünolojik test, bu tabloda listelendiği gibi en ilgili tatlı su siyanobakteri türlerinin eşzamanlı olarak tanımlanmasını test etmek için kullanıldı.

Bir tatlı su rezervuarının kıyısında toplanan su örnekleri, mikrodizi tahlili kullanılarak analiz edildi. Ana pozitif immün reaksiyonlar, planktonik siyanobakterilere, mikrosistlere, türlere ve bentik leptolyngbya türlerine karşı antikorlara karşılık geldi. Planktonik nostocales aphanizomenon türleri, anabaena türleri, microcystis flos-aquae ve bentik rivularia türleri için daha düşük floresan sinyaller elde edildi.

Mikrodizi ayrıca, siyanobakteriyel belirteçlerin varlığını test etmek için bir antarktika kuru mikrobiyal matın test edilmesiyle doğrulandı. Antikorlarda bentik siyanobakteriler, anabaena türleri ve leptolyngbya türlerine karşı pozitif reaksiyonlar üretildi. Microcystis türleri, aphanizomenon türleri ve planktothrix rubescens türleri gibi planktonik siyanobakterilere karşı antikorlarla ek pozitif immün reaksiyonlar tespit edildi.

Son olarak, bu sinyaller, tolypothrix türleri ve anabaena türleri de dahil olmak üzere diğer bentik türlere karşı antikorlardan elde edildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, antikor üretimi ve seviyelendirme hariç, uygun şekilde yapılırsa üç, dört saat içinde yapılabilir. Numunenin ve floresan antikorların eşzamanlı inkübasyonu ile bir saat tasarruf edilebilir.

Bu prosedürleri denerken, floresan antikor karışımını, antikoru ile birlikte optimum çalışma seyreltmesinde hazır bulundurmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürleri takiben, toprak konsantrasyonu gibi ek soruları yanıtlamak veya tespit edilen suş türünü doğrulamak için optik mikroskopi veya DNA ekstraksiyonu ve spesifik bir PCR amplifikasyonu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, çevresel izleme alanındaki araştırmacıların, numunenin türünden bağımsız olarak, bikültür süreçlerinde, tatlı su yönetiminde veya mikrobiyal ekoloji çalışmalarında su kütlelerini keşfetmelerinin önünü açacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, antikorların floresan ile nasıl etiketleneceğini, antikor mikrodizilerinin nasıl manipüle edileceğini, multipleks immünolojik test nasıl gerçekleştirileceğini ve mikroarray immünolojik test sonuçlarının nasıl analiz edileceğini ve yorumlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Ultrasonlarla çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürleri gerçekleştirirken kulak koruma cihazları takmak veya diğer özel bakım önlemleri gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.