Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Bu protokol ilk olarak Dr. Gary Bunker ve meslektaşları tarafından yayınlanmıştır; nöronların bir glial filtre tabakası üzerine askıya alınması yoluyla, embriyonik hipokampal nöronların düşük yoğunluklu ve yüksek saflıkta kültürlenmesine olanak tanırlar. Bu sonuç, nöronların çok az sayıda kontamine glial hücreyle düşük yoğunluklarda büyümesini sağladığı için diğer hipokampus kritik sonuçlarımızın temelindedir. Bu nedenle sonuç, kültürdeki olgun nöronların yüksek çözünürlüklü görüntülemesi ve fonksiyonel analizleri için idealdir.

Bu protokolün olgunlaşma sonrası aşaması, prosedür sırasında tanımlanması zor olan birkaç kilit durum bulunduğu için yeni başlayanların adaptasyonunu hızlandıracaktır; bu nedenle sizi adım adım yönlendirir. Bu protokol, yüksek kaliteli primer nöronların kültürü için gerekli olan üç bağımsız popülasyondan oluşmaktadır. Bu süreçler glial hücre kültürünü, lamellerin oluşturulmasını ve kaplanmasını ve hipokampal sinir hücrelerinin hazırlanmasını içerir.

Başlangıç olarak, yazılı protokolde açıklandığı şekilde erken postnatal sıçan kortikal dokusu elde edilmelidir. Burada doğrudan gösterilmese de, bu protokolün ilerleyen kısımlarında gösterilen diseksiyon basamaklarının, kortikal diseksiyon için kullanılanlarla neredeyse aynı olduğunu unutmayın. Bu nedenle, bu videonun devamında gösterilecek olan hipokampal diseksiyon prosedürü sırasında ilgili basamaklar vurgulanacaktır.

Yazılı protokolün altıncı adımından başlayarak, toplanan kortikal dokudaki HBSS'yi uzaklaştırın ve ardından dokuyu makas kullanarak mümkün olduğunca ince parçalara ayırın. Doğranmış dokuyu 50 mililitrelik konik tüpe aktarmak için yeterli miktarda HBSS ekleyin ve ardından HBSS ekleyerek toplam hacmi 12 mililitreye tamamlayın. Karışıma 1,5 mililitre %2,5 tripsin ve 10 miligram per mililitre DNA solüsyonu ekleyin, karıştırmak için tüpü ters yüz edin ve ardından elde edilen karışımı 37 derece Celsius sıcaklıktaki su banyosunda 12 dakika boyunca inkübe edin.

Dokuyu bir cam Pasteur pipeti kullanarak 10 ila 15 kez tritüre edin ve ardından su banyosunda üç dakika daha inkübe edin. Tüm doku parçalarının tüpün dibine çöktüğünden emin olun, ardından süpernatanı 5 mL BGS içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin. Sindirilmemiş doku parçalarının kaldığı tüpe 13,5 mililitre HBSS ve 1,5 mililitre 2,5% tripsin ekleyin, karıştırmak için ters çevirin ve ardından su banyosunda 10 dakika daha inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, geri kalan dokuyu 10 ila 15 kez tritüre edin, ardından ilk filtratı içeren tüpe filtreleyin. Sonrasında, üzerinden ek 3 mililitre BGS geçirerek filtreyi durulayın. Bu aşamada, hem dengelemeyi hem de pellet içindeki hücrelerin yeniden süspansiyonunu kolaylaştırmak için filtrat birden fazla tüpe bölünebilir.

Süspansiyonları 130 G'de altı dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, kan bileşenlerinin varlığı nedeniyle pelletin alt kısmının hafif kırmızımsı göründüğünü gözlemleyin. Süpernatantları uzaklaştırın, ardından pelletin dağılmamasına dikkat ederek her tüpe 1 mililitre glial medium ekleyin. Her pelletin bu kırmızımsı görünüme sahip olmayan kısımlarını taze bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.

Birleştirilmiş dokuyu yeniden süspande etmek için yavru başına 2 mililitreye kadar glial ortam ekleyin ve süspansiyonun her 2 mililitresini, 75 santimetrekarelik bir kültür flaskındaki önceden ısıtılmış 18 mililitrelik glial ortama aktarın. Flasku 37 °C, %5CO2'lik bir inkübatörde inkübe edin. Hücreleri ektikten bir gün sonra, her flasktaki ortamı taze glial ortam ile değiştirin.

Bu aşamada, kültürün astrositler ve diğer hedef dışı hücre tiplerinden oluşacak bir karışım olduğunu unutmayın. Astrosit olmayan hücre tiplerini uzaklaştırmak için, flasklar ekimden yaklaşık dört gün sonra kuvvetle çalkalanmalıdır. Bunun için flaskları HBSS ile durulayın, ardından her flaska 10 mL taze HBSS ekleyin ve her birini beş ila 10 kez güçlü bir şekilde çalkalayın.

HBSS'yi aspire edin ve iki kez daha HBSS ile durulayın. Ardından 20 mililitre glial besiyeri ekleyin ve flaskları daha önce olduğu gibi inkübatöre geri yerleştirin. Bu işlem kuvvetli olsa da, kültüre alınması istenen astrositlerin flask yüzeyine güçlü bir şekilde yapışık kalacağını unutmayın.

Astrosit kültürlerini sürdürmek için, hücreler konfluen olana kadar medyumu haftada iki kez taze glial medyum ile değiştirin. Hücreler konfluen olduğunda, yazılı protokolde açıklandığı gibi gelecekte kullanılmak üzere dondurulabilir. Glia hücreleri, yazılı protokolde belirtildiği üzere, nöron kültürü başlatılmadan en az 14 gün önce kaplara ekilmiş olmalıdır.

Lamel camlarını konsantre nitrik asit içine daldırın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sonikasyon uygulayın. Konsantre nitrik asit son derece aşındırıcı olduğundan dikkatli olun. Ayrıca, bazı laboratuvarların seramik boyama rafları kullanarak lamel camlarını gece boyunca nitrik asitte bekletmeyi tercih ettiğini unutmayın.

Nitrik asidi, kurumsal kılavuzlara uygun olarak kimyasal çeker ocakta dikkatlice bertaraf edin, ardından lamelleri deiyonize su ile üç kez durulayın. Lamelleri suyun içine batırın ve 30 dakika boyunca tekrar sonikasyona tabi tutun. Sonra, suyu uzaklaştırın ve lameleri üç kez daha durulayın.

Lamelleri 50 mililitre suyun içine daldırın ve ardından otoklavlayın. Steril bir laminer akışlı kabinde suyu uzaklaştırın ve durulamak için 20 ila 30 mililitre etanol ekleyin. 20 ila 30 mililitre daha etanol ekleyin, ardından lamelleri ve etanolü 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın.

Küt uçlu pensler kullanarak, renkli lamelleri her birine dört ila beş adet gelecek şekilde 60 mililitrelik Petri kaplarına aktarın, ardından lamelleri kabın kenarına yaslayarak hava ile kurumalarını sağlayın. Etanol buharlaştıktan sonra, lamelleri tekrar yatay konuma getirin. Isıya dayanıklı bir cam şişede 10 gram parafin eritin ve bunu yaklaşık 150 ila 200 derece Celsius sıcaklıkta tutun.

İdeal sıcaklığın ayarlanması biraz zaman alabilir ve yanlış sıcaklıklar, uygun boyutta parafin ayaklarının oluşturulmasında zorluklara yol açabilir. Bir Pasteur pipetini parafini daldırın, ardından hızla her bir lamelin kenarına yakın üç noktaya dokundurun. Parafin damlaları yaklaşık 3 ila 5 milimetre yükseklikte ve 1 ila 2 milimetre çapında boncuklar şeklinde katılaşacak ve lameldeki nöronlar ile altındaki glial-monotabaka arasında bir boşluk oluşturma işlevi görecektir.

Parafin ayaklı, önceden hazırlanmış lamel içeren kapları temin edin. Her lamelin yüzeyine 200 µL poli-l-lizin ve borat tamponu ekleyin ve çözeltinin lameller üzerinde, oda sıcaklığında, üzeri kapalı bir şekilde gece boyunca bekletilmesine izin verin. Kaplanacak yüzey, parafin boncuklarının bulunduğu yüzeyle aynı olmalıdır.

Uygun şekilde temizlendiyse, poli-l-lizin lam üzerine kolayca yayılıp yüzeyi kaplamalıdır. Ertesi sabah, lamları her seferinde iki saat boyunca steril suda bekleterek iki kez yıkayın. Son yıkamanın ardından, suyu her kap için 4 mililitre ekim besiyeri ile değiştirin.

Poly-l-lysine ile kaplandıktan sonra lamel yüzeyinin kurumasına izin verilmemesinin önemli olduğunu unutmayın. Lamel kaplarını 37 derece Celsius'lik bir inkübatöre yerleştirin. Kaplanmış lamel, nöron kültürü başlatılmadan önce en az 24 saat inkübe edilmelidir.

Embriyonik 18. veya 19. gününde olan gebe bir sıçan temin edin ve onaylanmış bir yöntemle ötanazi uygulayın. Sıçanın alt kısmına %70 etanol püskürtün, ardından pubik bölgeden abdominal kavitenin sonuna kadar orta hat boyunca bir insizyon yapın. Kontaminasyonu önlemek için, bu adımda yalnızca cildi kestiğinizden emin olun.

Diseksiyon aletlerini %70 etanol kullanarak sterilize edin, ardından uterusu açığa çıkarmak için karın duvarını kesin. İki uterus boynuzunu çıkarın ve steril bir kaba yerleştirin. Steril bir laminar akışlı kabinde, fetüsleri çevreleyen uterus membranlarını çıkarın, ardından fetüslerin başlarını kesin ve başları 20 mililitre HBSS içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.

Beyinleri diseke edin ve hemen buz üzerinde 2 mililitre HBSS içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Bir sonraki adım için yeterli alan sağlamak amacıyla her kaba yalnızca iki ila üç beyin koyun. Diseksiyon mikroskobu altında, serebral hemisferlerin orta hattından meningeleri sıyırarak çıkarın.

Ardından, hippokampusları diseke ederek çıkarın. Hippokampusun, kortikal hemisferin medial yüzeyinde hilal şeklinde bir yapı olarak ayırt edilebileceğini ve lateralde bir ventrikül ile sınırlandığı için kolayca çıkarılabileceğini unutmayın. Serbest kalan hippokampusları, 4.5 milliliters HBSS içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve buz üzerinde tutun.

Bu noktaya kadar izlenen adımların, kortekslerin hipokampüslerin aksine saklanması dışında, kortikal diseksiyon için de geçerli olduğunu unutmayın. Kortikal diseksiyonda bir sonraki adım, burada gösterildiği gibi korteksi beynin geri kalanından ayırmak ve ardından daha önce gösterildiği gibi korteksleri ve HBSS'yi toplamaktır. Tüm hipokampüs dokusu HBSS içinde toplandıktan sonra, dokuyu 15 milliliter'lik konik bir tüpe aktarın.

5 mililitre %2,5 tripsin ekleyin ve ardından 37 derece Celsius'ta 10 dakika inkübe edin. Tüpün dibindeki hipokampal dokuyu rahatsız etmeden, tripsin solüsyonunu bir Pasteur pipetiyle nazikçe uzaklaştırın. Dokuyu, 5 mililitre HBSS'yi nazikçe ekleyip 37 derece Celsius'ta beş dakika inkübe ederek ve ardından dipteki dokuyu rahatsız etmediğinizden emin olarak Pasteur pipetiyle tekrar uzaklaştırarak iki kez yıkayın.

Önceki adımda gösterilen inkübasyon süresini beklerken, doku disosyasyonu için alevle cilalanmış pipetlerin iki varyantını hazırlayın. Bunun için, cam Pasteur pipetinin ucunu kısa bir süre alevle temas ettirin ve ardından pipet ucunu inceleyin. İlk varyant için, pipet ucunun kenarları düzene girene kadar ancak çapı değişmeden kalacak şekilde bu adımı tekrarlayın.

İkincisi için, kenarlar pürüzsüzleşene ve uç çapı yaklaşık yarıya inene kadar işlemi tekrarlayın. Süreç sırasında hücrelere zarar vermeden, dokunun tekil hücreler verecek şekilde disosiye olmasını sağlamak için ideal çapı bulmak amacıyla pratik yapmak önemlidir. İkinci yıkamadan sonra, dokuya yeterli miktarda HBSS ekleyerek toplam hacmi 5 mililitreye tamamlayın.

Hipokampal dokuyu önce düz kenarlı normal pipetle yaklaşık 10 geçiş yaparak, ardından uç çapı daha dar olan pipetle beş ila 10 geçiş daha yaparak tritüre edin. Buradaki amaç, hiç doku topağı bulunmayan veya çok az bulunan homojen bir hücre çözeltisi elde etmektir. Hücre yoğunluğunu bir hemositometre kullanarak belirleyin.

Tipik verimler, pup başına yaklaşık 800.000 ile bir milyon hücre arasındadır. Hedeflenen deneye bağlı olarak, 60 milimetrelik kap başına 100.000 ile 500.000 arasında bir ekim yoğunluğu elde etmek için, hücre süspansiyonunun yeterli hacmini 4 mililitre ekim ortamı içeren ve poly-l-lysine kaplı lamel bulunan kaplara aktarın. Kapları 37 °C %5CO2 inkübatöre yerleştirin.

Üç ila dört saat sonra, üzerinde nöronların bulunduğu lamel örtülerini, glial hücreler ve NBG besiyeri içeren kaplara aktarın. Bu işlem, nöronların ekildiği taraf glial hücre tabakasına bakacak şekilde aşağıya dönük olarak yapılmalıdır. Her glia kabına toplam dört veya beş lamel örtüsü ekleyin.

Ekimden iki veya üç gün sonra, glial hücre büyümesini durdurmak için her kap başına beş mikromolar nihai konsantrasyonda aerocele çözeltisi ekleyin. Hücreleri, her beslemede 2 mililitre eski ortamı 2,5 mililitre taze ortamla değiştirerek haftada bir kez besleyin. Eklenen fazla ortam, zamanla meydana gelen buharlaşmayı telafi etmek içindir.

Glial hücrelerin besiyerini tutarlı bir şekilde koşullandırmasını sağlamak için besiyerinin yalnızca bir kısmı değiştirilir. Bu kültürler genellikle en az bir ay boyunca sağlıklı kalır. Nöronlar %4 paraformaldehit ile fikse edilmiş, ardından floresan görüntüleme için primer antikorlarda inkübe edilmiştir.

Tau ve MAP2 immün boyamalarında görüldüğü üzere, bu nöronlar iyi gelişmiş aksonlar ve dendritlerle birlikte kapsamlı bir arborizasyon geliştirirler. Olgun nöronlar ayrıca, Drebrin One'ın seçici lokalizasyonu ile tanımlanan ve synapse in one immün boyaması ile tanımlanan pre-sinaptik özelleşmelere yakın konumlanan sinaptik dikenler geliştirirler. Bu primer nöronlar; sinyal iletimi, nöronal polarite, subselüler trafik ile sinaps gelişimi ve plastisitesi gibi çalışmalar da dahil olmak üzere, nöronların ve sinapsların fonksiyonel ve yapısal çalışmaları için oldukça uygundur.

Bu video, bu protokole ait birkaç temel adımın anlaşılmasına ve doğru şekilde uygulanmasına yardımcı olacaktır. Tanımlanan yönteme uygun şekilde riayet edilmesi; kapsamlı arborizasyona sahip, morfolojik ve fonksiyonel olarak iyi gelişmiş sinapsları olan sağlıklı, yüksek yoğunluklu nöron kültürleri ile sonuçlanmalıdır.