Lazer Diseksiyon RNA Sek için Deneysel Tasarım: Mısır Yaprak Kalkınma bir Analiz Dersler
5 Mart 2017
Gelişimsel olarak önemli birçok genin hücre veya dokuya özgü ekspresyon paternleri vardır. Bu makale, mısır yaprağı bıçak-kılıf sınırında ve lg1-R mutantlarında vahşi tipe kıyasla farklı şekilde ifade edilen genleri tanımlamak için LM RNA-seq deneylerini açıklamaktadır. Burada tartışılan deneysel düşünceler, diğer gelişimsel fenomenlerin transkriptomik analizleri için geçerlidir.
Bu yöntemin genel amacı, mutant ve vahşi tip örneklerde farklı alanlar arasında veya eşdeğer alanlar arasında karşılaştırmalar yapılabilmesi için belirli hücrelerde veya hücresel alanlarda transkript birikimini ölçmektir. Bu yöntem, organ alanlarının nasıl belirlendiği veya spesifik mutasyonların gen ekspresyonunu nasıl etkilediği gibi gelişimsel biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, transkript birikiminin, elle incelenemeyecek kadar küçük, kesin olarak tanımlanmış alanlarla ölçülebilmesidir.
Bu prosedüre başlamadan önce, standart koşullar altında iki haftalık mısır fideleri düzlükleri büyütün. Yan bölümler için sürgün apislerini incelemek için, önce toprak çizgisinin hemen altında bir fide çıkarın. Ardından, bir veya iki olgun yaprakla çevrili bir oval sakin görünene kadar sapın tabanından ince dilimleri çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın.
Tabanın yaklaşık 10 milimetre üzerinde başka bir kesim yapın. Bu 10 milimetrelik segment, genç yaprak primordia'daki sürgün apikal meristemini içerir. 10 milimetrelik segmenti, taban yukarı bakacak şekilde çevirin.
İki ila üç milimetre kalınlığında bir doku kayması elde etmek için yanal eksene paralel iki kesim yapın. Dıştaki iki kısmı atın ve sabitleme ve gömme için merkezi dilimi saklayın. Doku dilimini yaklaşık 10 mililitre çiftçiye batırın, buz üzerinde bir cam şişeye sabitleyin.
Tüm numuneler incelendikten sonra, hava kabarcıklarını çıkarmak ve fiksatifin nüfuz etmesine yardımcı olmak için vakum uygulayın. Vakumu 10 dakika basılı tutun ve ardından vakumu yavaşça serbest bırakın. Sabitleyiciyi değiştirin ve hafifçe çalkalayarak gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, metin protokolünde açıklandığı gibi dokuları gömmek için işlemeye devam edin. Parafin bloklarını dökmek için, gömme kalıplarını doku gömme istasyonunun sıcak bir plakasına yerleştirin ve doku örneklerini, kesilen yüzey aşağı bakacak şekilde gömme kalıplarına aktarmak için forseps kullanın. Gömme halkasını kalıbın üstüne yerleştirin.
Her kalıbı eritilmiş parafin ile doldurun. Parafin katılaşana kadar kalıpları soğuk bir tabağa aktarın. Parafin bloklarını dört santigrat derecede silika jel içeren hava geçirmez bir kapta saklayın.
Kesitler, standart prosedürler izlenerek bir mikrotom üzerindeki parafin bloklarından kesilir ve montaj için sürgün apikal meristemi içeren medyan bölümler seçilir. Bölümleri slaytlara monte etmek için, RNaz içermeyen veya 42 santigrat derecelik bir slayt ısıtıcısı üzerine fırınlanmış slaytları yerleştirin. Her slaydı kaplamak için birkaç damla% 50 etanol çözeltisi uygulayın.
Bölümleri yavaşça slayt üzerine yerleştirin ve bölümleri genişleyene kadar etanol çözeltisi üzerinde yüzdürün. Ardından, slaytı eğin ve tek kullanımlık bir transfer pipeti ile aspirasyon yaparak fazla etanol çözeltisini çıkarın. Ek etanol çözeltisini uzaklaştırmak için tüy bırakmayan mendiller kullanın.
Slaytları birkaç saat veya gece boyunca 42 santigrat derecede kurutun. Slaytlar kuruduğunda, dört santigrat derecede silika jel içeren hava geçirmez bir kapta saklayın. Mikrodiseksiyon gününde slaytları deparafinize edin.
Üç cam Coplin kavanozu, yaklaşık 50 mililitre %100 ksilen içeren iki kavanoz ve yaklaşık 50 mililitre %100 etanol içeren bir kavanoz hazırlayın. Slaytları bir iki dakika ksilenlere, iki iki dakika ksilenlere ve bir dakika boyunca %100 etanole batırın. Slaytları tüy bırakmayan mendillerin üzerine boşaltın ve oda sıcaklığında havayla kurutun.
Bu işleme başlamak için, slaytları lazer mikrodiseksiyon mikroskobunun sahnesinde sabitleyin. RNasic deneylerinde lazer mikrodiseksiyonun başarısında kritik bir faktör, mikrodiseksiyon için kesin alanları seçmek için morfolojik ve moleküler belirteçlerin kullanılmasıdır. 5X'lik bir objektif kullanarak slaytları inceleyin ve merkezi referans noktası olarak çekim apikal meristem tepesini kullanarak her slayttaki en medyan beş bölümü belirleyin.
Ardından, her bölümün plastochron yedi yapraklı primordium üzerindeki ligule konumunu belirlemek için 10X veya 20X'lik bir hedef kullanın. Ligule, yaprak primordiumunun adaksiyal yüzeyinden çıkıntı yapan bir yumru olarak görünür olacaktır. Bu konumu işaretlemek için lazer mikrodiseksiyon yazılımının çizim aracını kullanın.
Serbest çizim simgesini seçin, imleci uygun konuma getirin ve çizmek için fareyi tıklayıp sürükleyin. Bir sonraki adım, ligule örnekleri olarak her bölümün bir ligule üzerinde ortalanmış 100 mikrometre yüksekliğindeki dikdörtgenleri ölçmek için cetveli ve dikdörtgen çizim aracını kullanmaktır. Cetvel aracını kullanmak için cetvel simgesini seçin, imleci ölçülecek bölgenin bir ucuna getirin ve ardından bölgeyi ölçmek için tıklayıp sürükleyin.
Cetvelin uzunluğu ekranda gösterilecektir. Bir ligul merkezli 100 mikrometrelik bir segmenti ölçmek için cetvel aracını kullanın. Bir dikdörtgen çizmek için düz çizgi çizim aracını seçin ve dört düz çizgi çizin.
Aynı şekilde, ligule dikdörtgeninin 50 mikrometre yukarısına ve altına yerleştirilmiş 100 mikrometre dikdörtgenleri ölçün. Bunlar bıçak ve kılıf örnekleri olacaktır. Seçilen alanın ana hatları boyunca doku bölümünü kesmek için lazer kesim işlevini ve dokunun dikdörtgenini slayttan tüpün kapağına itmek için mancınık işlevini kullanarak ölçülen dikdörtgenleri mikrodiseksiyon yapın.
Ligul, bıçak ve kılıf örneklerini ayrı tüplerde toplayın. Plastochron yedi yapraklı primordia'dan bıçak, ligule ve kılıf adaksiyal epidermal örnekleri mikrodiseksiyon yapmak için aynı prosedürü kullanın. Son olarak, mikrodiseke edilmiş dokuya RNA ekstraksiyon tamponu uygulayın ve el yazmasında anlatıldığı gibi RNA ekstraksiyonu, RNA amplifikasyonu, kütüphane yapımı, dizileme ve biyoinformatik analiz ile devam edin.
Transkript birikimi analiz edildiğinde ve bıçak, ligül ve kılıf bölgelerinin tüm hücre katmanları incelendiğinde, 2.359 diferansiyel olarak eksprese edilen gen bulundu. Abaksiyal epidermal bıçak, ligül ve kılıf bölgelerinde 3.128 diferansiyel olarak eksprese edilen gen bulundu. Lazer mikrodiseksiyon, RLM, RNA dizileme ve in situ hibridizasyon analizleri, bu temsili genlerin gösterdiği gibi tutarlı sonuçlar verdi.
Soldaki karikatürler tüm hücre katmanlarının LM'sini göstermektedir ve sağdaki karikatürler sadece adaksiyal epidermisin LM'sini göstermektedir. Görüntülerdeki ok uçları ortaya çıkan ligülleri göstermektedir. Ligüller bir transkript birikimi hem tüm hücre katmanlarında hem de epidermal LM'de ligulde önemli ölçüde daha yüksekti.Dar kılıf bir, hem tüm hücre katmanları LM'de hem de adaksiyal epidermis LM'de ligule bölgesinde önemli ölçüde yukarı regüle edildi ve spesifik olarak ortaya çıkan ligülün ucunda birikti.
Fonksiyonu bilinmeyen bir gen, ligule epidermal LM'de tüm katmanlar LM'den daha yüksek bir ortalama yeniden sayıma sahipti.Bu transkript en çok epidermal hücrelerde birikir. Dördüncü gen olan Zm PIN1a, tüm hücre katmanlarının analizinde önemli ölçüde diferansiyel olarak eksprese edilmedi, ancak sadece epidermis analizinde ligulde önemli ölçüde yukarı regüle edildi. Vasküler dokudaki yüksek ekspresyonu, tüm hücre katmanları toplandığında epidermiste transkript birikiminde kafa karıştırıcı farklılıklara neden olabilir.
Bu prosedürü denerken, mikrodiseksiyon ve karşılaştırma için hücresel alanların seçiminin ve mikrodiseksiyonların doğruluğunun deneylerin başarısı için çok önemli olduğunu hatırlamak önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, mısırda belirli hücresel alanlarda transkript birikimi miktarını belirlemeye odaklanmaktadır. Yaprak bıçağı-kını sınırında ve lg1-R mutantlarında yabani tiplere kıyasla gen ekspresyon farklılıklarının anlaşılmasının önemini vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gelişimsel Biyoloji
- Gen Ekspresyonu
- Transkriptomik
Arka Plan
- Gelişimsel olarak önemli genler, hücre veya dokuya özgü ekspresyon desenleri sergiler.
- Bu desenleri anlamak, organ alan belirlenmesi hakkında bilgiler sağlamak için kritiktir.
- Mutasyonlar, gen ekspresyonunu önemli ölçüde etkileyebilir ve gelişim süreçlerini engelleyebilir.
- Transkript birikimi, küçük, tanımlanmış alanlarda ölçülebilir.
Çalışmanın Amacı
- Mısır yaprak bıçağı-kını sınırında farklı olarak ifade edilen genleri belirlemek.
- Lg1-R mutantlarında gen ekspresyonunu yabani tip örneklerle karşılaştırmak.
- Gelişimsel biyolojide transkriptomik verileri analiz etmek için bir yöntem sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Gen ekspresyonunu analiz etmek için LM RNA-seq deneyleri.
- Yanal kesitler için mısır fidelerinin kök uçlarının ayrıştırılması.
- Deney öncesi mısır fideleri için standart büyüme koşulları.
- Belirli hücresel alanlarda transkript birikimi miktarının ölçülmesi.
Ana Sonuçlar
- Yaprak bıçağı-kını sınırında farklı ekspresyon desenleri olan genlerin tanımlanması.
- Lg1-R mutantlarında gen ekspresyonunun yabani tip örneklerle karşılaştırılması.
- Yöntemin küçük hücresel alanları analiz etmede etkinliğinin gösterilmesi.
- Belirli mutasyonların gelişim sırasında gen ekspresyonunu nasıl etkilediği hakkında bilgiler.
Sonuçlar
- Çalışma, gelişimsel biyolojide transkriptomik analiz için değerli bir yöntem sunmaktadır.
- Gen ekspresyon desenlerini anlamak, organ gelişimi ve mutasyon etkileri hakkında bilgi sağlayabilir.
- Bu yaklaşım, mısırın ötesinde diğer gelişimsel fenomenlere de uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Laser Microdissection RNA-Seq enables precise quantification of transcript accumulation in narrowly defined plant tissue domains, addressing the challenge of spatially restricted gene expression that is often masked in whole-organ analyses. This approach enhances predictive confidence in target validation by isolating the biological context of gene regulation, supporting risk-adjusted decisions in early discovery and functional genomics pipelines. Accurate domain selection and microdissection fidelity are critical for generating reproducible, actionable transcriptomic data that inform portfolio triage and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function in specific developmental domains, clarifying pathway roles.
- Supports biological de-risking by isolating the effects of mutations or perturbations on gene expression.
- Improves predictive confidence for target selection by revealing spatially restricted differential expression.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing context-dependent gene activity.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue domains for downstream transcriptomic workflows.
- Standardizes sample selection using morphological and molecular landmarks for reproducibility.
- Generates quantitative gene expression outputs suitable for comparative analysis.
- Enables reliable evaluation of candidate genes or pathways in defined biological contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcriptomic findings with disease-relevant or developmental biomarkers when applicable.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling precise domain-specific analyses.
- Provides mechanistic de-risking by clarifying the spatial context of gene regulation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification, supporting both target validation and mechanistic studies in plant and potentially other model systems.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by quantifying transcripts in defined domains.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression data for assay development and screening readiness.
- Analytics: Provides differential expression measurements that enable robust comparison across conditions or genotypes.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when spatial gene expression is relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for spatial transcriptomics across diverse developmental or disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of transcriptomic analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying biological context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of targets based on spatial gene expression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, microdissection, and transcriptomic analysis.
- Demands access to laser microdissection instrumentation and RNA-seq infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample selection and domain definition.
- May require adaptation for different tissue types or developmental stages.
- Precision in domain selection and microdissection is critical for data quality and interpretability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Tissue Fixation and Processing
3:03
Sectioning and Slide Preparation
4:57
Microdissection of Blade, Ligule, and Sheath Samples from Plastochron 7 Leaf Primordia
7:48
Results: Laser Microdissection RNA Sequencing Identifies Differentially Expressed Genes in Maize Leaf
9:38
Conclusion
