Name: Lazer Diseksiyon RNA Sek için Deneysel Tasarım: Mısır Yaprak Kalkınma bir Analiz Dersler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Öğrenin, lazer mikrodiseksiyon RNA dizileme yöntemiyle mısır yaprak bıçak-kın sınırında transkript birikimini nicelendirmeyi. Bu teknik, gelişimsel biyolojide gen ifadesi farklılıklarını analiz etmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar işbirliği, devam eden ve ligule gelişimi ile ilgili tartışmalar uyarıcı S. Hake teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB 1052051 ve IOS-1848478 tarafından desteklenmektedir.

NOT: Doku LM için sabit olduğunu, aynı zamanda histolojik analiz için doku sabitleyin. Daha sonra LM rehberlik edecek morfolojik özellikler için lekeli bölümleri inceleyin. Vahşi tip mutant karşılaştırıldığında, (bu durumda LG1) ilgili gen ifade alan tanımlamak için bir yerinde hibridizasyon veya bağışık gerçekleştirmek. 1. Doku Sabitleme ve İşleme <ol><li> Standart koşullar 6 altında eski iki hafta mısır fidelerinin daire büyür. </li><li> Yanal bölümler (Şekil 4) için ateş apices teşrih. <ol><li> sadece toprak sınırının altında Tüketim fide. </li><li> Bir jilet kullanarak, bir ya da iki olgun yapraklar çevrelediği culm oval görünür (Şekil 4B) kadar kök (kesikler 1, Şekil 4A) tabanından ince dilim çıkarın. </li><li> Başka bir kesim tabanı üzerinde yaklaşık 10 mm (Şekil 4A 2 kesme) olun.Bu 10 mm segmenti SAM ve genç yaprak primordiasında içerecektir. </li><li> Baz yukarı bakacak şekilde 10 mm segmenti çevirin. Kalın bir doku 2-3 mm&#39;lik bir kesit elde edilir, böylece iki kesim yanal eksene paralel hale (kesikler 3 ve 4, Şekil 4B). Dış iki porsiyon atın ve sabitleme ve benimsenmesi için merkezi dilim saklayın. NOT: Dış yaprakları kesilmiş ve atılabilir. </li></ol></li><li> gömmek için doku ve süreci sabitleyin. <ol><li> RNaz ücretsiz olan tüm malzemelerin daha sonraki kademelerde kullanım için emin olun. (. Çözeltinin litresi başına 1 mi DEPC, arada bir sallanarak ve otoklav ile bir gece boyunca inkübe) dietil pirokarbonat (DEPC) ile çözümleri tedavi edin. Fırında 200 ° C de bir fırında cam veya en az 6 saat boyunca daha yüksek ve RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile plastik eşya tedavi. </li><li> Gün 1: buz üzerinde bir cam şişe içinde (asetik asit: 1 Etanol 3) ~ çiftçi düzeltmenin 10 ml doku dilimleri bırakın. Tüm numuneler kesilerek sonra, Vacuu geçerlidirm hava kabarcıkları ve fiksatif yardım penetrasyonunu kaldırmak için. 10 dk sonra yavaşça vakumu boşaltmak için vakum altında tutun. Fiksatif değiştirin ve hafifçe çalkalanarak bir gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 2. Gün:, çözeltiler, aşağıdaki seri inkübe ~ her biri 10 mL, 1 saat, her biri hafifçe çalkalanarak Tüm; 4 ° C, 4 ° C, 4 ° C, 4 ° C, 4 ° C &#39;de% 100 etanol% 100 etanol% 100 etanol% 95 etanol, 1 ile% 85 etanol: 1 etanol: Oda sıcaklığında ksilenler, Oda sıcaklığında% 100 ksilenler, oda sıcaklığında% 100 ksilenler. NOT: ksilen temas ve solunum yoluyla zehirlidir. Davlumbaz çalışmak ve uygun eldiven kullanın. </li><li> ksilen, yaklaşık yarım hacme orta peletler gömme parafın doku eklenir ve yavaşça çalkalanarak, oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edilir. </li><li> 3. Gün: peletler eriyene kadar 60 ° C fırında, şişe aktarın. çözüm dökün ve taze erimiş doku gömme ortamı ile değiştirin. Orta iki kez daha değiştirmegün boyunca. </li><li> 4. Gün: Sabah bir kez gömme orta Değişim doku. Öğleden sonraya kadar 60 ° C fırında dönün. </li></ol></li><li> Oyuncular blokları <ol><li> Doku gömme istasyonunun sıcak plaka üzerinde gömme kalıpları yerleştirin. kesim yüzeyi aşağı bakacak şekilde gömme kalıplara doku örnekleri aktarmak için forseps kullanabilir. Erimiş parafin ile kalıp kontör ve kalıp üstüne gömme halkasını yerleştirin. parafin katılaşmış kadar soğuk plaka aktarın. silika jel ile hava geçirmez bir kap içinde, 4 ° C&#39;de, parafin blokları saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Kesit ve Hazırlama Slayt <ol><li> Bir mikrotom 25 10 mikron bölümleri kesin. </li><li> şeritler incelemek ve medyan bölümleri seçin. Medyan bölümler yaprak primordia çevrili hücrelerin bir kubbe olarak görünür SAM dahil olanlardır. </li><li> slaytlar Mount bölümleri. <ol><li> LM için uygun yer slaytlar (ya RNaz ücretsiz ya dapişmiş) 42 ° üzerinde sıcak slayt ve slayt kapsayacak şekilde% 50 etanol çözeltisi birkaç damla uygulamak C. </li><li> bölümler genişlettik kadar etanol çözeltisi ile ilgili bölümleri yüzer. NOT: etanol çözeltisi yerine su bölümleri Yüzer RNA bozulmasını azaltan bir çöktürülmüş halde RNA tutar. </li><li> slayt eğin ve tek kullanımlık transfer pipet yardımıyla aspirasyon ile aşırı etanol çözüm kaldırmak. herhangi bir ek etanol solüsyonu uzak fitil havsız mendil kullanın. </li><li> 42 ° C&#39;de kuru slaytlar birkaç saat veya bir gece. Mağaza silika jel ile hava geçirmez bir kap içinde, 4 ° C &#39;de kayar. </li></ol></li><li> Deparaffinize kullanım gününde kayar. <ol><li> içeren üç cam Coplin kavanoz hazırlayın; % 100 ksilenler (ksilenler I) &#39;in,% 100 ksilenler (ksilenler II) ve% 100 etanol (~ Her çözeltinin 50 mi). </li><li> temiz forseps kullanarak 2 dakika ve 1 dakika süreyle% 100 etanol için, slaytlar aktarmak Ben 2 dakika süreyle ksilol slaytları batırmayın, ksilen II. </li><li> Tahliye kaydırdıOda sıcaklığında havsız mendil ve kuru hava ile ilgili es. </li></ol></li></ol> Plastochron 7 Yaprak Primordia Blade, ligule ve Kılıf Örneklerinin 3. Mikrodisseksiyon <ol><li> LM mikroskop sahnede slaytlar sabitleyin. slayt başına beş bölümden kullanan her tekrar için beş ya da altı slaytlar kullanın. NOT: Tek deney için havuzu doku Şekil 5&#39;de görüntülenmiştir. </li><li> slaytlar incelemek ve merkezi referans noktası olarak SAM apeks kullanarak, her slaytta beş en medyan bölümleri belirlemek. Not: Bu, düşük büyütme yapılabilir genellikle 5X amacı yeterlidir. </li><li> 10X veya 20X objektif kullanılarak, her bir bölümün plastochron 7 yaprak primordiumunun üzerinde ligule konumunu belirlemek. ligule yaprak primordiumunun adaxial yüzeyinden çıkıntı bir yumru olarak görünür olacaktır. LM yazılım çizim aracını kullanarak bu konumu işaretleyin; Kalem simgesini seçin, uygun positi imlecive üzerine tıklayın ve çizmek için fareyi sürükleyin. NOT: 10X veya 20X amacı, bu ve sonraki adımlar için uygun değildir. Yanal bölümleri kullanırken, her yaprak primordiumunun iki tarafın her bölüm (Şekil 2A) mevcut olacaktır. </li><li> Cetvel aracı ve dikdörtgen çizim aracını kullanarak, 100 mikron her bölümün ligule merkezli yüksek dikdörtgenler (kırmızı dikdörtgenler, Şekil 2A, 2B) ölçün. Bu &quot;ligule&quot; örnek olacaktır. <ol><li> cetvel aracını kullanmak için; , Cetvel simgesini seçin ölçülecek nesnenin bir ucuna imleci, nesneyi ölçmek için tıklayın ve sürükleyin. Cetvelin uzunluğu ekranda gösterilir. </li><li> Bir dikdörtgen çizmek için; , Dikdörtgen simgesini seçin, dikdörtgenin bir köşesi olacak tıklayın ve uygun büyüklükte bir dikdörtgen çizmek için sürükleyin bir noktaya imleci. Alternatif olarak, düz bir çizgi çizim aracını seçin ve dört düz çizgiler çizmek. </li><li> tedbir 100 mikron dikdörtgenler 50 mikron &quot;ligule&quot; dikdörtgen üstünde ve altında konumlandırılmış. NOT: Bu &quot;Blade&quot; ve &quot;Kılıf&quot; örnekleri, sırasıyla (yeşil ve mavi dikdörtgenler, Şekil 2A, 2B) olacaktır. Bizim histolojik verilere dayanarak, 100 mikron dikdörtgen tüm ligule bölgesini kapsar. bıçak ve kılıfın eşdeğer porsiyon büyüklüğünde doku içindeki miktarları her biri için elde edilmiştir sağlamak için seçilmiştir. 50 um&#39;lik Spacer&#39;ler ligule bölgesi doku yanlışlıkla uç veya kılıf microdissections dahil olmasını sağlamak için kullanılmıştır. </li></ol></li><li> Ayrı tüplerde ligule, Blade ve Kılıf örneklerin toplanması 7, 8, 9, - Microdissect ölçülen dikdörtgenler (2F Şekil 2B). Seçilen etki anahat boyunca doku bölümünde kesmek için lazer kesim işlevini kullanın. Cata kullanınpult işlevi slayt kapalı ve tüp (- 2F Şekil 2B) kapağının içine doku dikdörtgen itmek için. </li></ol> Plastochron 7 Yaprak Primordia Blade, ligule ve Kılıf adaxial Epidermal Örneklerinin 4. Mikrodisseksiyon <ol><li> bölümleri seçin ve bölüm 3 (yukarıda) de tarif edildiği gibi, plastochron 7 ligule merkezli 100 mikron yüksek kesimleri ölçmek için cetvel aracını kullanın. <ol><li> Çizim aracı ile özetleyen her 100 mikron yüksek &quot;Blade&quot; ve &quot;Kılıf&quot; segmenti (yeşil ve mavi seçimleri, Şekil 2C) sadece adaxial epidermal hücreleri seçin. Epidermis, dış hücre tabakasıdır; aks tarafı SAM yakın biridir. </li><li> Bölüm 3.3 (kırmızı seçimi, Şekil 2C) de tarif edildiği gibi &quot;ligule&quot; örneği için, gelişmekte olan ligule yumru sadece hücreleri seçin. </li></ol></li><li> Bıçak, ligule ve Shea toplama Microdissect seçilen bölgeler,bölüm 3.5 anlatıldığı gibi inci, ayrı tüplerde örnekleri epidermis. </li></ol> LG1-R ve vahşi tip kardeşlerinden Plastochron 6 Yaprak Primordia 5. mikrodiseksiyonu <ol><li> Mutant (LG1-R) ve vahşi tipli bitkiler ailelerini segregasyon büyütün. </li><li> bölümlerde 1.2-1.4 açıklandığı gibi, LM için apices saptamak ve süreç ateş. Ayrı onları tutmak için vahşi tip ve ayrı şişelerde mutant ateş apices sabitleyin. Aynı dikim numuneler sabit ve in situ melezleme için işleme tabi tutulmalıdır. </li><li> LG1 in situ hibridizasyon 6, 26, 27 LG1 gerçekleştirerek, vahşi tipli kardeşlerinden transkribe burada belirler. Birden çok numune (Şekil 1 E) yaprak primordiumunun tabanından LG1 transkript birikimi konumunu ölçün. </li><li> Doğal olarak melezleşme verileri göre, yaprak primo kısmını tercihrdium bu LG1 transkribe bölgeyi kapsar. Bu durumda, plastochron 6 yaprak primordia (mor dikdörtgenler, Şekil 2A) tabanında 400-900 um. </li><li> Bölüm 3.5 de tarif edildiği gibi, ayrı Microdissect tüplerde LG1-R ve vahşi tip numune toplama, yaprak primordia kısmı seçildi. </li></ol> 6. RNA Ekstraksiyon Buffer uygula <ol><li> microdissected dokuya 50 ul RNA ekstraksiyon tamponu uygulayın ve RNA ekstraksiyonu devam edin. Referans 6&#39;da açıklandığı gibi RNA ekstraksiyonu, RNA amplifikasyonu, kütüphane oluşturma, sekanslama ve biyoinformatik analizi ile devam edin. </li></ol>

<ol><li>Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liguleless-1+gene+acts+tissue+specifically+in+maize+leaf+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development.</a> Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).</li>
<li>Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+and+differentiation+during+normal+and+liguleless-1+maize+leaf+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development.</a> Development. 110 (3), 985-1000 (1990).</li>
<li>Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((liguleless1+encodes+a+nuclear-localized+protein+required+for+induction+of+ligules+and+auricles+during+maize+leaf+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis.</a> Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).</li>
<li>Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).</li>
<li>Moon, J., Candela, H., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Liguleless+narrow+mutation+affects+proximal-distal+signaling+and+leaf+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth.</a> Development. 140 (2), 405-412 (2013).</li>
<li>Johnston, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+Analyses+Indicate+That+Maize+Ligule+Development+Recapitulates+Gene+Expression+Patterns+That+Occur+during+Lateral+Organ+Initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation.</a> Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).</li>
<li>Schmid, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes%3A+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLoS One. 7 (1), e29685(2012).</li>
<li>Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+cells+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of cells from plant tissues.</a> Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).</li>
<li>Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%2C+a+tool+for+the+global+analysis+of+gene+expression+in+specific+plant+cell+types%3A+identification+of+genes+expressed+differentially+in+epidermal+cells+or+vascular+tissues+of+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize.</a> Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Brooks, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+shoot+meristem+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Microdissection of shoot meristem functional domains.</a> PLoS Genet. 5 (5), e1000476(2009).</li>
<li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stamen+abscission+zone+transcriptome+profiling+reveals+new+candidates+for+abscission+control%3A+enhanced+retention+of+floral+organs+in+transgenic+plants+overexpressing+Arabidopsis+ZINC+FINGER+PROTEIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li>
<li>Eveland, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+modules+controlling+maize+inflorescence+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture.</a> Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).</li>
<li>Takacs, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+maize+shoot+apical+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the maize shoot apical meristem.</a> Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).</li>
<li>Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot+apical+meristem+and+cotyledon+formation+during+Arabidopsis+embryogenesis%3A+interaction+among+the+CUP-SHAPED+COTYLEDON+and+SHOOT+MERISTEMLESS+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes.</a> Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).</li>
<li>Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+CUP-SHAPED+COTYLEDON+genes+in+gynoecium+and+ovule+development+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).</li>
<li>Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CUP-SHAPED+COTYLEDON1+gene+of+Arabidopsis+regulates+shoot+apical+meristem+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation.</a> Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).</li>
<li>Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maize+duplicate+genes+narrow+sheath1+and+narrow+sheath2+encode+a+conserved+homeobox+gene+function+in+a+lateral+domain+of+shoot+apical+meristems%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems.</a> Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).</li>
<li>Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Fluorescence activated cell sorting.</a> Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).</li>
<li>Birnbaum, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A gene expression map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).</li>
<li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+root+spatiotemporal+map+reveals+dominant+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns.</a> Science. 318 (5851), 801-806 (2007).</li>
<li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li>
<li>Ruzin, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuzin%2C+SE+%22Plant+microtechnique+and+microscopy%22">Plant microtechnique and microscopy</a>. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).</li>
<li>Jackson, D., Veit, B., Hake, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/43253604_Expression_of_maize_KNOTTED1_related_homeobox_genes_in_the_shoot_apical_meristem_predicts_patterns_of_morphogenesis_in_the_vegetative_shoot">Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot.</a> Development. 120, 405-413 (1994).</li>
<li>Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+for+the+precise+localization+of+transcripts+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants.</a> J Vis Exp. (57), e3328(2011).</li>
<li>Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+global+RNA+amplification+and+its+use+for+high-throughput+transcript+analysis+of+laser-microdissected+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Plant+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm.</a> Int J Plant Genomics. , 61028(2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Deney tasarımı RNA DİZ deneylerinde önemli bir faktördür. Anahtar hususlar kesin etki (ler) ve gelişimsel aşaması (ler) analiz edilecek ve ne karşılaştırmalar yapılacaktır vardır. çıkış iki veya daha fazla durum arasında de genlerin bir liste genellikle, çünkü karşılaştırmalar açısından düşünmek için çok önemlidir. Tüm deneylerde olduğu gibi, aynı anda yalnızca tek bir değişken değiştirmek için önemlidir. Farklı yaprak etki karşılaştırırken Örneğin, aynı koşullar altında yetiştirilen aynı yaş ve gelişim aşaması, karşıla...

Genetik diseksiyon (Şekil 1A) için uygun olan bıçak ve kılıf arasında belirgin bir sınır olduğu gibi mısır yaprağı, morfolojilerinden sırasında gelişimsel alanların oluşumunu incelemek için ideal bir model. yaprak gelişimi, küçük hücrelerden oluşan bir lineer grubun ilk aşamalarında, preligule bandı (PLB), pre-bıçak ve ön kılıf etki alanlarına yaprak primordium&#39;u subdivides. Bir saçak gibi ligule ve üçgen kulakcık PLB (Şekil 1A, C, D) gelişir. Genetik ekranlar bıçak kılıf sınırını bozan mutasyonlar saptanmıştır. Örneğin, resesif liguleless1 (LG1) mutasyonları ligule kulakçıkların, 1, 2, 3, 4 (Şekil 1B) silin. İn situ hibridizasyon LG1 transkript P birikir ortayaLB ve ligule gelişme 5, 6 (Şekil 1E) için o mükemmel bir işaretleyici yaparak, ligule ortaya çıkıyor. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55004/55004fig1.jpg" /> Şekil 1: vahşi tip ve liguleless1-R mısır yaprakları. Ligule ve kulak kepçesi yapıları gösteren, olgun, vahşi tip yaprak (A) Bıçak kaplama sınır bölgesi. (B) ligule ve kulak kepçesi yapıların olgun liguleless1-R yaprak gösteren yokluğunda Bıçak kılıf sınır bölgesi. A ve B Yapraklar yaprak orta damarı boyunca yarıya edilmiştir. Vahşi tip yaprak primordiumunun yoluyla (C) Boyuna kesit. Örnek işleme ve histolojik analiz için boyanmıştır edilmiştir. başlatılması ligule yaprak (ok başı) düzleminden dışarı çıkıntı yapan bir tümsek belirgindir. (D) Boyuna mezhepvahşi tip yaprak primordiumunun yoluyla iyon. metinde tarif edildiği gibi Örnek LM için işlenmiştir. Ok başı ligule başlatılması gösterir. Sürgün ucuna uzunlamasına yanal bölümün in situ hibridizasyon (E) LG1. Yıldız P6 yaprak primordiumunun PLB de LG1 transkript birikimi gösterir. Oklar P6 primordium&#39;un tabanını gösterir. Bar PLB için primordium&#39;un tabanından ölçümünü gösterir. A ve B Ölçek çubukları 20 mm =. CE Ölçek çubukları = 100 mikron. Bu rakam referans 6 (Bitki Biyologlar Telif Amerikan Derneği) modifiye edilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55004/55004fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bu çalışmada, LM RNA Seq yaprak primordiumunun ve ide diğer bölgelerine bıçak-kılıf sınır nispetle farklı ifade edilen genlerin bir paketi (DE) tanımlamak için kullanılmıştır<html> vahşi tip kardeşleri göre LG1-R mutantlar DE vardır ntify genler. LM RNA Seq özel hücreler ya da hücre alan 7 transkript birikimi ölçülmesi için bir yöntem olup. LM sistemleri lazer ve bir dijital kamera ile bir mikroskop birleştirir. Kesitli doku slaytlar üzerine monte edilir ve mikroskop aracılığıyla görüntülenebilir. LM yazılım genellikle kullanıcı mikrodiseksiyon seçilen herhangi bir bölgeyi anahat izin çizim araçları içerir. hat boyunca lazer kesim ve seçilen doku slayt kapalı mancınık ve slayt üzerinde asılı bir tüp içine almaktadır. LM kullanıcıya özel hücre katmanları ve hatta tek hücreler 8, 9 da dahil olmak üzere hassas etki, microdissect sağlar. RNA daha sonra microdissected dokusundan elde edilebilir. Daha sonra, RNA-Seq bileşen çıkarılan RNA 10 üretilen cDNA kütüphaneleri sıralamak için yeni nesil dizileme kullanır,= &quot;xref&quot;&gt; 11. LM RNA seq Anahtar avantajları kesin olarak tanımlanmış alanlarda transkript birikimi ölçmek yeteneği ve tüm transkriptom aynı anda 7 profile kapasite vardır. teknik faiz bölge genellikle mikroskobik erken gelişim olayları sondalama için uygundur. Daha önceki çalışmalar, LM bitkiler 9, 12, 13, gelişim süreçleri incelemek için mikrodizi teknolojisi ile birlikte kullanmıştır. RNA Seq düşük ifade edilen genler de dahil olmak üzere, geniş bir dinamik aralık, arasında transkript miktarının avantajı vardır ve önceki dizi bilgisi, 11 10 gerekli değildir. Ayrıca, LM RNA Seq nedeniyle-of-zarara genetik fazlalık veya öldürücülüğü için mutagenez ekranlarında gözden kaçabilir gelişimsel olarak önemli genlerin vurgulamak için potansiyele sahiptirfonksiyon mutant. Bu tür dar bir sheath1 (NS1) ve kupa şekilli cotyledon2 (CUC2) halinde gelişimsel olarak önemli genler, genellikle sadece bir spesifik ekspresyon modelleri ya da birkaç hücre 17, 18, 19, 20 sahiptir. Çoğu sadece erken gelişim evrelerinde ve olgun bir organ olarak ifade edilir. Bütün organlar ya da büyük etki incelendiğinde, bu hücreye spesifik transkriptler seyreltilmiş ve daha geleneksel analizlerde tespit edilemez. kesin olarak tanımlanmış etki analiz edilmesine izin vererek, LM RNA Seq bu dokuya özgü genler belirlendi ve miktarları tayin edilmesini sağlar. Burada tarif edilen deneylerde başarısında önemli faktörlerdir bir analiz için uygun gelişim aşamasında ve etki alanının seçimi güdümlü tam histolojik analiz ve hassas measureme vardıLM hücre dokusunu etki nt. Eş etki her kopya için örneklendi emin olmak için, doku, aynı gelişim aşamasında, yaprak primordia toplandı ve microdissected etki, ortaya çıkan ligule (Şekil 2) gibi morfolojik noktalara göre ölçülmüştür. Bazı genler, yaprak tabanına ucundan gradyanı olarak ifade edilmiştir bilinmektedir. Nedeniyle yaprak proksimal-distal ekseni boyunca farklı yerlerden numune hassas etki, varyasyon ölçerek en az (Şekil 3A) tutuldu. Aynı boyutta etki microdissecting ile nedeniyle değişkenlik hücreye özel transkriptlerin seyreltme (Şekil 3B) indirgenerek diferansiyel. Atış apeksinin yan uzunlamasına kesitleri, tüm microdissections kullanılmıştır. Bunlar (Şekil 4) yaprak orta damarı-margin eksenine dik bölümler vardır. SAM içeren tek bölümleri kullanarak o eşdeğer yanal bölgeleri sağlaryaprak taslakları analiz edilir. İşlenmiş ve LM için kesitli numunelerde, ligule akıbet ilk morfolojik işareti nedeniyle adaxial epidermis (Şekil 1D, Şekil 2) periclinal hücre bölünmeleri adaxial tarafında bir darbedir. Gelişmekte olan ligule güvenilir plastochron 7 aşamalı yaprak primordiasında tespit edilebilir o belirlenmiştir. Biz gelişmekte olan ligule ve kulak kepçesi oluşturacaktır hemen uzak hücreleri dahil olmak üzere tüm ligule bölgede ifade genler, ilgilenmişlerdir. Eşdeğer doku seçimi yapılırken sağlamak amacıyla, ligule yumru morfolojik işareti olarak kullanıldı ve ligule yumru merkezli 100 um dikdörtgen LM (Şekil 2A, 2B) için seçildi. Ön bıçak ve ön kılıfın aynı büyüklükte dikdörtgenler aynı yaprak primordia seçilmiştir. liguleless mutant bitkilerin analizi Farklı challe sunulmaktadırnge; LG1-R mutantlar bu nedenle bu morfolojik özellik LM için bölgeyi seçmek için kullanılan olamazdı bir ligule, oluşturmazlar. Bunun yerine, vahşi tip yaprak primordia olarak LG1 transkript birikimi alanı tespit edildi ve bu da kapsamak olan bir bölge tanımlanmıştır. son tahlilde için kullanılan önceki çalışma PLB yeri büyüme koşullarına bağlı olarak değişir göstermiştir beri bu ön analizler, aynı dikimden itibaren fidelerin üzerinde gerçekleştirilmiştir. In situ hibridizasyon LG1 transkript PLB P6 yaprak primordia (Şekil 1 E) birikir olduğunu göstermiştir. Biz LG1 ifadesinin alanını (mor dikdörtgenler, Şekil 2A) kapsıyor ve yabani tip ve LG1-R bitkilerden bu eşdeğer bölgeleri ele yaprak primordiasında tabanından bir alanı 400-900 mikron seçilmiş. transkripsiyonu karşılaştırırken genetik altyapı ve büyüme şartlarına varyasyonu en aza indirmek içinLG1-R ve vahşi tip bitkiler, mutant ve vahşi tipli kardeşlerinden ailelerini ayırma t birikimi kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Dietil pirokarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>159220</td><td>Çözeltilerin RNaz tedavisi için kullanılır</td></tr><tr><td>Jiletli bıçaklar&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>RNase Zap</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020-250ML</td><td>RNase dekontaminasyon çözeltisi</td></tr><tr><td>Etanol mutlak 200 kanıt</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit, buzul</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Cam şişeler - 22 ml</td><td>VWR</td><td>470206-384</td><td></td></tr><tr><td>Ksilenler, histolojik derece</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4L</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık taban kalıpları, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td><td>VWR</td><td>15154-072</td><td></td></tr><tr><td>Gömme halkaları</td><td>VWR</td><td>15154-303</td><td></td></tr><tr><td>Silika jel paketleri</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>71206-01</td><td>Parafin bloklarının depolanması için kurutucu</td></tr><tr><td>Fırın</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0503</td><td>Fırın 60 ° C'lik sıcaklığı korumalıdır; C</td></tr><tr><td>Parafin gömme istasyonu</td><td>Leica&nbsp;</td><td>EG1160</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica&nbsp;</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Slayt ısıtıcı Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>71317-10</td><td></td></tr><tr><td>Coplin kavanozları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>70316-02</td><td></td></tr><tr><td>Lazer mikrodissektör</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KIMWIPES & trade; Hassas Görev Silecekleri</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Mikroskop slaytlarındaki fazla solüsyonları emmek için tüy bırakmayan mendiller</td></tr><tr><td>Membran Slayt 1.0 PEN</td><td>Zeiss</td><td>415190-9041-000</td><td>Lazer mikrodiseksiyon için slaytlar</td></tr><tr><td>Yapışkan Kapak 200 opak</td><td>Zeiss</td><td>415190-9181-000</td><td>Lazer mikrodiseksiyon için tüpler</td></tr><tr><td>PicoPure RNA İzolasyon Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr></tbody></table>

lazer diseksiyon rna sek için deneysel tasarım: mısır yaprak kalkınma bir analiz dersler

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

gelişmesinde önemli rolleri olan genler sıklıkla mekansal ve / veya zamansal sınırlı ifade desenleri var. Genellikle bu gen transkript tespit edilmemiştir ya da farklı olarak tüm bitki organlarının transkriptomik analizlerinde (DE) ifade edildiği gibi tanımlanmamıştır. Lazer Diseksiyon RNA Seq (LM RNA Seq) özel gelişimsel alanlarda DE olan genleri tanımlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, hücresel alanlarının seçimi microdissect ve karşılaştırmak ve microdissections doğruluğu deneylerin başarısı için çok önemlidir için. Burada, iki örnek transkriptomik deneyler için tasarım konuları göstermektedir; RNA DİZİ analizi, mısır yaprağı yakın-uzak eksen boyunca de genleri belirlemek için bir LM ve ikinci bir deney, DE liguleless1-R (LG1-R) olan genleri tanımlamak için mutantlar vahşi tip ile karşılaştırıldığında. Bu deneylerin başarısına katkıda kilit unsurları histolojik ve si ayrıntılı edilditu melezleme analiz edilecek bölgenin analizleri, eşdeğer gelişim aşamalarında yaprak primordiasında seçimi, morfolojik yerlerinden kullanımı mikrodiseksiyon bölgeleri seçin ve hassas ölçümler etki mikrodisseksiyon için. Bu makale LM RNA Sek tarafından gelişimsel etki analizi için ayrıntılı bir protokol sağlar. Burada sunulan veriler mikrodiseksiyon seçilen bölge elde edilen sonuçları nasıl etkileyeceğini göstermektedir.

Yaklaşık 1,000,000-1,500,000 um 2 doku her biri için elde edilmiştir, Şekil 2&#39;de belirtilen LM şeması kullanarak, tüm hücre tabakaları LM (Şekil 5) çoğaltmak ve 200,000 mikron 2 başına adaxial epidermisin LM çoğaltma. Her LG1-R ve vahşi tip yaprak primordia LM replike yaklaşık doku 2,500,000 mikron 2 toplanmıştır. Doğrusal, RNA amplifikasyonuna ait iki tur her tekrar için RNA, mikrogram düzeylerindeki miktarl...

Gelişimsel olarak önemli birçok genin hücre veya dokuya özgü ekspresyon paternleri vardır. Bu makale, mısır yaprağı bıçak-kılıf sınırında ve lg1-R mutantlarında vahşi tipe kıyasla farklı şekilde ifade edilen genleri tanımlamak için LM RNA-seq deneylerini açıklamaktadır. Burada tartışılan deneysel düşünceler, diğer gelişimsel fenomenlerin transkriptomik analizleri için geçerlidir.

Lazer Diseksiyon RNA Sek için Deneysel Tasarım: Mısır Yaprak Kalkınma bir Analiz Dersler

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Bu yöntemin genel amacı, mutant ve vahşi tip örneklerde farklı alanlar arasında veya eşdeğer alanlar arasında karşılaştırmalar yapılabilmesi için belirli hücrelerde veya hücresel alanlarda transkript birikimini ölçmektir. Bu yöntem, organ alanlarının nasıl belirlendiği veya spesifik mutasyonların gen ekspresyonunu nasıl etkilediği gibi gelişimsel biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, transkript birikiminin, elle incelenemeyecek kadar küçük, kesin olarak tanımlanmış alanlarla ölçülebilmesidir.Bu prosedüre başlamadan önce, standart koşullar altında iki haftalık mısır fideleri düzlükleri büyütün. Yan bölümler için sürgün apislerini incelemek için, önce toprak çizgisinin hemen altında bir fide çıkarın. Ardından, bir veya iki olgun yaprakla çevrili bir oval sakin görünene kadar sapın tabanından ince dilimleri çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın.Tabanın yaklaşık 10 milimetre üzerinde başka bir kesim yapın. Bu 10 milimetrelik segment, genç yaprak primordia'daki sürgün apikal meristemini içerir. 10 milimetrelik segmenti, taban yukarı bakacak şekilde çevirin.İki ila üç milimetre kalınlığında bir doku kayması elde etmek için yanal eksene paralel iki kesim yapın. Dıştaki iki kısmı atın ve sabitleme ve gömme için merkezi dilimi saklayın. Doku dilimini yaklaşık 10 mililitre çiftçiye batırın, buz üzerinde bir cam şişeye sabitleyin.Tüm numuneler incelendikten sonra, hava kabarcıklarını çıkarmak ve fiksatifin nüfuz etmesine yardımcı olmak için vakum uygulayın. Vakumu 10 dakika basılı tutun ve ardından vakumu yavaşça serbest bırakın. Sabitleyiciyi değiştirin ve hafifçe çalkalayarak gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün, metin protokolünde açıklandığı gibi dokuları gömmek için işlemeye devam edin. Parafin bloklarını dökmek için, gömme kalıplarını doku gömme istasyonunun sıcak bir plakasına yerleştirin ve doku örneklerini, kesilen yüzey aşağı bakacak şekilde gömme kalıplarına aktarmak için forseps kullanın. Gömme halkasını kalıbın üstüne yerleştirin.Her kalıbı eritilmiş parafin ile doldurun. Parafin katılaşana kadar kalıpları soğuk bir tabağa aktarın. Parafin bloklarını dört santigrat derecede silika jel içeren hava geçirmez bir kapta saklayın.Kesitler, standart prosedürler izlenerek bir mikrotom üzerindeki parafin bloklarından kesilir ve montaj için sürgün apikal meristemi içeren medyan bölümler seçilir. Bölümleri slaytlara monte etmek için, RNaz içermeyen veya 42 santigrat derecelik bir slayt ısıtıcısı üzerine fırınlanmış slaytları yerleştirin. Her slaydı kaplamak için birkaç damla% 50 etanol çözeltisi uygulayın.Bölümleri yavaşça slayt üzerine yerleştirin ve bölümleri genişleyene kadar etanol çözeltisi üzerinde yüzdürün. Ardından, slaytı eğin ve tek kullanımlık bir transfer pipeti ile aspirasyon yaparak fazla etanol çözeltisini çıkarın. Ek etanol çözeltisini uzaklaştırmak için tüy bırakmayan mendiller kullanın.Slaytları birkaç saat veya gece boyunca 42 santigrat derecede kurutun. Slaytlar kuruduğunda, dört santigrat derecede silika jel içeren hava geçirmez bir kapta saklayın. Mikrodiseksiyon gününde slaytları deparafinize edin.Üç cam Coplin kavanozu, yaklaşık 50 mililitre %100 ksilen içeren iki kavanoz ve yaklaşık 50 mililitre %100 etanol içeren bir kavanoz hazırlayın. Slaytları bir iki dakika ksilenlere, iki iki dakika ksilenlere ve bir dakika boyunca %100 etanole batırın. Slaytları tüy bırakmayan mendillerin üzerine boşaltın ve oda sıcaklığında havayla kurutun.Bu işleme başlamak için, slaytları lazer mikrodiseksiyon mikroskobunun sahnesinde sabitleyin. RNasic deneylerinde lazer mikrodiseksiyonun başarısında kritik bir faktör, mikrodiseksiyon için kesin alanları seçmek için morfolojik ve moleküler belirteçlerin kullanılmasıdır. 5X'lik bir objektif kullanarak slaytları inceleyin ve merkezi referans noktası olarak çekim apikal meristem tepesini kullanarak her slayttaki en medyan beş bölümü belirleyin.Ardından, her bölümün plastochron yedi yapraklı primordium üzerindeki ligule konumunu belirlemek için 10X veya 20X'lik bir hedef kullanın. Ligule, yaprak primordiumunun adaksiyal yüzeyinden çıkıntı yapan bir yumru olarak görünür olacaktır. Bu konumu işaretlemek için lazer mikrodiseksiyon yazılımının çizim aracını kullanın.Serbest çizim simgesini seçin, imleci uygun konuma getirin ve çizmek için fareyi tıklayıp sürükleyin. Bir sonraki adım, ligule örnekleri olarak her bölümün bir ligule üzerinde ortalanmış 100 mikrometre yüksekliğindeki dikdörtgenleri ölçmek için cetveli ve dikdörtgen çizim aracını kullanmaktır. Cetvel aracını kullanmak için cetvel simgesini seçin, imleci ölçülecek bölgenin bir ucuna getirin ve ardından bölgeyi ölçmek için tıklayıp sürükleyin.Cetvelin uzunluğu ekranda gösterilecektir. Bir ligul merkezli 100 mikrometrelik bir segmenti ölçmek için cetvel aracını kullanın. Bir dikdörtgen çizmek için düz çizgi çizim aracını seçin ve dört düz çizgi çizin.Aynı şekilde, ligule dikdörtgeninin 50 mikrometre yukarısına ve altına yerleştirilmiş 100 mikrometre dikdörtgenleri ölçün. Bunlar bıçak ve kılıf örnekleri olacaktır. Seçilen alanın ana hatları boyunca doku bölümünü kesmek için lazer kesim işlevini ve dokunun dikdörtgenini slayttan tüpün kapağına itmek için mancınık işlevini kullanarak ölçülen dikdörtgenleri mikrodiseksiyon yapın.Ligul, bıçak ve kılıf örneklerini ayrı tüplerde toplayın. Plastochron yedi yapraklı primordia'dan bıçak, ligule ve kılıf adaksiyal epidermal örnekleri mikrodiseksiyon yapmak için aynı prosedürü kullanın. Son olarak, mikrodiseke edilmiş dokuya RNA ekstraksiyon tamponu uygulayın ve el yazmasında anlatıldığı gibi RNA ekstraksiyonu, RNA amplifikasyonu, kütüphane yapımı, dizileme ve biyoinformatik analiz ile devam edin.Transkript birikimi analiz edildiğinde ve bıçak, ligül ve kılıf bölgelerinin tüm hücre katmanları incelendiğinde, 2.359 diferansiyel olarak eksprese edilen gen bulundu. Abaksiyal epidermal bıçak, ligül ve kılıf bölgelerinde 3.128 diferansiyel olarak eksprese edilen gen bulundu. Lazer mikrodiseksiyon, RLM, RNA dizileme ve in situ hibridizasyon analizleri, bu temsili genlerin gösterdiği gibi tutarlı sonuçlar verdi.Soldaki karikatürler tüm hücre katmanlarının LM'sini göstermektedir ve sağdaki karikatürler sadece adaksiyal epidermisin LM'sini göstermektedir. Görüntülerdeki ok uçları ortaya çıkan ligülleri göstermektedir. Ligüller bir transkript birikimi hem tüm hücre katmanlarında hem de epidermal LM'de ligulde önemli ölçüde daha yüksekti.Dar kılıf bir, hem tüm hücre katmanları LM'de hem de adaksiyal epidermis LM'de ligule bölgesinde önemli ölçüde yukarı regüle edildi ve spesifik olarak ortaya çıkan ligülün ucunda birikti.Fonksiyonu bilinmeyen bir gen, ligule epidermal LM'de tüm katmanlar LM'den daha yüksek bir ortalama yeniden sayıma sahipti.Bu transkript en çok epidermal hücrelerde birikir. Dördüncü gen olan Zm PIN1a, tüm hücre katmanlarının analizinde önemli ölçüde diferansiyel olarak eksprese edilmedi, ancak sadece epidermis analizinde ligulde önemli ölçüde yukarı regüle edildi. Vasküler dokudaki yüksek ekspresyonu, tüm hücre katmanları toplandığında epidermiste transkript birikiminde kafa karıştırıcı farklılıklara neden olabilir.Bu prosedürü denerken, mikrodiseksiyon ve karşılaştırma için hücresel alanların seçiminin ve mikrodiseksiyonların doğruluğunun deneylerin başarısı için çok önemli olduğunu hatırlamak önemlidir.

experimental-design-for-laser-microdissection-rna-seq-lessons-from-an

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Lazer mikrodiseksiyon Drosophila kanat diskin belirli bölümlerinde lokalize RNAi tabi gen ekspresyonu analiz etmek için...

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Bu video makalede izole etmek için bir yöntem mevcut tek veya birden...

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

Bir çift sarmallı RNA girişimi (dsRNAi) tekniği mısır sinamoil koenzim alt bitki lignin içeriğine A redüktaz (ZmCCR1) geni aşağı regüle etmek için kullanılır. Lignin hücre duvarından aşağı-regülasyon mikroskopik analiz ile görselleştirilmiştir ve Klason yöntemi ile ölçülür. Yarı selüloz ve kristalin selüloz içinde Bileşim değişiklikler analiz edilmiştir.

Lignin Aşağı düzenleme<em&gt; Zea mays</em&gt; DsRNAi ve Klason Lignin Analizi ile

Burada, transkripsiyonel profilleme için belirli bitki hücre tiplerinin lazer destekli mikrodiseksiyonu için bir protokol sunuyoruz. Protokol farklı türler ve hücre tipleri için uygun olsa da, odak noktası, turpgil cinsi Boechera'da eşeyli ve apomiktik üreme için önemli olan dişi germ hattının son derece erişilemez hücreleridir.

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

Hücre bölünmesini ve genişlemesini ölçmek, tüm bitki büyümesinin anlaşılması için çok önemlidir. Burada, mısır yaprağı büyüme oranlarını belirleyen hücresel parametreleri hesaplamak için bir protokol sunuyoruz ve bu verilerin, gelişimsel aşamaya özgü örnekleme stratejilerini yönlendirerek moleküler büyüme düzenleyici mekanizmaları araştırmak için kullanımını vurguluyoruz.

Hücre Bölünmesi ve Genişleme Kinematik Analizi: Büyüme ve Örnekleme Gelişim Bölgeleri Hücresel Temeli Quantifying<em&gt; Zea mays</em&gt; Yapraklar

Bu protokol, fare embriyosu taze dondurulmuş bölümlerinden kıkırdak ve kemik izolasyonu için lazer yakalama mikrodizeksiyon açıklar. Kıkırdak ve kemik hızla cresyl menekşe boyama ile görselleştirilmiş ve transkripsiyonanalizi için yüksek kaliteli RNA verim hassas toplanabilir.

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Burada sunulan bitki dokularının lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) için bir protokoldür. LCM, doku alanlarını kontaminasyonsuz bir şekilde izole etmek için mikroskobik bir tekniktir. Prosedür doku fiksasyonu, parafin katıştırma, kesit, LCM ve RNA ekstraksiyon içerir. RNA, transkripsiyonların alt dokuya özgü, zamansal olarak çözümlenmiş analizinde kullanılır.

Bitkilerde Mekansal ve Zamansal Dokuya Özgü Gen Ekspresyonu Analizi için Lazer Yakalama Mikrodiszesi RNA-Dizileme

RNA dizilimi için bireysel nematod dokularını izole etmek için lazer mikrodiseksiyonu kullanan bir protokol tanımlanmıştır. Protokol, türe özgü genetik araç setleri gerektirmez ve gen ekspresyon profillerinin tek doku örnekleri düzeyinde farklı türler arasında karşılaştırılmasına izin verir.

Türlerden Agnostik Tek Doku Uygulamaları için Lazer Mikrodiseksiyonu

Mısır yaprağı primordiaları derinlemesine kaplanır ve yuvarlanır, bu da onları incelemeyi zorlaştırır. Burada, floresan ve konfokal görüntüleme için enine kesitler ve açılmış mısır yaprağı primordialarının bütün montajlarını hazırlamak için yöntemler sunuyoruz.

Enine kesitler hazırlamak için geliştirilmiş yöntemler ve floresan ve konfokal görüntüleme için mısır yaprağı primordiasının bütün montajlarını açma

Çeşitli uygulamalarda uygulama için gelişmiş enzim stabilitesi sağlayan enzim paketli dış zar veziküllerinin (OMV) üretimi, saflaştırılması ve kullanımı için bir protokol sunulmaktadır.

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

Öğrenin, lazer mikrodiseksiyon RNA dizileme yöntemiyle mısır yaprak bıçak-kın sınırında transkript birikimini nicelendirmeyi. Bu teknik, gelişimsel biyolojide gen ifadesi farklılıklarını analiz etmeye yardımcı olur.

Lazer Diseksiyon RNA Sek için Deneysel Tasarım: Mısır Yaprak Kalkınma bir Analiz Dersler

Daha fazla video keşfet