Hipoparatiroid Fare oluşturma iki Teknikleri: Paratiroidektomi GFP Rakorlar ve Difteri-Toksin-Aracılı Paratiroid Ablasyonu kullanma

Bu prosedürün genel amacı, kullanımı kolay, stabil bir fenotip üreten ve tiroid fonksiyonunu sağlam bırakan iki edinilmiş hipoparatiroidizm fare modeli oluşturmaktır. Bu iki modelin ana avantajı, farelerde paratiroid bezlerinin ya floresan kılavuzluğunda cerrahi ile ya da difteri toksin reseptörünün PTH'ye özgü ekspresyonu ile hassas bir şekilde çıkarılmasını sağlamaları ve hücrelerin komşu tiroid bezine müdahale etmeden seçici olarak hedeflenmesine ve yok edilmesine izin vermesidir. Fare modellerimizin hipoparatiroidizm alanındaki temel sorulara cevap verebileceğini umuyoruz.

Örneğin, PTH analog tedavileri, idrarla kalsiyum atılımını artırmadan normal serum kalsiyum seviyelerinin korunmasına yardımcı olabilir mi? Bu modeller ayrıca hipoparatiroidizmdeki diğer klinik soruları incelemek için de kullanılabilir. Örneğin, kemik gücü hipoparatiroidizmden etkilenir mi ve tedavi ile değişir mi?

Bu gibi soruları hastalarda cevaplamak zordur, ancak bu fare modelleri bunları ele almak için kullanılabilir. Sekiz ila 10 haftalık fareleri uyuşturarak başlayın, onaylanmış bir protokole göre GFP'yi özellikle paratiroidlerde eksprese edin. Hayvanı sırtüstü pozisyona getirin ve ayak parmağı, çimdikleme, geri çekilme refleksi veya başka yollarla uygun bir anestezi derinliği sağlayın.

Ventral boyun bölgesini uzatın ve kürkü tıraş ederek ameliyata hazırlanın. Tıraşlı cildi povidon iyot antiseptik ped ile dezenfekte edin ve ardından onaylanmış protokolünüze göre cerrahi bir ovma ve alkollü durulama kullanarak insizyon bölgesini hazırlayın. Daha sonra, cerrahi bölgenin kontaminasyonunu azaltmak için hayvanı steril cerrahi örtülerle örtün.

Cerrahi bir neşter ile 2 santimetre boyuna bir kesi kestikten sonra, fasyayı incelemek için kavisli, tırtıklı forseps kullanın ve tükürük bezlerini yana doğru itin. Daha sonra cerrahi bölgeyi diseksiyon mikroskobu ile görüntülerken, paratrakeal kasları kesmek ve ayırmak ve trakeayı ortaya çıkarmak için keskin forseps uçlarını kullanın. Trakeanın yanında bulunan tiroid bezinin sağ ve sol loblarını tanımlayın.

Ardından ışık kaynağını floresan ışığa çevirin ve iki yeşil floresan paratiroid bezini görselleştirin. Kemirgenler tipik olarak sadece iki paratiroid bezine sahiptir. Her iki tarafta tiroidin yanındaki iki paratiroid bezini tanımlayamazsanız, ektopik yerleşimli paratiroid bezlerinden şüphelenilmeli ve trakea boyunca dikkatli bir arama yapılmalıdır.

Daha sonra, yeşil paratiroid bezlerini dikkatlice çıkarmak için cerrahi forseps ve makas kullanın ve tüm yeşil dokunun çıkarıldığından emin olmak için trakea boyunca dikkatlice kontrol edin. Hemostaz için steril gazlı bez kullanın. Paratrakeal kasları kesintili dikişlerle kapatın.

Cilt kesisini Halstead dikişlerle kapatın. Ameliyat sonrası hayvanı, vücut ısısının geri kazanılması için bir ısıtma pedi üzerinde ayrı bir kafese yerleştirin. Fare uyandığında, kafes zeminine pelet yemi ve biraz jelatinli yiyecek ile su koyun.

Ameliyat sonrası iki saatlik bir gözlem süresinden sonra, fareyi hayvan tesisine geri koyun. Paratiroidektomiden üç gün sonra, kan gazı sistemi, kalsiyum ve pH analizörü gibi bir analizör kullanarak iyonize kalsiyum için 10 mikrolitre kuyruk kanını analiz edin. Paratiroidektomi başarılı olursa, kanda iyonize kalsiyum, sahte olarak çalıştırılan kontrol farelerininkinin eksi iki standart sapmasına eşit veya daha az olacaktır.

Difteri toksin tozunu steril tuzlu su ile mililitre başına 0.5 mikrogram konsantrasyona seyrelterek difteri toksini çözeltisi hazırlayarak başlayın. Steril filtre, çözelti ve alloquot. Sekiz ila 10 haftalık farelere kilogram vücut ağırlığı başına beş mikrogram difteri toksini enjekte edin ve özellikle paratiroidlerde difteri toksin reseptörlerini eksprese edin.

İkinci bir difteri toksini enjeksiyonundan üç gün sonra, daha önce olduğu gibi iyonize kalsiyum için 10 mikrolitre kuyruk kanını analiz edin. Aşağıdakiler, özellikle paratiroidde GFP'yi eksprese eden farelerde paratiroid bezlerinin çeşitli yerlerinin temsili görüntüleridir. Farelerde iki veya üç yeşil paratiroid bezi vardı.

Paratiroid bezlerinin çoğu tiroid bezinin üst sınırına veya alt sınırına yakın bir yerde bulunurdu. Nadir durumlarda, bazı paratiroid bezleri ektopik olarak yerleşmiştir. Fare modelimizin avantajlarından biri de tiroid bezinin sağlam kalmasıdır.

Bu şekil, paratiroidektomiden üç ay sonra GFP-PTX farelerinin TSH seviyelerini göstermektedir. Bu şekil T4 ölçümlerini göstermektedir. GFP-PTX fareleri, kontrol farelerinden farklı olmayan TSH konsantrasyonları ve T4 konsantrasyonları gösterir.

Bu görüntü, GFP-PTX farelerinde kan kalsiyum seviyelerini ve PTH seviyelerini göstermektedir. Bu görüntü, difteri toksini enjekte edilen PTHcre-iDTR farelerinde kan kalsiyum seviyelerini ve PTH seviyelerini göstermektedir. Hem GFP-PTX fareleri hem de DT enjekte edilen PTHcre-iDTR fareleri, üç aylık bir gözlem süresi boyunca stabil hipokalsemi sergiledi ve PTH seviyelerini düşürdü.

Bir kez ustalaştıktan sonra, GFP kılavuzluğunda paratiroidektomi tüm prosedür için yaklaşık 20 dakika içinde yapılabilir. Tek bir difteri toksini enjeksiyonu, uygun şekilde yapılırsa bir dakikadan fazla sürmez. Bu prosedürü takiben, bu fareler hipoparatiroidizm geliştirir ve klinik öncesi bir hastalık modeli olarak kullanılabilir.

Hipoparatiroidizm tedavisinde farklı PTH hormon analoglarının etkinliği gibi sorular ele alınabilir. Difteri toksininin tehlikeli olduğunu ve çalışanların olağan difteri toksini aşılarına sahip olmaları gerektiğini unutmayın. Bu işlemler yapılırken maske ve eldiven gibi kişisel koruyucu ekipmanlar mutlaka giyilmelidir.