Name: Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Öğrenin, TGF-β kullanarak naif CD4+ T hücrelerinden insan FOXP3+ iTreg hücreleri üretme ve fenotipleme yöntemini. Bu teknik, bağışıklık toleransı ve otoimmün hastalık araştırmaları için tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nina Nagel, video çekimi ve deney hazırlığı sırasındaki teknik yardımı için minnetle teşekkür eder. Hücre içi FOXP3 boyama protokolüne yardımcı oldukları için Eva-Maria Weiss'e ve nTreg izolasyon protokolünü oluşturdukları için Elisabeth Suri-Payer ve Nina Oberle'ye teşekkür ederiz. Matilda Eriksson ve Peri Noori laboratuvar yönetimi için kabul edilmektedir. 
Finansman: A.S., 7. Avrupa Topluluğu Çerçeve Programı, Dr. Åke Olsson Vakfı ve KI araştırma vakıfları kapsamında Marie Curie Intra European Bursu tarafından desteklenmiştir; A.S. ve J.T., CERIC (Enflamasyon ve Kardiyovasküler Hastalık Araştırmaları Mükemmeliyet Merkezi) hibesi ile desteklenmiştir, JT, Vetenskapsrådet Tıp ve Sağlık (Dnr 2011-3264) tarafından desteklenmiştir, Torsten Söderberg Vakfı, FP7 STATegra, AFA Sigorta ve Stockholm İl Meclisi.

<ol><li>Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells%3A+history+and+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells: history and perspective.</a> Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).</li>
<li>DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+FoxP3%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+cancer%3A+A+critical+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Can+Res%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature.</a> Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).</li>
<li>Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Regulatory+T+Cells+in+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Regulatory T Cells in Tumors.</a> FEBS J. , (2016).</li>
<li>Trzonkowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-in-man+clinical+results+of+the+treatment+of+patients+with+graft+versus+host+disease+with+human+ex+vivo+expanded+CD4%2BCD25%2BC%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C.</a> Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).</li>
<li>Brunstein, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+ex+vivo+expanded+T+regulatory+cells+in+adults+transplanted+with+umbilical+cord+blood%3A+safety+profile+and+detection+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics.</a> Blood. 117, 1061-1070 (2011).</li>
<li>Di Ianni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tregs+prevent+GVHD+and+promote+immune+reconstitution+in+HLA-haploidentical+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation.</a> Blood. 117, 3921-3928 (2011).</li>
<li>Edinger, M., Hoffmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+in+stem+cell+transplantation%3A+strategies+and+first+clinical+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences.</a> Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).</li>
<li>Bluestone, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes+immunotherapy+using+polyclonal+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells.</a> Science Transl Med. 7 (315), 189(2015).</li>
<li>Haribhai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+induced+regulatory+T+cells+in+tolerance+induction+in+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis.</a> J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).</li>
<li>Haribhai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+requisite+role+for+induced+regulatory+T+cells+in+tolerance+based+on+expanding+antigen+receptor+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity.</a> Immunity. 35, 109-122 (2011).</li>
<li>Abbas, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells%3A+recommendations+to+simplify+the+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature.</a> Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).</li>
<li>Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+adaptive+foxp3%2B+regulatory+T+cells%3A+more+of+the+same+or+a+division+of+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor.</a> Immunity. 30, 626-635 (2009).</li>
<li>Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+FOXP3+expression%3A+the+key+to+a+stable+regulatory+T-cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).</li>
<li>Schmitt, E. G., Williams, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+function+of+induced+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation and function of induced regulatory T cells.</a> Front Immunol. 4, 152(2013).</li>
<li>Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+regulatory+T-cells%3A+a+state+attained+by+all+activated+human+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Immunol%22%5BJournal%5D)">Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells.</a> Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).</li>
<li>Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+FOXP3+in+human+activated+nonregulatory+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells.</a> Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).</li>
<li>Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+lineage+commitment+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance.</a> Immunity. 30, 616-625 (2009).</li>
<li>Sun, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestine+lamina+propria+dendritic+cells+promote+de+novo+generation+of+Foxp3+T+reg+cells+via+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.Exp.Med%22%5BJournal%5D)">Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid.</a> J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).</li>
<li>Coombes, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+specialized+population+of+mucosal+CD103%2B+DCs+induces+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+via+a+TGF-beta+and+retinoic+acid-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism.</a> J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).</li>
<li>Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+A+metabolites+induce+gut-homing+FoxP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells.</a> J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).</li>
<li>Mucida, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+can+directly+promote+TGF-beta-mediated+Foxp3%28%2B%29+Treg+cell+conversion+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells.</a> Immunity. 30, 471-472 (2009).</li>
<li>Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Analysis+of+Protocols+to+Induce+Human+CD4%2BFoxp3%2B+Regulatory+T+Cells+by+Combinations+of+IL-2%2C+TGF-beta%2C+Retinoic+Acid%2C+Rapamycin+and+Butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate.</a> PloS one. 11 (2), 0148474(2016).</li>
<li>Furusawa, Y., Obata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">regulatory T cells.</a> Nature. 504, 446-450 (2013).</li>
<li>Arpaia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+produced+by+commensal+bacteria+promote+peripheral+regulatory+T-cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation.</a> Nature. 504, 451-455 (2013).</li>
<li>Battaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+promotes+expansion+of+functional+CD4%2BCD25%2BFOXP3%2B+regulatory+T+cells+of+both+healthy+subjects+and+type+1+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients.</a> J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).</li>
<li>Hippen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+ex+vivo+expansion+of+human+natural+regulatory+T+cells+%28T%28regs%29%29+with+minimal+loss+of+in+vivo+functional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity.</a> Sci. Transl. Med. 3, 41(2011).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+macrophages+induce+CD4%28%2B%29Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells+via+binding+and+re-release+of+TGF-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+cell+biol%22%5BJournal%5D)">Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β.</a> Immunol cell biol. , (2016).</li>
<li>Baron, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+demethylation+in+the+human+FOXP3+locus+discriminates+regulatory+T+cells+from+activated+FOXP3%28%2B%29+conventional+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells.</a> Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+regulatory+T+cells+rapidly+suppress+T+cell+receptor-induced+Ca%282%2B%29%2C+NF-kappaB%2C+and+NFAT+signaling+in+conventional+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells.</a> Sci. Signal. 4, 90(2011).</li>
<li>Ohkura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+stimulation-induced+epigenetic+changes+and+Foxp3+expression+are+independent+and+complementary+events+required+for+Treg+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development.</a> Immunity. 37, 785-799 (2012).</li>
<li>Hill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+enhances+Foxp3+induction+indirectly+by+relieving+inhibition+from+CD4%2BCD44hi+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells.</a> Immunity. 29, 758-770 (2008).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+Sulfide+Promotes+Tet1-+and+Tet2-Mediated+Foxp3+Demethylation+to+Drive+Regulatory+T+Cell+Differentiation+and+Maintain+Immune+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis.</a> Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).</li>
<li>Yue, X., Trifari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Foxp3+stability+through+modulation+of+TET+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity.</a> The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).</li>
<li>Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+Facilitates+Demethylation+of+the+Foxp3+Enhancer+in+a+Tet-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner.</a> J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).</li>
<li>Geiger, T. L., Tauro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+nurture+in+Foxp3+%2B+regulatory+T+cell+development%2C+stability%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function.</a> Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2-induced+CD4%2BFoxp3%2B+T+cells+attenuate+acute+graft-versus-host+disease+by+suppressing+expansion+and+killing+of+effector+CD8%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells.</a> J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).</li>
<li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells.</a> Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).</li>
<li>McMurchy, A. N., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+assays+with+human+T+regulatory+cells%3A+a+technical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+immunol%22%5BJournal%5D)">Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide.</a> Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).</li>
<li>Mutis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+regulatory+T+cells+control+xenogeneic+graft-versus-host+disease+induced+by+autologous+T+cells+in+RAG2-%2F-gammac-%2F-+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+cancer+res%22%5BJournal%5D)">Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice.</a> Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).</li>
<li>Tran, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+suppression+assay+for+functional+assessment+of+human+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol+biol%22%5BJournal%5D)">In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells.</a> Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).</li>
<li>Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Suppression+of+Cytokine+Transcription+in+Human+CD4%2BCD25+T+Cells+by+CD4%2BFoxp3%2B+Regulatory+T+Cells%3A+Independence+of+IL-2+Consumption%2C+TGF-beta%2C+and+Various+Inhibitors+of+TCR+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling.</a> J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).</li>
<li>Shevach, E. M., Thornton, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tTregs%2C+pTregs%2C+and+iTregs%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences.</a> Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Açıklanan protokol, insan CD4 + FoxP3 + insan naif CD4 + T hücrelerinden iTregs sağlam indüksiyon sağlar. Biz üstün in vitro baskılayıcı fonksiyonu 22 iTregs uyarılması için, TGF-p, ATRA ve rapamisin bir arada kullanarak, son zamanlarda açıklanan yeni bir protokol içerir. Diğer yayınlanmış protokollere göre, bir başka avantajı, tek başına IL-2 varlığında, aktive edilmiş olan kontrol hücreleri ile birlikte, belirli bir iTreg uyaran faktörlerin etkileri doğrudan karşılaştırma sağlar farklı p...

CD4 + CD25 + FoxP3 + düzenleyici T hücreleri (Tregs) diğer bağışıklık hücrelerini bastırmak ve periferik tolerans kritik arabulucular, önlenmesi otoimmünite ve aşırı enflamasyon 1 bulunmaktadır. Tregs önemi, ciddi sistemik otoimmün hastalık yol açar Tregs kaybı nedeniyle `master&#39; Treg transkripsiyon faktör forkhead kutusu P3 mutasyonlar insan hastalık immunodysregulation poliendokrinopati enteropatisi X&#39;e bağlı sendromu (IPEX), (FoxP3) tarafından örneklenmiştir erken yaşta ölümcül. Ancak, Treg&#39;ler onlar da bazı ayarlarda 2 anti-tümör bağışıklığını engel gibi bağışıklık sisteminde bir iki ucu keskin kılıç olarak hareket ederler. Treg sayısı ve fonksiyonu Terapötik manipülasyon birçok klinik araştırmalarda bu nedenle tabidir. Kanserinde Tregs tükenmesi arzu edilebilir ve klinik yaklaşımlar bazı başarı daha fazla araştırma 3 teşvik eder. Pek çok dil içinde Tregs terapötik etkilerine ek olarak, otoimmün ve enflamatuar hastalıkların, bölgesindekiral fare hastalık modelleri, evlatlık Treg transferi son ilk-man denemeleri greftleme karşı -host hastalığı (GVHH) 4 önlemek için - 7 ve çok umut verici sonuçlar vermiştir tip 1 diyabet 8 tedavisinde güvenliğini değerlendirmek için. 11 - Doğal Tregs (nTregs üretme) SAĞLIK 9 korunmasında yedeksiz temel fonksiyonları ile timik türevli tTregs ve periferik kaynaklı pTregs içermektedir meydana. Bununla birlikte, nTreg numaraları naif T hücresi öncüleri 12 in vitro olarak uyarılması Tregs (iTregs) tamamlayıcı bir yaklaşım teşvik sınırlıdır. Bunun nedeni, muhtemelen FoxP3 gen lokusu 13 olarak adlandırılan regülatör özgü demetile bölge (TSDR) &#39;de demetilasyon eksikliği iTregs Hala stabilite, bir sorun olmaya devam etmektedir ve birçok çalışma, Tregs bağlı in vivo 14 daha kararlı olduğunu göstermektedir. Bugüne kadar, FoxP3 en iyi protein m kalırinsan geleneksel CD4 + CD25 T hücreleri geçici aktivasyon 15,16 üzerine FOXP3 orta düzeyde ifade çünkü Tregs için arker ama kesinlikle özel değildir. önemli bir ilerleme FoxP3 ekspresyonunun düzenlenmesi açıklık yapılmış olmasına rağmen, daha özel olarak, insan hücrelerinde FOXP3 indüklenmesi, kararlılık ve işlevi ile ilgili tespit edilmesi gerekmektedir. NTregs için farklılıklara rağmen, in vitro FoxP3 neden + CD4 + T hücreleri FoxP3 indüksiyon moleküler mekanizmaları incelemek için bir model sistem olarak da kullanılabilir ve daha benzer iTregs üretilmesine izin gelecek protokolleri geliştirmek için bir başlangıç noktası olarak gelecekte adaptif transfer stratejileri için geçerli olabilir oluşturulan Tregs, vivo. Orada insan iTregs ikna etmek için hiçbir `altın standard&#39; protokolü ve mevcut protokoller in vivo regülatör uyaran koşulları taklit dayalı geliştirilen edilmiştir: 2 (IL-2, interlökin) Ve transforme edici büyüme faktörü β (TGF-β) sinyal vivo 17 FoxP3 indüksiyonu için çok önemli olan, ve all-trans retinoik asit (ATRA) - bağırsak ile ilişkili dendritik hücreler tarafından in vivo üretilen - sıkça FoxP3 arttırılması için kullanılır 21 - 18, in vitro olarak. Bu bütirat 22 en son sıçangil regülatör indüksiyon 23,24 artırdığı gösterilmiştir bağırsak Mikrobiyota türetilen kısa zincirli yağ asit kullanılarak ek insan regülatör T indükleyici protokolleri geliştirmiştir. Ayrıca son zamanlarda bu teşvik ettiği bilinir önleyicisi ikinci rapamisin (mTOR) klinik olarak kabul memeli hedefi olarak, TGF-p, ATRA bir kombinasyonu kullanılarak ve 22 rapamisin ile, in vitro olarak, üstün bastırma fonksiyonu ile iTregs üretimi için yeni bir protokol kurulan insan Treg genişleme 25,26 sırasında FoxP3 bakım. Bu yöntem tekrarlanabilir açıklarinsan CD4 + FoxP3 + farklı olan bir dizi şartı ile iTregs ve akış sitometrisi ve kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyon ile daha sonra fenotipleme nitro nesil (qRT-PCR) FOXP3 sentezlenmesi ve diğer regülatör imza molekülleri, protokole özel desenler ortaya çıkarmak için CD25, CTLA-4, EOS, hem de IFN-y ve SATB1 ifade 22 baskı olarak. oluşturulan hücre popülasyonları, genel FoxP3 düzenleyicileri ile ilgili ya da bu tür butirat veya rapamisin gibi bazı bileşiklerin özel etkilerini incelemek için, ya baskılayıcı aktivitesi ile ilgili olarak, işlevsel tayinler için veya moleküler çalışmalar için de kullanılabilir. Treg farklılaşma sürüş moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması, özellikle Treg nesil ve fonksiyonunda yer alan molekülleri hedef otoimmünite veya kanser gelecekteki terapötik yaklaşımlara için büyük önem taşımaktadır.

<table><tbody><tr><td>All-trans retinoik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG & nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anit-insan Foxp3-APC klonu 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD25 mikro boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD28 antikoru, LEAF Saflaştırılmış&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD3 Antikoru, LEAF Saflaştırılmış&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD45RA, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD45RO PE klonu UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD4-PerCP klonu SK3; mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CD8-eFluor 450 (klon OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan CTLA-4 (CD152), klon BNI3, mIgG2ak, Parlak menekşe 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>anti-insan IFN-g FITC klonu 4S. B3; mIgG1k eBioscience</td><td></td><td>11-7319-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A içeren çözelti: GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>cDNA sentez kiti: SuperScript VILO(Ters transkriptaz) cDNA Sentez Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunluk santrifüj ortamı: Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO %99,7</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, ısıyla etkisiz hale getirilmiş</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Sabitlenebilir Canlılık Boyası, eFluor 780&nbsp; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 veya 65-0865-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 Boyama Tampon Seti</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Dikkat: paraformaldehit içerir. Antikor ile kombine kit halinde de satın alınabilir; 77-5774-40 İnsan Karşıtı Foxp3 Boyama Seti APC Klonu: 236A/E7 Set</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-alanil-L-glutamin)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>insan saf CD4 T hücre izolasyon kiti II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>İnsan serum albümini 50 g / L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces conglobatus'tan İyonomisin >98%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS-sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>fare IgG1 K İzotip Kontrolü APC Klonu: P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>fare IgG1 K İzotip Kontrolü FITC 50 &# 956; g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>fare IgG2a izotip kontrolü, Parlak menekşe 421, klon MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet plastik, ayrı ayrı paketlenmiş</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA Phorbol 12-miristat 13-asetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rapamisin</td><td>EMD (Merck)</td> <td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan IL-2, CF</td><td>R & D</td><td>202-IL-050 / CF</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan TGF-beta 1, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010 / CF</td><td></td></tr><tr><td>RNA izolasyon kiti: RNAqueous-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931 ve nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta&nbsp;</td><td>Canlandırıcı</td><td>72400-054 & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bütirat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T hücre kültürü ortamı: X-Vivo 15 ortamı, gentamisin + fenolred</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gen Ekspresyon Testi, FOXP3 (En İyi Kapsama) &nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4331182 tahlil kimliği: Hs01085834_m1</td><td>Dikkat: paraformaldehit</td></tr><tr><td>içerir TaqMan Gen Ekspresyon Testi, RPL13A (En İyi Kapsam)</td> <td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4351370; tahlil kimliği: Hs04194366_g1&nbsp; &nbsp;</td><td>Dikkat: paraformaldehit içerir</td></tr><tr><td>TaqMan Gen Ekspresyonu Master karışımı</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4369514</td><td></td></tr></tbody></table>

bir tgf-β-içeren protokolü kullanılarak naif cd4 + t hücrelerinden insan cd4 + foxp3 + bağlı regülatör t hücreleri (itregs) in vitro ayrımında

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) periferik toleransın ayrılmaz bir parçasıdır, öz yapılara karşı bağışıklık reaksiyonlarını baskılar ve böylece otoimmün hastalıkları önler. Treg'leri evlat edinerek transfer etmek veya kanserde Treg'leri tüketmek için klinik yaklaşımlar umut verici ilk sonuçlarla devam etmektedir. 
Doğal olarak oluşan Treg'lerin (nTreg'ler) sayısı çok sınırlı olduğundan, in vitro indüklenmiş Treg'leri (iTreg'ler) kullanarak belirli Treg özelliklerini incelemek avantajlı olabilir. Bugüne kadar, Treg'leri tanımlamak için kesinlikle spesifik olmasa da en iyi protein belirteci, transkripsiyon faktörü FOXP3'tür. Periferik olarak indüklenen Treg'lerin yedekli olmayan rolleri de dahil olmak üzere Treg'lerin önemine rağmen, iTreg'leri üretme protokolleri, özellikle insan hücreleri için şu anda tartışmalıdır. Bu nedenle bu protokol, paralel olarak bir dizi Treg indükleyici faktör (TGF-β artı sadece IL-2 veya bunların retinoik asit, rapamisin veya bütirat ile kombinasyonları) kullanılarak insan CD4 + FOXP3 + iTreg'lerinin insan naif T hücrelerinden in vitro farklılaşmasını tanımlar. Ayrıca bu hücrelerin akış sitometrisi ve qRT-PCR ile fenotiplemesini de tanımlar. 
Bu protokoller, FOXP3 ve diğer Treg imza genlerinin tekrarlanabilir ekspresyonu ile sonuçlanır ve genel FOXP3 düzenleyici mekanizmaların yanı sıra belirli faktörlerin etkisini tanımlamak için protokole özgü etkilerin incelenmesini sağlar. iTreg'ler, Treg indüksiyonunun moleküler mekanizmalarının yanı sıra çeşitli fenotipik yönleri incelemek için kullanılabilir. Ayrıntılı moleküler çalışmalar, elde edilebilecek nispeten büyük hücre sayıları ile kolaylaştırılmaktadır. 
 iTregs uygulaması için bir sınırlama, bu hücrelerde FOXP3 ekspresyonunun nTregs'e kıyasla göreceli kararsızlığıdır. Bu protokoller tarafından üretilen iTreg'ler, TGF-β artı retinoik asit ve rapamisin tarafından indüklenen iTreg'lerin üstün baskılayıcı aktivite gösterdiği baskılayıcı fonksiyonlarının incelenmesi gibi fonksiyonel testler için de kullanılabilir. Bununla birlikte, iTreg'lerin baskılayıcı kapasitesi nTreg'lerden farklı olabilir ve uygun kontrollerin kullanılması çok önemlidir.

Şekil 1 deney düzeneği bir şemasını göstermektedir. Şekil 2, manyetik izole saf CD4 + T hücreleri ve nTregs için temsili bir saflıkta kontrol boyamasını göstermektedir. F ŞEKIL 3A yolluk stratejisi sitometri akışını gösterir ve Şekil 3B temsilcisi FoxP3 ve CD25 belirtilen iTreg veya kontrol koşulları altında kültür 6. günde boyamalar flow sitometri ...

Bu protokol, in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden üretilebilir üretimi ve insan kaynaklı düzenleyici T hücrelerinin (iTregs) fenotipleme tarif eder. FoxP3 indüksiyonu için farklı protokoller ilgili protokolleri ile elde edilen spesifik iTreg fenotipleri çalışması için izin verir.

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Bu deneyin genel amacı, in vitro olarak saf CD4 T hücrelerinden insan FOXP3 pozitif düzenleyici T hücrelerini indüklemek ve fenotiplerini analiz etmektir. Bu yöntem, düzenleyici T hücresi farklılaşmasının moleküler düzeyde nasıl gerçekleştiği gibi T hücresi immünolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, insan FOXP3 pozitif düzenleyici T hücrelerinin tekrarlanabilir üretimine ve fenotiplenmesine izin vermesidir.Bu yöntem, düzenleyici T hücresi farklılaşması hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer CD4 T hücresi alt kümelerini ve diğer ilgili bağışıklık hücrelerini incelemek için de değiştirilebilir. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü PBMC ve manyetik bit izolasyon adımlarının açıklanmasından ziyade gösterildiğinde anlaşılması kolaydır. Periferik kan T hücrelerini izole etmek için, her buffy kat için beş adet 50 mililitrelik tüpe 15 mililitre oda sıcaklığında yoğunluk gradyan ortamı ekleyerek başlayın ve son buffy coat hacmini oda sıcaklığında PBS ile 180 mililitreye getirin.Daha sonra, yoğunluk gradyan ortamından oluşan bir tüpü yana doğru eğin ve çözeltileri karıştırmadan yaklaşık 35 mililitre seyreltilmiş kanı yoğunluk g

in-vitro-differentiation-human-cd4-foxp3-induced-regulatory-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Tregs bağışıklık sisteminin güçlü bastırıcılar. Bunları tanımlamak için benzersiz yüzey belirteçleri bir eksikliği vardır, dolayısıyla, Tregs tanımları öncelikle fonksiyonel. Burada bir optimize...

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Biz tek bir insan kan bağışında düzenleyici, bellek ve naif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Polarize Tregs sonra da burada ayrıntılı bir bastırma testi dahil olmak üzere genetik homojenlik ile genetik ve fonksiyonel uygulamalar çeşitli diğer komutlara göre olabilir.

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

CD4+ Regülatör T hücreleri güçlü immün modülatörlerdir ve immün homeostazda önemli işlevlere hizmet ederler. Bu hücrelerin periferik kandaki azlığı, özellikle HIV-1 enfeksiyonu bağlamında fonksiyonel çalışmaları zorlaştırır. Burada, HIV-1 ile enfekte bireylerden alınan periferik kandan fonksiyonel CD4 + Treg'leri izole etmek ve genişletmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Yeni Araçlar HIV-1 ile enfekte bireyler gelen Düzenleyici T hücreleri büyütmek için

Naif CD4 Coxsackie adenovirüs reseptör transgenik ekspresyonu ile T-hücreleri içine adenoviral gen transferi düzenleyici T hücre farklılaşmasının moleküler analiz...

Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Fare embriyonik kök hücreleri, OP9-DL1 ko-kültür sistemi kullanılarak in vitro olarak T hücrelerine farklılaştırılabilir. Bu prosedürde başarı, reaktif/hücre bakımına ve tekniğe duyarlı temel adımlara dikkat edilmesini gerektirir. Burada bu kritik parametreleri tartışıyor ve bu teknolojinin benimsenmesini teşvik etmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

T hücrelerinin türetilmesi İn Vitro Fare Embriyonik Kök Hücreleri

Naif CD4+ T hücreleri, aktivasyon sırasındaki ortama bağlı olarak çeşitli alt kümelere polarize olur.  Naif CD4 + T hücrelerinin çeşitli efektör alt kümelerine farklılaşması, T hücresi reseptör uyaranlarının ve spesifik sitokin sinyallerinin eklenmesiyle in vitro olarak elde edilebilir.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Bu makalede, üç boyutlu (3D) timik kültür sistemi tarafından tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı timik göçmenler (iTE) oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. iTE, proliferasyon, hafıza oluşumu ve tümör baskılanması kapasitesine sahip naif T hücreleri ile yakından ilişkili T hücrelerinin homojen bir alt kümesidir.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

Bu protokol, insan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücreleri (CAR Treg'ler) oluşturmak ve test etmek için kolaylaştırılmış bir iş akışı sağlar.

İnsan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücrelerinin üretimi

Bu protokol, düzenleyici T hücrelerinin efektör T hücre çoğalması ve farklılaşması üzerindeki etkilerini araştırmak için in vitro bir ortak kültür stratejisi sunar.

In Vitro Düzenleyici T Hücrelerinin Fonksiyonel Analizi: Proliferasyon ve Farklılaşmaya Odaklanma

Biz retroviral transdüksiyon kullanarak fare antijen spesifik T-hücrelerinin üretmek için bir protokol...

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

Öğrenin, TGF-β kullanarak naif CD4+ T hücrelerinden insan FOXP3+ iTreg hücreleri üretme ve fenotipleme yöntemini. Bu teknik, bağışıklık toleransı ve otoimmün hastalık araştırmaları için tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 + T hücrelerinden insan CD4 + FoxP3 + Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında (Video) | JoVE Journal

Bir TGF-β-içeren Protokolü kullanılarak naif CD4 ⁺ T hücrelerinden insan CD4 ⁺ FoxP3 ⁺ Bağlı regülatör T hücreleri (iTregs) in vitro ayrımında

Daha fazla video keşfet