ChIP-ekzo Yöntem: Base Çifti Hassas Protein-DNA Etkileşimleri belirlenmesi

Bu fonksiyonel genomik teknolojinin genel amacı, belirli bir proteinin canlı hücrelerde işgal ettiği kesin genomik konumları belirlemektir. Bu yöntem, transkripsiyon makinesinin kromatin bağlamında nasıl bir araya getirildiği ve çalıştığı gibi gen regülasyonu ve epigenetik alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, son derece düşük arka plana sahip tabana yakın ön çözünürlükte protein DNA etkileşimleri için kesin genomik konumu ortaya çıkarmasıdır.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, protokol karmaşık olduğundan ve baştan sona ayrıntılara dikkat edilmesini gerektirdiğinden mücadele edeceklerdir. Nükleer lizatları sonikasyon yapmak için, reçine adaptörlerini nükleer özler içeren 15 mililitrelik polistiren tüplere yerleştirerek başlayın. Lizatları buz gibi soğuk bir su banyosunda orta güçte 30 saniye açık ve 30 saniye kapalı olmak üzere toplam iki 15 dakikalık seans için sonikasyon

Sonikasyon sonuçlarını kontrol etmek için, her tüpten iki adet 10 mikrolitrelik numuneyi 1.5 mililitrelik tüplere aktarın. Daha sonra, ilk 10 mikrolitrelik numuneyi 10 mikrolitre TE-RNase A ve 0.2 mikrolitre proteinaz K ile birleştirerek çapraz bağları tersine çevirin. Tüpü 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Sonra dört mikrolitre 6X ksilen DNA boyası ekleyin.

İkinci 10 mikrolitrelik numuneye, iki mikrolitre 6X ksilen DNA boyası ekleyerek çapraz bağları koruyun. Her iki numuneyi de 140 voltta %1.5'lik bir agaroz jel üzerinde yaklaşık 30 ila 45 dakika, ikincisindeki bromofenol boyası jelin dörtte üçü kadar olana kadar çalıştırın. Sonikasyon başarılı olduysa, sonikasyonlu lizatları 150 mikrolitre% 10 Triton X-100 içeren iki mililitrelik tüplere aktarın ve karıştırmak için girdap yapın.

Sonikasyonlu lizatları 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 20.000 kez g'de döndürerek çözünmeyen kromatini ve döküntüleri peletleyin. Ardından süpernatanları yeni iki mililitrelik tüplere aktarın. Numuneleri süresiz olarak eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Her kromatin immünopresipitasyonu veya ChIP reaksiyonu için, 1.5 mililitre sonikasyonlu ekstraktları 1.5 mililitrelik tüplerde antikor boncuk konjugatları ile birleştirin. Tüpleri bir mini tüp döndürücü üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede dokuz hızda inkübe edin. Numunelerin sızmadığından ve düzgün şekilde karıştığından emin olmak için birkaç dakika sonra kontrol edin.

Ertesi gün, sıvıyı kapaklarda toplamak için tüpleri çok kısa bir süre aşağı döndürün ve tüpleri bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Sonra özü aspire edin. Her tüpe 0.75 mililitre RIPA tamponu ekleyin.

Ardından tüpleri manyetik raftan çıkarın ve karıştırmak için birkaç kez ters çevirin. Kısa bir döndürmeden sonra, tüpleri mıknatısın üzerine geri yerleştirin ve süpernatanı aspire edin. Son yıkamayı takiben, her tüpe 0.75 mililitre 10 milimolar Tris HCL ekleyin.

Tüpleri manyetik raftan çıkarın ve karıştırmak için numuneleri birkaç kez ters çevirin. Kısa bir döndürmeden sonra, tüpleri tekrar rafa yerleştirin ve süpernatanı aspire edin. Metin protokolüne göre parlatma ve detaylandırma reaksiyonlarını gerçekleştirdikten sonra, ligasyon ana karışımı hesaplamalarını doldurun.

Daha sonra ligasyon karışımını buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpte yapın ve çözeltiyi karıştırmak için pipetleyin. Numune tüpleri manyetik raftayken, numune reçinelerinin her birine 48 mikrolitre P7 ligasyon ana karışımı ve iki mikrolitre farklı bir adaptör indeksi ekleyin. Numuneleri bir ThermoMixer'da iki saat boyunca 25 santigrat derecede üç kez g inkübe edin.

Numuneleri yıkadıktan ve metin protokolüne göre Phy 29 nick onarımı ve kinaz reaksiyonlarını gerçekleştirdikten sonra, lambda eksonükleaz ana karışım hesaplamalarını doldurun ve lambda eksonükleaz karışımını buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpte yapın. Hala manyetik raftayken her bir numune reçinesine 50 mikrolitre lambda eksonükleaz karışımı ekleyin. Daha sonra numuneleri bir ThermoMixer'da 37 santigrat derecede üç kez g sıcaklıkta 30 dakika inkübe edin.

Metin protokolünde anlatıldığı gibi son yıkamayı aspire ettikten sonra, RecJf ana karışım hesaplamalarını doldurarak ve RecJf karışımını buz üzerinde yaparak RecJf nükleaz reaksiyonunu gerçekleştirin. Manyetik raftaki her bir numune reçinesine 50 mikrolitre RecJf karışımı ekleyin. Daha sonra numuneleri bir ThermoMixer'da 37 santigrat derecede üç kez g sıcaklıkta 30 dakika inkübe edin.

Son yıkamayı aspire ettikten sonra, ChIP elüsyon tamponu ve proteinaz K ana karışımını hazırlayın ve her bir numune reçinesine 200 mikrolitre çözelti ekleyin. Yoğuşmayı önlemek için numuneleri bir ThermoMixer'da 65 santigrat derecede üç kez g olacak şekilde ısıtılmış bir kapakla gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, numuneleri kısa bir süre döndürün ve tüpleri bir dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin.

Daha sonra 200 mikrolitre süpernatanı, 200 mikrolitre TE tamponu içeren 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. DNA ekstraksiyonu, P7 primer ekstansiyonu ve ATL reaksiyonlarını takiben, P5 adaptör ligasyon tablosu ana karışım hesaplamalarını doldurun ve ligasyon ana karışımını buz üzerinde yapın. Her numuneye 20 mikrolitre ligasyon karışımı ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin.

Daha sonra numuneleri iki saat boyunca 25 santigrat derecede bir termal döngüleyicide inkübe edin. Metin protokolüne göre DNA saflaştırma ve miktar tayini gerçekleştirin. Burada gösterildiği gibi, 100 ila 500 baz çifti arasında DNA parçaları veren yüksek kaliteli kromatin özleri elde etmek için sonikasyon koşullarını optimize etmek için zaman harcamaya değer.

Ve elektroforetik hareketlilik kayma testi, sonikasyonlu ekstraktların, DNA fragmanlarının süper bir kayması olarak belirgin olan bozulmamış protein DNA çapraz bağları içerdiğini doğrulamak için kullanılır. Arka plan sinyalini değerlendirmek için, reaksiyonda antikor olmadan rutin olarak sahte bir ChIP gerçekleştirilir. Yüksek kaliteli bir ChIP ekzo-kütüphanesi, bir ChIP-seq kütüphanesi hazırlığına kıyasla sahte örnekte çok az arka plan sağlayacaktır.

Burada bir ChIP-exo kütüphanesinin biyoanalizör değerlendirmesi gösterilmektedir. Analiz, kitaplık boyutu dağılımını doğru bir şekilde sağlar ve 125 baz çiftinde çalışan kirletici adaptör dimerlerini tespit eder. Bu panel, çoğalan K562 hücrelerinde insan RPS12 geninde polimeraz II, TFIIB ve TBP için iplikle ayrılmış ChIP-exo etiketi beş asal N'nin düzgün dağılımını göstermektedir.

Bu şekilde, protein kodlayan genlerin transkripsiyonel başlangıç bölgelerine göre ortalama ChIP-exo modelleri gösterilmiştir. Kompozit grafikteki TBP, TFIIB ve polimeraz II için ana tepe konumları, insan transkripsiyon başlatma komplekslerinin genomik organizasyonunu yansıtır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört gün içinde yapılabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, gen düzenleme alanındaki araştırmacıların mayadaki asimetrideki alt nükleer yapının moleküler ayrıntılarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu prosedürü takiben, belirli bir faktörün yakındaki bir genin ekspresyonunu etkileyip etkilemediği gibi soruları ele almak için RNase arama ekspresyon profili oluşturma gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, tüm enzimatik adımlar için ana karışım tablolarını dikkatlice doldurmayı unutmamak önemlidir.

Unutmayın, kanserojenler ve diğer yakıcı maddelerle çalışmak son derece tehlikeli olabilir ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemler alınmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek kaliteli bir ChIP-exo kütüphanesinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.