Name: ChIP-ekzo Yöntem: Base Çifti Hassas Protein-DNA Etkileşimleri belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Öğrenin ChIP-exo yöntemiyle protein-DNA etkileşimlerini baz çifti hassasiyetinde haritalamayı. Bu teknik, gen düzenlemesi ve epigenetik araştırmalarında düşük arka plan gürültüsüyle kesin sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Venters Lab'a ve Moleküler Fizyoloji ve Biyofizik Bölümü üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Laboratuvarında doktora sonrası araştırmacı olduğum sırada ChIP-exo'nun nüansları üzerine rehberliği, akıl hocalığı ve birçok anlayışlı tartışması için Frank Pugh'a özel teşekkürler.

<ol><li>Venters, B. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+eukaryotic+genes+are+transcribed%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How eukaryotic genes are transcribed.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li>
<li>Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+MEF2+target+gene+analysis+in+cardiac+and+skeletal+muscle+reveals+novel+regulation+of+DUSP6+by+p38MAPK-MEF2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling.</a> Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+ArgR-DNA+complexes+at+the+genome-scale+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).</li>
<li>Katainen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%2Fcohesin-binding+sites+are+frequently+mutated+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer.</a> Nat Genet. 47, 818-821 (2015).</li>
<li>Murphy, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+protein-DNA+interaction+underlying+metazoan+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination.</a> Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).</li>
<li>Zere, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Targets+and+Features+of+BarA-UvrY+%28-SirA%29+Signal+Transduction+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems.</a> PLoS One. 10, e0145035(2015).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li>
<li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnucleosomal+structures+and+nucleosome+asymmetry+across+a+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome.</a> Cell. , 1377-1388 (2014).</li>
<li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> PLoS One. 11, e0149339(2016).</li>
<li>Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneTrack--a+genomic+data+processing+and+visualization+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework.</a> Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).</li>
<li>Bardet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+transcription+factor+binding+sites+from+ChIP-seq+data+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution.</a> Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MACE%3A+model+based+analysis+of+ChIP-exo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MACE: model based analysis of ChIP-exo.</a> Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).</li>
<li>Bentley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Illumina-based+ChIP-exonuclease+method+provides+insight+into+FoxA1-DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties.</a> Genome Biol. 14, R147(2013).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

<html> Biz kromatin yakın baz çifti çözünürlükte bir tarafsız, genom şekilde proteinlerin etkileşim için kesin bağlayıcı konumunu belirlemek için fonksiyonel genomik protokol mevcut. İmmüno manyetik reçine kalırken yakın baz çifti haritalama çözünürlük elde etmek için en kritik adım ChIP zenginleştirilmiş DNA eksonükleaz tedavi yöntemidir. Görünüşte, protein kompleksleri potansiyel herhangi bir alt birimi (örn kromatin remodeling kompleksleri veya nükleozom çekirdek parçacık) in vivo ayak izi engelleyeb...

Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) seçici canlı hücreler belirli bir protein ile etkileşime DNA fragmanlarının için zenginleştirerek gen regülasyonu mekanizmaları incelemek için güçlü bir yöntemdir. Teknolojisi, yüksek verimlilik sıralaması (ChIP-seq) 1 ila oligonükleotid array (ChIP-chip) üzerine melezleşme tek bir lokus (standart ChIP-qPCR) tespiti itibaren, iyileştikçe ChIP zenginleştirilmiş DNA parçalarının tespit yöntemleri geliştirmişlerdir. ChIP-seq yaygın bir uygulama, kromatin heterojeniteyi ve nonspesifik DNA etkileşimleri gördü rağmen yanlış pozitif ve kesin olmayan eşleme önde gelen veri kalitesi engel olmuştur. Bu sınırlamaları aşmak için, Dr. Frank Pugh ChIP-ekzo yöntemi 2 geliştirdi. ChIP-ekso belirgin özelliği etkin yerleri bağlayıcı transkripsiyon faktörü ayak izi, ekzonükleaz &#39;ila 3&#39; 5 sahip olmasıdır. Sonuç olarak, ChIP-exo metodolojisi daha yüksek çözünürlük, gözetleme daha dinamik aralık elden ve alt arka plan gürültü. ChIP-exo daha teknik açıdan zor ChIP-seq daha usta olmasına rağmen çalışmalar çeşitli biyolojik sistemler 3-8 kullanarak benzersiz ultra yüksek çözünürlüklü anlayışlar kazanmak amacı olarak, yaygın olarak kabul ediliyor. Gerçekten de, yonga-ekso başarılı bakteri, maya, fare, sıçan ve insan hücre sistemlerine uygulanmıştır. Prensip kanıtı olarak, ChIP-exo başlangıçta maya transkripsiyon bir avuç 2 faktörleri için kesin bağlayıcı motifi tanımlamak için kullanıldı. Bu teknik aynı zamanda, transkripsiyon, ön başlatma kompleksinin organizasyonunu çalışma ve çeşitli histon 9,10 subnucleosomal yapısını çözmek için maya kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, insan rehberleri etkinliklerde bağlama bitişik TFIIB ve Pol II gidermek için ChIP-exo kaldıraçlı ve farklı başlangıç 11 kompleksleri gelen yaygın farklı transkripsiyon ortaya gösterdi. Burada sunulan iş akışı optimize ve sMemeli ChIP-ekso (Şekil 1) için treamlined. İlk olarak, canlı birincil ya da doku kültürü hücreleri, bir kovalent çapraz bağlanırlar in vivo protein-DNA etkileşim bölgesindeki korumak için formaldehit ile muamele edilir. Hücreler parçalanır ve kromatin ~ 100 makaslanmış - 500 baz çifti boyutu fragmanları. ChIP sonra seçici ilgili protein çapraz bağlanmış DNA parçaları için zenginleştirir. Bu noktada, yonga-DİZİ kütüphaneler doğal birkaç yüz baz çifti ortalama fragman büyüklüğü algılama çözünürlüğünü sınırlar hazırlanır. Ancak, ChIP-exo sol ve lambda eksonükleaz ile protein-DNA çapraz sitenin sağ 5 &#39;DNA sınırları kırparak bu sınırlama üstesinden gelir. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi Ardışık kütüphaneleri eksonükleaz ile sindirilmiş DNA inşa edilir. Elde edilen iç içe geçmiş 5 &#39;sınırları protein-DNA etkileşim (Şekil 1, aşama 14), bir in vivo ayak izi temsil eder ve yüksek sekanslama ile tespit edilir. Although ChIP-ekzo metodolojisi ChIP-seq daha katılır, çoğu adımlar arasındaki geçişler örnek kaybı ve deneysel değişkenliği en aza indirir basit boncuk yıkama gerektirir. Önemlisi, ChIP-ekzo ChIP-seq, aynı zamanda ChIP-exo başarılı olmalıdır ChIP-seq ile başarılı herhangi bir örnek bir rafine versiyonu beri. ChIP-seq bir temelde farklı bir veri yapısında ChIP-ekzo sonuçları ile protein-DNA etkileşimleri in vivo ayak izi. Ortak ChIP-seq arayanlar en hassas zirve aramaları elde etmek için, ChIP-ekzo verilerine tatbik edilebilir ancak biz özellikle akılda ChIP-ekzo verilerin benzersiz yapısı ile tasarlanmış biyoinformatik araçlar öneriyoruz. Bunlar Genetrack, GEM, OKVO, Peakzilla ve ExoProfiler 12-15 arasındadır.

<table><tbody><tr><td>%37 formaldehit, metanol içermez, 10 x 10 ml ampul</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>Bölüm 3</td></tr><tr><td>Komple Proteaz İnhibitörü kokteyli (CPI)</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Bölüm 4, 8</td></tr><tr><td>Bioruptor sonikatör</td><td>Diagenode</td><td>UCD200</td><td>Bölüm 5</td></tr><tr><td>15 ml polistiren tüpler</td><td>BD Falcon</td><td>352095</td><td>Bölüm 5</td></tr><tr><td>MagSepharose Protein G Xtra boncuk</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9670-66</td><td>Bölüm 6</td></tr><tr><td>DynaMag-1.5 ml Yan Manyetik Raf</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Bölüm 6-17, 22</td></tr><tr><td>Mini Tüp Döndürücü</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Bölüm 7, 22</td></tr><tr><td>T4 DNA Polimeraz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0203</td><td>Bölüm 9</td></tr><tr><td>DNA Polimeraz I, Klenow</td><td>New England BioLabs</td><td>M0210</td><td>Bölüm 9</td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2 (10x Reaksiyon Tamponu 2)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7002</td><td>Bölüm 9-11, 13, 15, 20</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382</td><td>Bölüm 9-16</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Roche Yaşam Bilimleri</td><td>010419979001</td><td>Bölüm 9, 11, 13</td></tr><tr><td>dNTP'ler</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td>Bölüm 9, 12, 19, 23</td></tr><tr><td>T4 Polinükleotid Kinaz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201</td><td>Bölüm 9, 13</td></tr><tr><td>dATP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0440</td><td>Bölüm 10, 20</td></tr><tr><td>Klenow 3'-5' Exo Eksi</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212</td><td>Bölüm 10, 20</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202</td><td>Bölüm 11, 21</td></tr><tr><td>&;-29 DNA polimeraz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0269</td><td>Bölüm 12, 19</td></tr><tr><td>10x &Phi;-29 Tampon</td><td>New England BioLabs</td><td>B0269</td><td>Bölüm 12, 19</td></tr><tr><td>Lambda Eksonükleaz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262</td><td>Bölüm 14</td></tr><tr><td>10x Lambda Tamponu</td><td>New England BioLabs</td><td>B0262</td><td>Bölüm 14</td></tr><tr><td>RecJf Eksonükleaz</td><td>New England BioLabs</td><td>M0264</td><td>Bölüm 15</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Roche Yaşam Bilimleri</td><td>03115828001</td><td>Bölüm 16</td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Roche Yaşam Bilimleri</td><td>010901393001</td><td>Bölüm 18</td></tr><tr><td>10x T4 Ligaz Tamponu</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202</td><td>Bölüm 21</td></tr><tr><td>AMPure XP (temizleme) boncuklar&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Bölüm 22</td></tr><tr><td>Q5 Sıcak Başlangıç DNA Polimeraz&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>M0493</td><td>Bölüm 23</td></tr><tr><td>5x Q5 Tamponu (5x PCR Tamponu)</td><td>New England BioLabs</td><td>B9027</td><td>Bölüm 23</td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Bölüm 25</td></tr><tr><td>Qubit Florometre</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>Bölüm 26</td></tr><tr><td>Optik Şeffaf Qubit tüpleri&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td>Bölüm 26</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Yüksek Hassasiyetli Test kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Bölüm 26</td></tr></tbody></table>

chip-ekzo yöntem: base Çifti hassas protein-dna etkileşimleri belirlenmesi

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) epigenetik ve spesifik protein-DNA etkileşimlerini izolatlarının gen regülasyonu alanlarında vazgeçilmez bir araçtır. Yüksek verimli sekanslama (Chip seq) bağlı ChIP yaygın kromatin etkileşim proteinlerin genomik konumunu belirlemek için kullanılır. Ancak, ChIP-seq birkaç yüz baz çifti nispeten düşük haritalama çözünürlük ve yüksek arka plan sinyali tarafından engellenmektedir. ChIP-ekzo yöntemi esas çözünürlük ve gürültü hem geliştirir ChIP-seq bir rafine versiyonu. ChIP-ekzo metodolojisinin kilit ayrım etkili bir sol ayak izini kütüphane hazırlık iş akışında lambda eksonükleaz sindirim birleşme ve protein-DNA çapraz sitenin sağ 5 &#39;DNA sınırları olduğunu. ChIP-ekso diziler daha sonra, yüksek sekanslama tabi tutulur. Elde edilen veriler fonksiyonel organizasyon o içine eşsiz ve ultra-yüksek çözünürlüklü bir anlayış sağlamak için kaldıraçlı olabilirgenom f. Burada, biz optimize edilmiş ve memeli sistemlerinde ve yeni nesil dizileme-by-sentez platformu için aerodinamik olan ChIP-exo yöntem açıklanmaktadır.

Aşağıdaki şekiller Burada sunulan ChIP-exo protokol temsili sonuçlar göstermektedir. Birkaç enzimatik adımda bilinen bir çipin seq metodolojilere aksine, yonga-ekso on ardışık göre enzimatik reaksiyonları (Şekil 1) gerekmektedir. Bu nedenle, bakım, her reaksiyon bileşeni, ilgili reaksiyon ana karışıma ilave edilir sağlamak için her adımda alınmalıdır. Biz ortaya çıkan tablo baskı, otomatik olarak reaksiyon master miks hesaplamaları gerçekleştirmek için reaksiyon Tablolar...

Burada, protein-DNA etkileşimlerinin baz çiftine yakın çözünürlüğünü elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu, kromatin immünopresipitasyonu (ChIP-exo) ile seçici olarak zenginleştirilmiş DNA fragmanlarının eksonükleaz muamelesi ve ardından yüksek verimli dizileme ile elde edilir.

ChIP-ekzo Yöntem: Base Çifti Hassas Protein-DNA Etkileşimleri belirlenmesi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Bu fonksiyonel genomik teknolojinin genel amacı, belirli bir proteinin canlı hücrelerde işgal ettiği kesin genomik konumları belirlemektir. Bu yöntem, transkripsiyon makinesinin kromatin bağlamında nasıl bir araya getirildiği ve çalıştığı gibi gen regülasyonu ve epigenetik alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, son derece düşük arka plana sahip tabana yakın ön çözünürlükte protein DNA etkileşimleri için kesin genomik konumu ortaya çıkarmasıdır.Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, protokol karmaşık olduğundan ve baştan sona ayrıntılara dikkat edilmesini gerektirdiğinden mücadele edeceklerdir. Nükleer lizatları sonikasyon yapmak için, reçine adaptörlerini nükleer özler içeren 15 mililitrelik polistiren tüplere yerleştirerek başlayın. Lizatları buz gibi soğuk bir su banyosunda orta güçte 30 saniye açık ve 30 saniye kapalı olmak üzere toplam iki 15 dakikalık seans için sonikasyon.Sonikasyon sonuçlarını kontrol etmek için, her tüpten iki adet 10 mikrolitrelik numuneyi 1.5 mililitrelik tüplere aktarın. Daha sonra, ilk 10 mikrolitrelik numuneyi 10 mikrolitre TE-RNase A ve 0.2 mikrolitre proteinaz K ile birleştirerek çapraz bağları tersine çevirin. Tüpü 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Sonra dört mikrolitre 6X ksilen DNA boyası ekleyin.İkinci 10 mikrolitrelik numuneye, iki mikrolitre 6X ksilen DNA boyası ekleyerek çapraz bağları koruyun. Her iki numuneyi de 140 voltta %1.5'lik bir agaroz jel üzerinde yaklaşık 30 ila 45 dakika, ikincisindeki bromofenol boyası jelin dörtte üçü kadar olana kadar çalıştırın. Sonikasyon başarılı olduysa, sonikasyonlu lizatları 150 mikrolitre% 10 Triton X-100 içeren iki mililitrelik tüplere aktarın ve karıştırmak için girdap yapın.Sonikasyonlu lizatları 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 20.000 kez g'de döndürerek çözünmeyen kromatini ve döküntüleri peletleyin. Ardından süpernatanları yeni iki mililitrelik tüplere aktarın. Numuneleri süresiz olarak eksi 80 santigrat derecede saklayın.Her kromatin immünopresipitasyonu veya ChIP reaksiyonu için, 1.5 mililitre sonikasyonlu ekstraktları 1.5 mililitrelik tüplerde antikor boncuk konjugatları ile birleştirin. Tüpleri bir mini tüp döndürücü üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede dokuz hızda inkübe edin. Numunelerin sızmadığından ve düzgün şekilde karıştığından emin olmak için birkaç dakika sonra kontrol edin.Ertesi gün, sıvıyı kapaklarda toplamak için tüpleri çok kısa bir süre aşağı döndürün ve tüpleri bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Sonra özü aspire edin. Her tüpe 0.75 mililitre RIPA tamponu ekleyin.Ardından tüpleri manyetik raftan çıkarın ve karıştırmak için birkaç kez ters çevirin. Kısa bir döndürmeden sonra, tüpleri mıknatısın üzerine geri yerleştirin ve süpernatanı aspire edin. Son yıkamayı takiben, her tüpe 0.75 mililitre 10 milimolar Tris HCL ekleyin.Tüpleri manyetik raftan çıkarın ve karıştırmak için numuneleri birkaç kez ters çevirin. Kısa bir döndürmeden sonra, tüpleri tekrar rafa yerleştirin ve süpernatanı aspire edin. Metin protokolüne göre parlatma ve detaylandırma reaksiyonlarını gerçekleştirdikten sonra, ligasyon ana karışımı hesaplamalarını doldurun.Daha sonra ligasyon karışımını buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpte yapın ve çözeltiyi karıştırmak için pipetleyin. Numune tüpleri manyetik raftayken, numune reçinelerinin her birine 48 mikrolitre P7 ligasyon ana karışımı ve iki mikrolitre farklı bir adaptör indeksi ekleyin. Numuneleri bir ThermoMixer'da iki saat boyunca 25 santigrat derecede üç kez g inkübe edin.Numuneleri yıkadıktan ve metin protokolüne göre Phy 29 nick onarımı ve kinaz reaksiyonlarını gerçekleştirdikten sonra, lambda eksonükleaz ana karışım hesaplamalarını doldurun ve lambda eksonükleaz karışımını buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpte yapın. Hala manyetik raftayken her bir numune reçinesine 50 mikrolitre lambda eksonükleaz karışımı ekleyin. Daha sonra numuneleri bir ThermoMixer'da 37 santigrat derecede üç kez g sıcaklıkta 30 dakika inkübe edin.Metin protokolünde anlatıldığı gibi son yıkamayı aspire ettikten sonra, RecJf ana karışım hesaplamalarını doldurarak ve RecJf karışımını buz üzerinde yaparak RecJf nükleaz reaksiyonunu gerçekleştirin. Manyetik raftaki her bir numune reçinesine 50 mikrolitre RecJf karışımı ekleyin. Daha sonra numuneleri bir ThermoMixer'da 37 santigrat derecede üç kez g sıcaklıkta 30 dakika inkübe edin.Son yıkamayı aspire ettikten sonra, ChIP elüsyon tamponu ve proteinaz K ana karışımını hazırlayın ve her bir numune reçinesine 200 mikrolitre çözelti ekleyin. Yoğuşmayı önlemek için numuneleri bir ThermoMixer'da 65 santigrat derecede üç kez g olacak şekilde ısıtılmış bir kapakla gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, numuneleri kısa bir süre döndürün ve tüpleri bir dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin.Daha sonra 200 mikrolitre süpernatanı, 200 mikrolitre TE tamponu içeren 1.5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. DNA ekstraksiyonu, P7 primer ekstansiyonu ve ATL reaksiyonlarını takiben, P5 adaptör ligasyon tablosu ana karışım hesaplamalarını doldurun ve ligasyon ana karışımını buz üzerinde yapın. Her numuneye 20 mikrolitre ligasyon karışımı ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin.Daha sonra numuneleri iki saat boyunca 25 santigrat derecede bir termal döngüleyicide inkübe edin. Metin protokolüne göre DNA saflaştırma ve miktar tayini gerçekleştirin. Burada gösterildiği gibi, 100 ila 500 baz çifti arasında DNA parçaları veren yüksek kaliteli kromatin özleri elde etmek için sonikasyon koşullarını optimize etmek için zaman harcamaya değer.Ve elektroforetik hareketlilik kayma testi, sonikasyonlu ekstraktların, DNA fragmanlarının süper bir kayması olarak belirgin olan bozulmamış protein DNA çapraz bağları içerdiğini doğrulamak için kullanılır. Arka plan sinyalini değerlendirmek için, reaksiyonda antikor olmadan rutin olarak sahte bir ChIP gerçekleştirilir. Yüksek kaliteli bir ChIP ekzo-kütüphanesi, bir ChIP-seq kütüphanesi hazırlığına kıyasla sahte örnekte çok az arka plan sağlayacaktır.Burada bir ChIP-exo kütüphanesinin biyoanalizör değerlendirmesi gösterilmektedir. Analiz, kitaplık boyutu dağılımını doğru bir şekilde sağlar ve 125 baz çiftinde çalışan kirletici adaptör dimerlerini tespit eder. Bu panel, çoğalan K562 hücrelerinde insan RPS12 geninde polimeraz II, TFIIB ve TBP için iplikle ayrılmış ChIP-exo etiketi beş asal N'nin düzgün dağılımını göstermektedir.Bu şekilde, protein kodlayan genlerin transkripsiyonel başlangıç bölgelerine göre ortalama ChIP-exo modelleri gösterilmiştir. Kompozit grafikteki TBP, TFIIB ve polimeraz II için ana tepe konumları, insan transkripsiyon başlatma komplekslerinin genomik organizasyonunu yansıtır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa dört gün içinde yapılabilir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, gen düzenleme alanındaki araştırmacıların mayadaki asimetrideki alt nükleer yapının moleküler ayrıntılarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu prosedürü takiben, belirli bir faktörün yakındaki bir genin ekspresyonunu etkileyip etkilemediği gibi soruları ele almak için RNase arama ekspresyon profili oluşturma gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, tüm enzimatik adımlar için ana karışım tablolarını dikkatlice doldurmayı unutmamak önemlidir.Unutmayın, kanserojenler ve diğer yakıcı maddelerle çalışmak son derece tehlikeli olabilir ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemler alınmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek kaliteli bir ChIP-exo kütüphanesinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.

the-chip-exo-method-identifying-protein-dna-interactions-with-near

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi için kullanılan bir...

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

Bu videoda, proteine bağlı kromatin fragmanlarının seçici immünopresipitasyonu yoluyla oligodendrosit öncü hücrelerinin genomik DNA'sının belirli bölgelerindeki protein bağlanma bölgelerini tanımlamak için kromatin immünopresipitasyon tekniğini gösteriyoruz. Bu yöntem, gen regülasyonunda yer alan transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere çeşitli düzenleyici proteinlerin etkileşimini incelemeye yardımcı olur.

Genomik DNA Üzerindeki Hedef Protein Bağlanma Bölgelerini Belirlemek için Kromatin İmmünopresipitasyonu

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Bu video makalede, iki bileşenli bir sistem yanıt düzenleyici gen hedef ve birleştirme bölgelerini belirlemek için bir in vitro mikro-dizi göre bir yöntem açıklanır.

Bakteriyel için iki bileşenli Düzenleme Sistemleri Gen Hedefler belirlemek için DNA afinite-saflaştırılmış Chip (DAP-chip) Yöntem

Tuz çıkarımı sıralı bağlı Kromatin proteinleri büyük protein kompleksleri bağlama özelliklerini belirlemek için yararlı bir araçtır. Bu yöntem tek tek alt birimleri veya etki alanlarında bulunan genel benzeşme Kromatin toplu olarak karmaşık bir proteinin rolü değerlendirmek için istihdam edilebilir.

Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genom genelinde protein bağlayıcı yerlerin kesin olarak belirlenmesi gen düzenlemesini anlamak için önemlidir. Burada kromatin-immünprecipitated DNA'yı exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ve ardından yüksek verimli dizilim ile tedavi eden bir genomik haritalama yöntemini açıklıyoruz. Bu yöntem, memeli nöronlarında yakın baz çifti haritalama çözünürlüğü ve yüksek sinyal-gürültü oranı ile protein-DNA etkileşimlerini tespit eder.

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

Bu makalede immünostaining ve kromatin immünödeksiasyonunun temel adımları tanıtılmaktadır. Bu protokoller genellikle DNA hasarına bağlı hücresel süreçleri incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

ATP'ye bağımlı kromatin remodeler'in DNA ligand ile etkileşimi CD spektroskopisi kullanılarak açıklanmaktadır. Üretilen zirveler tarafından analiz edilen bir gen promotöründeki indüklenen konformasyon değişiklikleri transkripsiyonal regülasyon mekanizmasını anlamak için kullanılabilir.

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

CUT&amp;RUN ve varyantları, kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu protokol, tek hücreli uliCUT&amp;RUN kullanarak kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun nasıl belirleneceğini açıklar.

Hedefler Altında Ultra Düşük Giriş Bölünmesi ve Nükleaz Kullanarak Salınım Kullanılarak Kromatin Üzerinde Tek Hücreli Faktör Lokalizasyonu

Doğrudan LNCRNA-protein etkileşimlerini tanımlamak için UV tabanlı bir ChIRP yöntemi.

Kültürlenmiş Hücrelerden Fare Testisine Doğrudan Etkileşime Giren Proteinlerin Doğrulanabilir Tanımlanması İçin UV Tabanlı ChIRP Yöntemi

Öğrenin ChIP-exo yöntemiyle protein-DNA etkileşimlerini baz çifti hassasiyetinde haritalamayı. Bu teknik, gen düzenlemesi ve epigenetik araştırmalarında düşük arka plan gürültüsüyle kesin sonuçlar sağlar.

ChIP-ekzo Yöntem: Base Çifti Hassas Protein-DNA Etkileşimleri belirlenmesi

Daha fazla video keşfet