Name: Transforme İnsan Fibroblastlar gelen Proliferatif Tetraploid Hücreleri kurulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Öğrenin, insan fibroblastlarından diploid popülasyon içermeyen proliferatif tetraploid hücrelerin nasıl üretileceğini. Demecolcine ve shake-off yöntemiyle kromozomal instabilite ve erken karsinojeniz araştırmaları yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik yardım için Bayan Matsumoto'ya teşekkür ederiz.

1. Hücre Kültürü <ol><li> Tetraploidi ikna etmek için hücre elde. Bugüne kadar tekniğin insan fibroblast hücre hatları TIG 1, BJ, IMR-90 ve telomeraz-ölümsüzleştirdi TIG-1 (TIG-HT) uygulanabilir olduğu teyit edilmiştir. </li><li> α değiştirme veya% 10 (h / h)% 5, inkübasyon yolu ile ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) (V / ile takviye incelenecek hücre tipi için uygun herhangi bir başka hücre kültür ortamı ile minimum temel ortam içinde hücreler büyümek h) CO, 37 ° C&#39;de 2 atmosfer. Passage hücreleri SUBCONFLUENT yoğunluğunu aşmak için her 3 ya da 4 gün değil. NOT: Nüfus katlama seviyesi (PDL) hücre büyümesini ve hücre yaşı değerlendirmek için Pasajlanması her zaman hesaplanmalıdır. PDL bir tabak (N1) ve aşağıdaki formül (X Başlangıç ​​PDL olan) kullanılarak aşağıdaki pasaj (N2) hasat hücre sayısı tohumlanmış hücre sayısı hesaplanabilir. PDL = X + (N1 log - N2 log) / 2 log </li></ol> 2. İndüksiyon ve EstaDiploid fibroblastlardan Tetraploid Hücrelerin blishment <ol><li> shake-off olmadan tetraploidi neden olur. NOT: Bazı hücre suşları (örn TIG 1) aşağıdaki gibi demekolsin (DC) ile neredeyse tamamen tetraploid sürekli tedavi ile olabilir. <ol><li> İşlemden önceki gün, bir ya da iki 100 mm çanağı içine Geçiş hücreleri tetraploidi uyarılması için. Genellikle, tetraploid hücrelerin uyarılması için tabak başına 5 x 10 5 6 10 x 1 hücreleri hazırlamak. </li><li> 4 gün boyunca 0.1 mg / ml DC ihtiva eden ortam ile üslü olarak büyüyen hücre tedavi edin. </li><li> Ilaç barındırmayan ortam ile orta DC ihtiva takın ve 37 ° C&#39;de (h / h) CO2 atmosferinde% 5 hücreleri inkübe edin. Hücreler genellikle 1 hafta içinde çoğalmasını devam. </li></ol></li><li> shake-off ile tetraploidi neden olur. Not: çoğu hücre DC ile işlenerek bir sonucu olarak, diploid ve tetraploid popülasyonlarının bir karışımı, yukarıda (2.1) &#39;de tarif olur. p Bu nedenle, bazı modifikasyonlarrocedure (Şekil 1) şu şekilde diploid popülasyon gerekli ortadan kaldırmak için. <ol><li> Birkaç T75 içine Passage hücreleri Tetraploidi ikna etmek için tedaviden önce bir gün şişeleri. Genellikle, tetraploid hücrelerin uyarılması için en az 5 x 10 6 hücre (kap başına 1 x 10 6 hücre) hazırlar. </li><li> mitoz hücreleri yakalama 18 saat - 16 0.1 ug / mL DC ihtiva eden ortam ile üslü olarak büyüyen hücre tedavi edin. mitozda hücre durdurmak için gerekli zaman hedef hücreler üzerinde bağlı olabilir ve mümkün olduğu kadar çok mitotik hücreleri elde etmek için ön deneyler ile tespit edilmelidir. Örneğin, daha yavaş büyüyen hücreler daha hızlı büyüyen hücreler daha uzun bir süre için DC ile muamele edilmelidir. NOT: Hücreler çok uzun bu adımda tedavisi, bunlar mitotik kaymayı tabi olabilir ve imkansız bir sonraki adımda shake-off mitotik hücreleri toplamak için yapım, çanak yüzeyine yapışır. </li><li> wh, titreme-off yöntemi ile DC-tutuklandı mitotik hücreler toplayınIch gevşek yapışmış mitotik hücre ardından santrifüj şişeleri ve ortam ile yıkama hafifçe çalkalanarak (300 xg 5 dakika) ile toplanır. Bu adımda, uygun bir yöntem ile, hücre sayısı. </li><li> 60 mm kültür çanakları içine alınır mitotik hücre kalkarlar ve bir 3 gün daha 0.1 ug / ml DC hücreleri tedavi. Hücrelerin en az% 10 bu tedavi hayatta için, çanak başına en fazla 1 x 10 6 mitotik hücre tohumu. </li><li> ilaçsız ortamla orta içeren-DC değiştirin ve hücreler genellikle 1 hafta içinde meydana çoğalmasını, devam etmek için bekleyin. </li></ol></li><li> Benzer orijinal diploid hücrelere geçmesine hücreleri. </li></ol> DNA ploidisi 3. incelenmesi NOT: Bu iyi kurulmuş bir prosedürdür ve bir teknik el kitabı ayrıntılı prosedürler ve teknik ipuçları için sevk edilmelidir. <ol><li> Hasat hücreleri (5 x 05-01 Ekim x 10 6) bir çözeltisi con inkübe hücrelerin37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca% 0.05 tripsin ve% 0.02 EDTA taining ve% 10 FBS içeren ortamda tripsin nötralize eder. </li><li> ortam içinde Santrifüj hücreleri ve santrifüj (300 xg 5 dakika), ardından fosfat tamponlu tuz 5 mL (PBS) içinde yeniden süspanse edilerek yıkayın. </li><li> Aşağıdaki iki yöntemden biri ile DNA analizi için hücreleri hazırlamak <ol><li> Sabitlenmemiş hücreleri 10 analiz etmek için bir yöntem olup Not: Bu yöntem, hücre döngüsü analizi için ticari olarak mevcut bir kit kullanılarak gerçekleştirilebilir. Hücreler prosedüründe sabit ve çekirdekler zamanla hasar olacak lekeli değildir çünkü bu yöntemle hazırlanan numuneler, derhal analiz edilmelidir. <ol><li> 250 mM sukroz ihtiva eden 40 mM sitrat tampon maddesi ile hücreleri yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 mM sukroz ihtiva eden 200 uL 40 mM sitrat tamponu içerisinde% 0.1 (h / h) Nonidet P40 ve 30 ug / ml tripsin 250 uL hücre tedavisi. </li><li> 0.5 ug / ml tripsin inh 200 mcLOda sıcaklığında 10 dakika boyunca ibitor 250 mM sukroz ihtiva eden 40 mM sitrat tampon maddesi içinde 0.1 ug / ml RNase A ve inkübe hücreleri. </li><li> 0.4 mg, 200 uL ekleyin / 250 mM sukroz ihtiva eden 40 mM sitrat tamponu içerisinde ml propidium iodide (PI) ve hücre çekirdekleri leke, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücreler inkübe edin. </li></ol></li><li> Sabit hücreleri analiz etmek için bir yöntem olup <ol><li> hücre süspansiyonu karıştırarak 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bırakılarak% 100 EtOH damla damla 4 mL ekleme 1 mL PBS içinde süspansiyona% 80 etanol ile hücreleri saptamak. Bu sabitleyici hücreler birkaç hafta -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> 5 ml PBS bunları yeniden süspanse hücreleri yıkanır, santrifüj (300 xg 5 dakika) eklenir. 0.5 mg / ml RNase A hücreleri tedavi ve 50 ug / ml propidyum iyodid (PI) (0.5 mg / ml RNase A 475 uL ve 1 mg 25 ul / ml PI), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ile boyanır. </li></ol></li></ol></li><li> t DNA içeriğini analizo bir 488 nm lazer ve kırmızı kanal emisyon filtresi ile debi sitometresinde hücreleri (uzun&gt; 610 nm pass). hedef hücrelerin ploidisi değerlendirmek için, aynı zamanda, gerçek diploid hücrelerinden hazırlanan referans bir örnek analiz edin. <ol><li> Seçenek olarak ise, diploid hücrelerin genel boncuk floresans yoğunluğu oranını değerlendirmek için floresan standart boncuk ekleyin. Sitometresi tek tetraploid hücreler ve diploid hücrelerin 11 kümeleri arasında ayrım yapmak akış seçeneği &#39;darbe genişliği vs darbe yüksekliği&#39; kullanın. </li></ol></li></ol> Kromozom sayar ve Karyotip Analizi 4. Sınav NOT: Bunlar köklü prosedürler ve teknik manuel veya üreticinin protokolleri ayrıntılı prosedürler ve teknik ipuçları için sevk edilmelidir. <ol><li> metafaz hücreleri yakalama 4 saat 0.1 ug / mL DC büyüyen hücreler tedavi edin. </li><li> kromozom slaytlar hazırlayın. <ol><li&gt; tripsinizasyon ile Hasat hücreleri (en az 5 x 10 5 hücre) ve FBS içeren ortamda askıya. </li><li> ortam içinde Santrifüj hücreleri (300 xg 5 dakika) ve 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de hipotonik bir solüsyon (0.075 M KCI 5 mL) ile muamele. </li><li> Düzeltmek ve Carnoy sabitleştirici hücrelerin süspansiyonu (metanol: asetik asit = 3: 1). </li><li> Hücre süspansiyonu - (35 uL 25), küçük bir hacim bırakarak bir cam slayt üzerine hücreleri yayıldı. Böyle sıcak buhara maruz kalma gibi ek adımlar yayılan kromozom iyileştirmek için gerekli olabilir. </li></ol></li><li> In situ hibridizasyon kromozom sayıları veya karyotip analizi ya da çok renkli floresan leke hücreleri (mFISH). <ol><li> Kromozom sayıları. <ol><li> 20 dakika -% 5 Giemsa çözeltisi (veya floresan mikroskopi için 0.5 mg / ml RNase A ihtiva eden 5 ug / ml PI) 15 ile leke hücreleri. </li><li> Dijital en az 50 metafaz hücrelerinin fotoğraf. </li><li> Bir görüntü analizi softwa kullanarak hücre başına kromozom sayısını sayındokunup bir fotoğraf düzenleme yazılımı kullanarak kromozom örtüşen manuel ayrılmasından sonra yeniden. kromozom sayısı el atılır de, bilgisayar puanlama önerilir. </li></ol></li><li> karyotip analizi NOT: Bu analiz eğitimli bir teknisyen ya da profesyonel bir şirket tarafından yapılmalıdır. <ol><li> Standart G-bantlama tekniği 12&#39;ye göre Leke hücreleri. </li><li> Standart karyograms 12 yapmak için kromozom analiz edin. </li></ol></li><li> mFISH NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve gerekirse yapılmalıdır. <ol><li> Üreticinin protokolüne 13&#39;e göre insan kromozomları için çok renkli FISH probları kullanılarak leke hücreleri. </li><li> Uygun filtreler ile bir floresan mikroskobu ve mFISH analizi 13 için bir yazılım kullanılarak kromozom analiz edin. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Rabinovitch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+progression+in+Barrett%27s+esophagus+III%3A+baseline+flow+cytometric+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables.</a> Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).</li>
<li>Galipeau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSAIDs+modulate+CDKN2A%2C+TP53%2C+and+DNA+content+risk+for+progression+to+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma.</a> PLoS Med. 4 (2), e67(2007).</li>
<li>Olaharski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploidy+and+chromosomal+instability+are+early+events+during+cervical+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-independent+abrogation+of+a+postmitotic+checkpoint+contributes+to+human+papillomavirus+E6-induced+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy.</a> Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).</li>
<li>Davoli, T., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+causes+and+consequences+of+polyploidy+in+normal+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).</li>
<li>Fox, D., Duronio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoreplication+and+polyploidy%3A+insights+into+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease.</a> Development. 140, 3-12 (2013).</li>
<li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+failure+generating+tetraploids+promotes+tumorigenesis+in+p53-null+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells.</a> Nature. 437, 1043-1047 (2005).</li>
<li>Ganem, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+failure+triggers+hippo+tumor+suppressor+pathway+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation.</a> Cell. 158 (4), 833-848 (2014).</li>
<li>Kuznetsova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability%2C+tolerance+of+mitotic+errors+and+multidrug+resistance+are+promoted+by+tetraploidization+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells.</a> Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).</li>
<li>Vindeløv, L., Christensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+and+proteolytic+enzyme-based+techniques+for+nuclear+isolation+and+DNA+content+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis.</a> Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Juan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content+measurement+for+DNA+ploidy+and+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis.</a> Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5(2001).</li>
<li>Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+analysis+guidelines+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genet+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Chromosome analysis guidelines preliminary report.</a> Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).</li>
<li>Liehr, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+FISH+probe+sets+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Multicolor FISH probe sets and their applications.</a> Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bipolar+spindles+with+two+centrosomes+in+tetraploid+cells+established+from+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts.</a> Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+proliferative+tetraploid+cells+from+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts.</a> Front. Oncol. 3, 198(2013).</li>
<li>Ohshima, S., Seyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+proliferative+tetraploid+cells+from+telomerase-immortalized+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosome+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts.</a> Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).</li>
<li>Di Leonardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+rereplication+in+the+presence+of+mitotic+spindle+inhibitors+in+human+and+mouse+fibroblasts+lacking+either+p53+or+pRb+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function.</a> Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).</li>
<li>Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploid+state+induces+p53-dependent+arrest+of+nontransformed+mammalian+cells+in+G1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).</li>
<li>Vogel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+of+the+mitotic+spindle+assembly+checkpoint+with+p53+to+prevent+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy.</a> Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).</li>
<li>Aylon, Y., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53%3A+Guardian+of+ploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">p53: Guardian of ploidy.</a> Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).</li>
<li>Uetake, Y., Sluder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+progression+after+cleavage+failure+%3A+mammalian+somatic+cells+do+not+possess+a+%26%2334%3Btetraploidy+checkpoint%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a &#34;tetraploidy checkpoint&#34.</a> J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).</li>
<li>Ganem, N., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+the+proliferation+of+polyploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Limiting the proliferation of polyploid cells.</a> Cell. 131, 437-440 (2007).</li>
<li>Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+of+p53+for+maintaining+chromosomal+stability+during+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization.</a> Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi var olduğunu beyan ederiz.

kimyasal ajanlarla diploid hücrelerinden tetraploidi indüklenmesinde önemli bir sorun, her iki sitokinez önleyicileri ya da aks önleyicileri, hücreler çoğu zaman, diploid ve tetraploid popülasyonlarının karışımı haline ve tetraploit hücreler diploid hücrelerinden ayrılmalıdır. diploid hücrelerin ücretsiz tetraploid nüfusun izolasyonu için en yaygın yaklaşım, sınırlayıcı seyrelti yoluyla FACS ya klonlamadır. Ancak, bu işlemler zahmetli ve gerçekleştirmek kolay değildir. Bu yazıda, normal insan fibroblastlar gelen diploid...

Poliploid memeli türlerinin özel dokularda değil, aynı zamanda kanser ve dejeneratif hastalıklar gibi patolojik durumlar, çeşitli sadece gözlenmiştir. Polyploid (çoğunlukla tetraploid) hücreleri genellikle serviks 3,4 Barrett özofagus 1,2 veya skuamöz intraepitelyal lezyonlar gibi insan dokularının preneoplastik lezyonlar gözlenir ve bu dokularda 5 malign anöploidi hücrelerin kaynağı olarak kabul edilmiştir 6. o Anöploid hücrelere tetraploid dönüşüm tümörigenezinin erken evrelerinde çok önemli bir olay olabileceğini öne olmasına rağmen, bu süreçte yer alan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu dönüştürülmemiş polyploid insan hücreleri yaymak nerede hiçbir in vitro model mevcut olmuştur kısmen çünkü. Bazı araştırmacılar inh ile binükleer hücrelerin üretilmesi dönüştürülmemiş insan epitel hücrelerinde tetraploidi indüklenensitokinezi 7-9 ibiting. Bu yöntemde, bununla birlikte gereksiz diploit hücreleri 7,8 floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) ile elimine edilmelidir veya seyreltme 9 sınırlandırılmasıyla klonlama. Bu işlemler gerçekleştirmek için kolay zahmetli ve olmadığından, basit yöntemler dönüştürülmemiş tetraploid hücreler bu alanda araştırma için istenen kurmak. Bu raporda, biz nispeten basit prosedürlerle normal insan fibroblast veya telomeraz-ölümsüzleştirilmiş insan fibroblastlar gelen proliferatif tetraploid hücreler kurmak için bir protokol açıklar. prosedürler ayrıca DC ile tedavi edilir kapalı sallayarak tarafından toplanan mitoz diploid hücreleri ve mitotik hücrelerin tutuklama mili zehir demekolsin (DC) kullanın. uzun süreli DC ile tedavi diploid mitotik hücreler tetraploid G1 hücrelere dönüştürmek ve bu hücreler ilaç çıkarılmasını takiben birkaç gün süreyle büyüme tutuklanmasının ardından da tetraploid hücreler çoğalırlar. Bu protokol sağlarkromozom istikrarsızlık ve poliploid insan hücrelerinin onkojenik potansiyeli arasındaki ilişkiyi incelemek için yararlı bir model oluşturmak için etkili bir yöntem.

<table><tbody><tr><td>MEM-&alfa;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Demecolcine çözeltisi (10 & mu; HBSS'de g/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1925-10ML</td><td></td></tr><tr><td>BD DöngüsüTES Plus DNA Reaktif Kitleri</td><td>BD Biosciences</td><td>#340242</td><td>DNA ploidisinin akış sitometrisi ile incelenmesi için</td></tr><tr><td>İnsan kromozomu çok renkli FISH probu 24XCyte</td><td>MetaSystems</td><td>#D-0125-060-DI</td><td>mFISH analizi için özel filtre seti ve yazılım gereklidir</td></tr><tr><td>mFISH ile Isis görüntüleme sistemi&nbsp; yazılımı&nbsp;</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>Özel prob kiti gereklidir</td></tr></tbody></table>

transforme İnsan fibroblastlar gelen proliferatif tetraploid hücreleri kurulması

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Poliploid (çoğunlukla tetraploid) hücreler sıklıkla insan dokularının preneoplastik lezyonlarında görülür ve kromozomal instabilitelerinin bu tür dokularda karsinogenezden sorumlu olduğu düşünülmektedir. Proliferatif poliploid hücreler, poliploid hücrelerin kromozomal instabilitesini analiz etmek için gerekli olsa da, transforme olmamış insan hücrelerinden bu tür hücreler oluşturmak oldukça zordur. Tetraploidinin kimyasal ajanlar tarafından indüklenmesi genellikle diploid ve tetraploid popülasyonlarının bir karışımı ile sonuçlanır ve çoğu çalışma, tetraploidi diploid hücrelerden ayırmak için seyreltmeyi sınırlayarak floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya klonlaması kullanmıştır. Ancak bu işlemler zaman alıcı ve zahmetlidir. Bu rapor, diploid hücreler tarafından minimum kontaminasyon ile normal insan fibroblastlarından proliferatif tetraploid hücreleri indüklemek için nispeten basit bir protokolü açıklamaktadır. Kısaca protokol şu adımlardan oluşur: mitozda hücrelerin demecolcine (DC) ile durdurulması, mitotik hücrelerin silkelendikten sonra toplanması, toplanan hücrelerin DC ile 3 gün daha inkübe edilmesi ve hücrelerin ilaçsız ortamda inkübe edilmesi (Birkaç gün içinde tetraploid hücreler olarak çoğalmaya devam ederler). Hücre tipine bağlı olarak, mitotik hücrelerin çalkalanarak toplanması ihmal edilebilir. Bu protokol, normal insan fibroblastlarından proliferatif tetraploid hücreler oluşturmak için basit ve uygulanabilir bir yöntem sağlar. Bu yöntemle kurulan tetraploid hücreler, kromozom kararsızlığını ve poliploid insan hücrelerinin onkojenik potansiyelini incelemek için yararlı bir model olabilir.

Deneyimlerimize göre, TIG-1 hücreleri, 4 gün boyunca 0.1 mg / ml DC (Şekil 2A) ile birlikte basit sürekli işlenerek hemen hemen tamamen tetraploid yapılabilir. Buna karşılık, BJ ve IMR-90 ve TIG-HT hücreleri gibi diğer fibroblast suşlar, çalkalama kapatma yöntemiyle diploid aynı tedavi sonrası tetraploid popülasyonları ve mitotik hücrelerin izolasyonu bir karışımı olmuştur sırasında gerekli olan (- tedavinin başlamasından sonra 18 saat, genellikle 16) (Şekil 2B, ...

Poliploid hücrelerin kromozomal kararsızlığını analiz etmek için proliferatif poliploid hücreler gerekli olsa da, transforme olmamış insan hücrelerinden bu tür hücreler oluşturmak kolay değildir. Bu rapor, normal insan fibroblastlarından diploid popülasyondan arınmış proliferatif tetraploid hücreler oluşturmak için nispeten basit prosedürleri tanımlamaktadır.

Transforme İnsan Fibroblastlar gelen Proliferatif Tetraploid Hücreleri kurulması

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Bu prosedürün genel amacı, normal insan fibroblastlarından diploid popülasyondan arınmış proliferatif tetraploid hücreler oluşturmaktır. Bu yöntem, anöploid hücrelerin karsinogenezin erken evrelerinde nasıl geliştiği gibi karsinogenez araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, diploid popülasyondan arınmış proliferatif tetraploid hücrelerin nispeten basit prosedürlerle oluşturulabilmesidir.Bazı suşlar, iğ zehiri olan demecolcin ile basit bir muamele ile tamamen tetraploid hale gelirken, çoğunun, bir diploid popülasyonu taklit etmek için bu tedavi sırasında silkeleme yöntemiyle ele alınması gerekir. Silkeleme yöntemi olmadan tetraploidi indüksiyonuna başlamak için, 100 milimetrelik bir tabağa 1/5 kültürlenmiş hücrelere yaklaşık beş kez 10 kez geçirin. Çanağı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit atmosferinde inkübe edin.Bundan sonra, katlanarak büyüyen hücreleri mililitre DC başına 0.1 mikrogram içeren ortamla tedavi edin.Dört gün boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit atmosferinde inkübe edin. Ardından DC içeren ortamı ilaçsız ortamla değiştirin. Proliferasyon devam edene kadar 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin.Silkeleme yöntemini kullanarak tetraploidi indüklemek için, kültürlenmiş hücreleri T-75 şişelerine geçirin ve her bir şişenin en az bir kez 10 ila 1/6 hücre içerdiğinden emin olun. Şişeleri 24 saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit atmosferinde inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri, metin protokolünde belirtildiği gibi mitozda durdurmak için 16 ila 18 saat boyunca DC içeren ortamla tedavi edin.İnkübasyondan sonra, ters faz kontrast mikroskobu altında bir şişedeki hücreleri kontrol edin. Ardından, gevşek bir şekilde yapışmış mitotik hücrelerin toplanmasına başlamak için her bir şişeyi hafifçe sallayın. Pipet ucuyla şişenin yüzeyine şiddetli sallama veya dokunma gibi dikkatsiz işlemlerden kaçınılmalıdır.Mitotik hücreleri yapışık arayüz hücreleri ile kontamine etmeyin. Şişeleri ılık ortamla nazikçe yıkayın ve hücreleri santrifüj tüplerine aktarın. Hücre numarasını saymak için bir atomik hücre sayacı kullanın.Hücre sayımından sonra, beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Toplanan mitotik hücreleri 16 milimetrelik kültür kaplarına yeniden tohumlayın. Daha sonra kaplanmış hücreleri mililitre DC başına 0.1 mikrogram içeren ortamla tedavi edin.Üç gün boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin.Bundan sonra, DC içeren ortamı ilaçsız ortamla değiştirin. Çoğalma devam edene kadar 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit atmosferinde inkübe edin. DNA ploidisinin analizi için hücreleri PBS ile yıkayın.Daha sonra hücrelere %0.05 tripsin ve %0.02 EDTA içeren bir çözelti ekleyin. 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Bundan sonra, hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın.Ve% 10 fetal sığır serumu içeren ortam ekleyerek tripsini nötralize edin. Hücreleri beş dakika boyunca 300 kez g'de ortamda santrifüjleyin. Hücreleri beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.Daha sonra beş dakika boyunca 300 kez g'de tekrar santrifüjleyin. Ardından, hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Karıştırarak damla damla dört mililitre %100 etanol ekleyin.Hücreleri sabitlemek için süspansiyonu oda sıcaklığında 30 dakika dinlendirin. Bundan sonra, hücreleri fiksatif çözelti içinde beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Ve hücreleri beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.Süspansiyonu beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra hücrelere mililitre RNA çözeltisi başına 475 mikrolitre 0.5 miligram muamele edin. Hücreleri lekelemek için mililitre propidyum iyot çözeltisi başına 25 mikrolitre bir miligram ekleyin.Ve sonra karıştırın. Süspansiyonun oda sıcaklığında 30 dakika dinlenmesine izin verin. Ardından, hücrelerin DNA içeriğini analiz etmek için 488 nanometre lazerli ve kırmızı kanal emisyon filtreli bir akış sitometresi kullanın.Hedef hücrelerin ploidisini değerlendirmek için gerçek diploid hücrelerden hazırlanan bir referans örneğini de analiz edin. Başlamak için, metafazdaki hücreleri durdurmak için dört saat boyunca mililitre DC başına 0.1 mikrogram içeren ortamlarla katlanarak büyüyen hücreleri tedavi edin. Bundan sonra, tripsinizasyon ile 1/5 hücreye en az beş kez 10 ila 1/5 hasat edin.Hasat edilen hücreleri FBS içeren ortamda askıya alın. Süspansiyonu beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra beş mililitre 0.075 molar potasyum klorür çözeltisi ekleyin.37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, süspansiyonu beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Hücreleri beş mililitre Carnoy fiksatifinde yeniden süspanse edin.Ve sonra süspansiyonu beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı aspire edin ve hücreleri 0.5 mililitre Carnoy fiksatifinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunun 30 mikrolitresini bir cam slayt üzerine bırakın.Son olarak, hücreleri kromozom sayımları veya karyotip analizi yoluyla boyayın ve analiz edin. Bu çalışmada, diploid popülasyondan arındırılmış proliferatif tetraploid hücreler, normal insan fibroblastlarından kültürlenmiştir. Bazı hücre suşları, DC ile sürekli tedavi ile tamamen tetraploid hale gelebilse de, çoğu hücrenin, bir diploid popülasyonunu ortadan kaldırmak için DC tedavisi sırasında silkeleme yöntemiyle tedavi edilmesi gerekir.Üç fibroblast suşunda tetraploidi indüksiyonu için temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. TIG-1 suşu, DC ile basit sürekli tedavi yoluyla neredeyse tamamen tetraploid hale gelir.Bununla birlikte, bu muamele BJ ve TIG-hT suşlarının diploid ve tetrapod popülasyonlarının bir karışımı haline gelmesine neden olur. Bu nedenle tedavi sürecinde mitotik hücrelerin silkeleme yöntemi ile izole edilmesi gereklidir.Kurulan tetraploid hücrelerde bir kromozom sayımı yapılır. Görüldüğü gibi modal kromozom sayısı hem TIG-1 hem de BJ hücreleri için 92, TIG-hT hücreleri için ise 91'dir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki hafta içinde yapılabilir.Bu prosedürü denerken, mitotik hücrelerin yapışık arayüz hücreleri tarafından kontaminasyonuna neden olmamak için, silkeleme adımında şişeleri nazikçe sallamayı unutmamak önemlidir.

establishment-proliferative-tetraploid-cells-from-nontransformed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz, insan faktörleri Oct4, Sox2, Nanog ve Lin28 lentivirüs aracılı teslim kullanarak insan somatik hücre alınan uyarılmış pluripotent kök hücreleri üretimi için protokol göstermektedir. Pluripotency morfolojisi ve embriyonik kök (ES) hücre-spesifik belirteçler varlığı teyit edilmiştir.

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

Karsinom ile ilişkili fibroblastlar (CAFs) tümör stroma içinde mevcut miyofibroblastlar zengin, tümör progresyonu sürüş önemli bir rol oynamaktadır. Biz deneysel insan meme fibroblastlar CAFs üretmek için bir coimplantation tümör xengraft modeli geliştirdi. Protokolü tumourigenesis teşvik etmek için bir yeteneği kazandırmak CAF miyofibroblastlar kurmak anlatılmaktadır.

İnsan Meme Fibroblastlar Karsinom İlişkili Fibroblastlar Deneysel Nesil (CAFs)

Biz retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan vektörler ve canlı boyama ile doğru yeniden programlanması hiPSC belirlenmesi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) Tra-içine insan somatik hücre verimli yeniden programlama için bir protokol sunmak 1-81 antikor.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Lentiviral temelli, yeniden programlanmış ve karakterize edilmiş, faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin türetilmesi ve varsayılan klinik dereceli koşullara dönüştürülmesi için bir protokol tanımlıyoruz.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

İnsan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücrelerinin sağlam türetilmesi, entegre edilmeyen Sendai virüsü (SeV) vektörü aracılığıyla dermal fibroblastların yeniden programlanması kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HiPS hücre bakımı ve klonal genişleme, rekombinant insan lamınin 521 (LN-521) matrisi ve Esansiyel E8 (E8) Ortamı ile kseno içermeyen ve kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak gerçekleştirildi.

Laminin 521 Matrisini Kullanarak İnsan Tarafından Oluşturulan Pluripotent Kök Hücrelerin Entegrasyon Serbest Türevi

Burada biz insan birincil fibroblastlar değiştirilmiş mRNA'ların programlama faktörler kodlama kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre yeniden programlamak için klinik, yüksek verimli, besleyici-Alerjik bir yöntemi açıklamak ve olgun mikroRNA-367/302 taklit eder. Ayrıca programlama verimlilik, değerlendirmek için yöntem klonal IPSC kolonileri genişletin ve pluripotency işaretin TRA-1-60 ifade onaylamak bulunmaktadır.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Bu makalede, OP9/DLL1 co-kültür sistemini kullanarak fonksiyonel tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre türetilmiş CD8αβ+ tek pozitif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

Bu protokol, insan dermal fibroblastlarında hemojenik bir programın hematopoetik kök ve döl hücreleri üretmek için gata2, GFI1B ve FOS transkripsiyon faktörlerinin zorunlu ekspresyonu ile indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir.

Transkripsiyon Faktörlerinin Zorunlu İfadesi Ile İnsan Fibroblastlarının Hemojenik Yeniden Programlanması

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Öğrenin, insan fibroblastlarından diploid popülasyon içermeyen proliferatif tetraploid hücrelerin nasıl üretileceğini. Demecolcine ve shake-off yöntemiyle kromozomal instabilite ve erken karsinojeniz araştırmaları yapın.

Transforme İnsan Fibroblastlar gelen Proliferatif Tetraploid Hücreleri kurulması

Daha fazla video keşfet