Transforme İnsan Fibroblastlar gelen Proliferatif Tetraploid Hücreleri kurulması

Bu prosedürün genel amacı, normal insan fibroblastlarından diploid popülasyondan arınmış proliferatif tetraploid hücreler oluşturmaktır. Bu yöntem, anöploid hücrelerin karsinogenezin erken evrelerinde nasıl geliştiği gibi karsinogenez araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, diploid popülasyondan arınmış proliferatif tetraploid hücrelerin nispeten basit prosedürlerle oluşturulabilmesidir.

Bazı suşlar, iğ zehiri olan demecolcin ile basit bir muamele ile tamamen tetraploid hale gelirken, çoğunun, bir diploid popülasyonu taklit etmek için bu tedavi sırasında silkeleme yöntemiyle ele alınması gerekir. Silkeleme yöntemi olmadan tetraploidi indüksiyonuna başlamak için, 100 milimetrelik bir tabağa 1/5 kültürlenmiş hücrelere yaklaşık beş kez 10 kez geçirin. Çanağı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit atmosferinde inkübe edin.

Bundan sonra, katlanarak büyüyen hücreleri mililitre DC başına 0.1 mikrogram içeren ortamla tedavi edin.Dört gün boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit atmosferinde inkübe edin. Ardından DC içeren ortamı ilaçsız ortamla değiştirin. Proliferasyon devam edene kadar 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin.

Silkeleme yöntemini kullanarak tetraploidi indüklemek için, kültürlenmiş hücreleri T-75 şişelerine geçirin ve her bir şişenin en az bir kez 10 ila 1/6 hücre içerdiğinden emin olun. Şişeleri 24 saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit atmosferinde inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri, metin protokolünde belirtildiği gibi mitozda durdurmak için 16 ila 18 saat boyunca DC içeren ortamla tedavi edin.

İnkübasyondan sonra, ters faz kontrast mikroskobu altında bir şişedeki hücreleri kontrol edin. Ardından, gevşek bir şekilde yapışmış mitotik hücrelerin toplanmasına başlamak için her bir şişeyi hafifçe sallayın. Pipet ucuyla şişenin yüzeyine şiddetli sallama veya dokunma gibi dikkatsiz işlemlerden kaçınılmalıdır.

Mitotik hücreleri yapışık arayüz hücreleri ile kontamine etmeyin. Şişeleri ılık ortamla nazikçe yıkayın ve hücreleri santrifüj tüplerine aktarın. Hücre numarasını saymak için bir atomik hücre sayacı kullanın.

Hücre sayımından sonra, beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Toplanan mitotik hücreleri 16 milimetrelik kültür kaplarına yeniden tohumlayın. Daha sonra kaplanmış hücreleri mililitre DC başına 0.1 mikrogram içeren ortamla tedavi edin.Üç gün boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin.

Bundan sonra, DC içeren ortamı ilaçsız ortamla değiştirin. Çoğalma devam edene kadar 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit atmosferinde inkübe edin. DNA ploidisinin analizi için hücreleri PBS ile yıkayın.

Daha sonra hücrelere %0.05 tripsin ve %0.02 EDTA içeren bir çözelti ekleyin. 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Bundan sonra, hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne aktarın.

Ve% 10 fetal sığır serumu içeren ortam ekleyerek tripsini nötralize edin. Hücreleri beş dakika boyunca 300 kez g'de ortamda santrifüjleyin. Hücreleri beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Daha sonra beş dakika boyunca 300 kez g'de tekrar santrifüjleyin. Ardından, hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Karıştırarak damla damla dört mililitre %100 etanol ekleyin.

Hücreleri sabitlemek için süspansiyonu oda sıcaklığında 30 dakika dinlendirin. Bundan sonra, hücreleri fiksatif çözelti içinde beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Ve hücreleri beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Süspansiyonu beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra hücrelere mililitre RNA çözeltisi başına 475 mikrolitre 0.5 miligram muamele edin. Hücreleri lekelemek için mililitre propidyum iyot çözeltisi başına 25 mikrolitre bir miligram ekleyin.

Ve sonra karıştırın. Süspansiyonun oda sıcaklığında 30 dakika dinlenmesine izin verin. Ardından, hücrelerin DNA içeriğini analiz etmek için 488 nanometre lazerli ve kırmızı kanal emisyon filtreli bir akış sitometresi kullanın.

Hedef hücrelerin ploidisini değerlendirmek için gerçek diploid hücrelerden hazırlanan bir referans örneğini de analiz edin. Başlamak için, metafazdaki hücreleri durdurmak için dört saat boyunca mililitre DC başına 0.1 mikrogram içeren ortamlarla katlanarak büyüyen hücreleri tedavi edin. Bundan sonra, tripsinizasyon ile 1/5 hücreye en az beş kez 10 ila 1/5 hasat edin.

Hasat edilen hücreleri FBS içeren ortamda askıya alın. Süspansiyonu beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra beş mililitre 0.075 molar potasyum klorür çözeltisi ekleyin.

37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, süspansiyonu beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Hücreleri beş mililitre Carnoy fiksatifinde yeniden süspanse edin.

Ve sonra süspansiyonu beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı aspire edin ve hücreleri 0.5 mililitre Carnoy fiksatifinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunun 30 mikrolitresini bir cam slayt üzerine bırakın.

Son olarak, hücreleri kromozom sayımları veya karyotip analizi yoluyla boyayın ve analiz edin. Bu çalışmada, diploid popülasyondan arındırılmış proliferatif tetraploid hücreler, normal insan fibroblastlarından kültürlenmiştir. Bazı hücre suşları, DC ile sürekli tedavi ile tamamen tetraploid hale gelebilse de, çoğu hücrenin, bir diploid popülasyonunu ortadan kaldırmak için DC tedavisi sırasında silkeleme yöntemiyle tedavi edilmesi gerekir.

Üç fibroblast suşunda tetraploidi indüksiyonu için temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. TIG-1 suşu, DC ile basit sürekli tedavi yoluyla neredeyse tamamen tetraploid hale gelir.Bununla birlikte, bu muamele BJ ve TIG-hT suşlarının diploid ve tetrapod popülasyonlarının bir karışımı haline gelmesine neden olur. Bu nedenle tedavi sürecinde mitotik hücrelerin silkeleme yöntemi ile izole edilmesi gereklidir.

Kurulan tetraploid hücrelerde bir kromozom sayımı yapılır. Görüldüğü gibi modal kromozom sayısı hem TIG-1 hem de BJ hücreleri için 92, TIG-hT hücreleri için ise 91'dir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki hafta içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, mitotik hücrelerin yapışık arayüz hücreleri tarafından kontaminasyonuna neden olmamak için, silkeleme adımında şişeleri nazikçe sallamayı unutmamak önemlidir.