Tek Karbon Nanotüp Bio-mimetik Polimerler ile Mühendislik Moleküler Tanıma

Bu prosedürün genel amacı, biyomimetik polimerler kullanılarak işlevselleştirilmiş moleküler algılama için yakın kızılötesi floresan tek duvarlı karbon nanotüpler hazırlamaktır. Bu nanosensörler, canlı dokuda zamanla çözülmüş görüntülemeyi mümkün kılabilir. Örneğin, beyindeki dopamini tespit etmek için kullanılabilirler.

Bu sensörlerin ana avantajı, dokuda daha derin görüntülemeyi sağlayan doğal yakın kızılötesi floresanlarıdır. Sentetik sensörler, doğal moleküler tanıma elemanları olmadan moleküllerin algılanmasını sağlar, bu da bu genel sensör geliştirme yöntemini özellikle küçük molekül tespiti için yararlı hale getirir. SWNT'lerin bir nükleik asit süspansiyonunu hazırlamak için, önce nükleik asitleri 0.1 molar sodyum klorür içinde mililitre başına 100 miligramlık bir konsantrasyona çözün.

Çeker ocakta, antistatik bir tabanca kullanarak tek kullanımlık spatula, mikrosantrifüj tüpleri ve SWMT stoğundaki statik elektriği çıkarın. Daha sonra, 980 mikrolitre 0.1 molar sodyum klorüre 20 mikrolitre nükleik asit çözeltisi ekleyin. Daha sonra, karışımı sonikasyondan önce elde edilen nükleik asit çözeltisine 1 miligram yıkanmış SWNT ekleyin.

Sonikasyon sırasında prob ucunun konumlandırılması çok önemlidir. Köpürme meydana gelirse, prob ucunu yeniden konumlandırın ve genliği düşürmeyi deneyin. Alternatif olarak, süspansiyon zayıf kalırsa, sonikasyon darbelerini veya banyo sonikasyonunu deneyebilirsiniz.

3 milimetre çapında bir ucu olan bir ultrasonicator kullanarak, bir buz banyosunda% 40 genlikte 10 dakika boyunca çözeltiyi sonikleştirin. DNA SWNT çözeltisini 16.100 xg'de 90 dakika boyunca iki kez santrifüjleyin. Karbon nanotüp demetleri ve agregaları içeren peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı toplayın ve saklayın.

Peletleri nanomalzemeler için uygun kurumsal tehlikeli atık prosedürlerine uygun olarak atın. Lambert-Beer yasasına uygun olarak askıya alınmış SWNT'lerin yaklaşık konsantrasyonunu ve uygun seyreltme faktörünü belirlemek için bir UV-vis spektrofotometresi kullanarak 632 nanometrede çözelti absorpsiyonunu ölçün. Amfifilik polimer süspansiyonlar için, önce tek kullanımlık spatula, mikrosantrifüj tüpleri ve SWNT stoğundan statik elektriği çıkarın.

Bir davlumbazda, beş mililitre% 2 sodyum kolat çözeltisine beş miligram SWNT ekleyin. Altı milimetre çapında bir ucu olan bir ultrasonicator kullanarak, bir buz banyosunda% 40 genlikte bir saat boyunca çözeltiyi sonikleştirin. Süpernatanı dikkatlice toplamadan önce numuneyi bir ultrasantrifüj kullanarak dört saat boyunca 150.000 xg'de santrifüjleyin.

Daha sonra, scSWNT çözeltisi içinde% 1 ağırlığında amfifilik polimeri çözün. Daha sonra, bir litre deiyonize suya veya tampona karşı 3.5 kilodaltonluk bir diyaliz membranı kullanarak polimer scSWNT çözeltisini beş gün boyunca diyalize edin. Suyu veya tamponu ikinci saatte ve dördüncü saatte değiştirin.

Asılı SWNT'lerin yaklaşık konsantrasyonunu belirlemek için bir UV-Vis spektrofotometresi kullanarak 632 nanometrede çözelti absorbansını ölçün. BSA-biotin kaplı slaytları hazırlamak için, bir mikroskop lamını ve 0,17 milimetre kapak camını deiyonize su ile temizleyin, ardından metanol, aseton ve son olarak deiyonize su durulayın. Temiz mikroskop lamı üzerine yaklaşık beş milimetre aralıklarla birkaç parça çift taraflı bant yerleştirerek kanallar oluşturun.

Uzun bir cam kapak kılıfı alıp çift taraflı bandın üstüne bastırarak kanalları kapatın. Kapak sürgüsünün ve sürgünün kenarları aynı hizada olmayacak şekilde mikroskop lamı üzerinde ortaladığınızdan emin olun. Daha sonra, 900 mikrolitre 1x Tris tamponuna 100 mikrolitre BSA-biotin stok çözeltisini, mililitre başına bir miligramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin.

50 mikrolitre BSA-biotin solüsyonunu, solüsyonu bir ucuna pipetleyerek ve diğer ucundaki solüsyonu bir doku kullanarak emerek kanala akıtın. Çözeltiyi beş dakika inkübe ettikten sonra, 50 mikrolitre 0.1 molar sodyum klorür ile üç ila beş yıkama yapın. Daha sonra, mililitre başına 40 mikrolitre beş miligram NAV stok çözeltisini 960 mikrolitre 1x Tris tamponuna, mililitre başına 0.2 miligramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin.

Çözeltiyi bir ucuna pipetleyerek ve diğer uçta çözeltiyi bir doku kullanarak emerek 50 mikrolitre NAV solüsyonunu kanala akıtın. Slaytı iki ila beş dakika inkübe ettikten sonra, 50 mikrolitre 0.1 molar sodyum klorür ile üç ila beş yıkama yapın. Daha sonra, askıya alınmış SWNT'lerin ve görüntüleme tamponunun stok çözeltilerini litre başına 1 ila 10 miligram konsantrasyona seyreltin.

Bu çözeltinin 50 mikrolitresini kanala akıtın ve beş dakika inkübe edin. 50 mikrolitre görüntüleme tamponu kullanarak fazla SWNT'leri nazikçe durulayın. GT15 DNA-SWNT'lerin dopamine geri dönüşümlü tepkisini ölçmek için, önce sensör kaplı kanalları floresan mikroskobu aşamasına monte edin.

100X Oil Objective ve indiyum galyum arsenit kamera kullanarak kanalları netleştirin. Daha sonra, akış kanalına fosfat tamponlu tuzlu su içinde 50 mikrolitre 100 mikromolar dopamin çözeltisi ekleyin ve floresan yoğunluğundaki değişimi kaydedin. Dopamin çözeltisini fosfat tamponlu salin kullanarak yıkayın ve tek tek SWNT sensörlerinin floresansındaki değişimi gözlemleyin.

Biyomimetik polimer SWNT'lerin analit tepkisi için kuyu plakası taramasını gerçekleştirmek için, her bir oyuğa eşit hacimlerde asılı SWNT sensörü pipetleyin. Kuyunun dibini düzgün bir şekilde kaplayacak kadar hacim kullanın. Ardından, tarama kütüphanesinden analitleri kuyu plakalarına pipetleyin.

Potansiyel kuyudan kuyuya değişimi ve uyarma yoğunluğu veya sıcaklık dalgalanmalarını hesaba katmak için her analiti üç nüsha halinde hazırlayın. Spektrometre ve indiyum galyum arsenit dizisini kullanarak emisyon spektrumlarını izlerken hedefi yükseltin. Objektifin optimal konumu, odak düzlemini yaklaşık olarak kuyudaki numune hacminin ortasına yerleştirecektir, bu da ölçülen yoğunlukta bir maksimuma karşılık gelmelidir.

Her numune kuyusu için, bir spektrum toplamak için bir ila 10 saniyelik bir pozlama kaydedin. Floresan tepkisini ölçmek için her kuyu için emisyon spektrumlarını, ek analit olmadan sadece SWNT'leri içeren bir kontrolle karşılaştırın. GT15 DNA nanotüp sensörlerinin absorbans spektrumu, farklı kiraliteye sahip iyi dağılmış karbon nanotüplere karşılık gelen çoklu tepe noktaları gösterir.

GT15 DNA nanotüp sensörlerinin yakın kızılötesi floresansı gösterilmektedir. İlginç bir şekilde, floresan yoğunluğu dopamine yanıt olarak yaklaşık iki katına çıkar. Bu şekilde, yakın kızılötesi floresan mikroskobu, bir cam kapak kaymasının yüzeyinde hareketsiz hale getirilmiş tek GT15 DNA nanotüp sensörlerini ortaya koymaktadır.

İleriye dönük olarak, sensörün in vivo kullanım için test edilmesi, örneğin analit kütüphanesinin moleküler rakipleri içerecek şekilde genişletilmesi, biyolojik olarak ilgili konsantrasyon rejiminde yanıtın doğrusallığının test edilmesi ve ayrıca tersinirliğin test edilmesi önemlidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu yaklaşım, bilinen moleküler tanıma unsurları olmayan moleküllerden farklı sentetik sensörlerden oluşan bir kütüphane oluşturmak için kullanılabilir.