Name: Picornavirüs tropizm MicroRNA tabanlı Yönetmelik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Öğrenin picornavirüs tropizmini mikroRNA yanıt elemanları ile düzenleme yöntemini. Bu teknik viral güvenliği artırır ve çeşitli mikroRNA imzalarında uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Al ve Mary Agnes McQuinn, Richard M. Schulze Vakfı ve Mayo Clinic tarafından finanse edilen burada açıklanan temsili çalışmadan bir NIH Yardım Hibesi.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

tasarım, kompozisyon ve viral genom içindeki microRNA yanıt elemanlarının yerleşimi etkinliğini ve özgüllüğünü hedef belirleyecektir. Bu duruma getirme deneme yanılma gerektirir. Bununla birlikte, rasyonel RNA yapısal analiz ve en az optimizasyonu 10, 11, 12, 13, 38, bu tekniğin uygulanması viral replikasyon ve mikroRNA imzaları AIDS eden önceki çalışmalara d...

Kısıtlı tropizm ile bir vektör mühendislik için geniş, uygulanabilir, kolay ve etkili bir yöntem geliştirilmesi güvenliğini, biyolojik anlayış ve virüslerin tedavi programını geliştirmek için önemli bir fırsat sunuyor. Çeşitli mekanizmalar Transdüksiyonel, transkripsiyonel ve translasyonel tabanlı teknikler de dahil olmak üzere viral tropizm hedef var. Bununla birlikte, bu yöntemler, hedef hücrelerde hatalı sinyal yollarını gerektiren ya da viral genoma büyük kodlama dizilerinin eklenmesine gerektirebilir bütün vektör sistemleri, genel olarak uygun değildir. Buna ek olarak, bu yöntemler, önemli ölçüde bir terapötik aktivite engelleyen ve modifiye edilmemiş sistemine bilgi sınırlayıcı virüs zayıflamasına neden olabilir. MikroRNAlar ökaryotik hücrelerde gen susmasının aracılık kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar, küçük (22-25 nükleotid) vardır. (MRNA) resulti mesajcı RNA&#39;lar tamamlayıcı hedef sekanslarını (tepki elemanı) bağlanarak MikroRNA&#39;lar işlevi<html> transkript destabilization, bozulma veya translasyonel baskıya içinde ng. MikroRNA&#39;lar normal kısmen tamamlayıcı olan yanıt elementlerine bağlanarak gen ekspresyonu, 1, 2, 3, 4, 5, küçük değişiklikler verir. Gen ekspresyonu daha belirgin değişiklikler yanıt elementi 6 tamamlayıcılık arttırarak elde edilebilir. Olgun mikroRNA binlerce hücre ve doku tipleri 7, 8, 9, çeşitli tür ve birçok sergi diferansiyel ekspresyonu çeşitli tespit edilmiştir. Bu mıkroRNA imzalar, viral genomun 10 ile mükemmel bir şekilde tamamlayan müdahale elemanları içeren virüs amplifikasyon hücreye özel sınırlama yararlanılabilir= &quot;xref&quot;&gt; 11, 12, 13. Bu mıkroRNA hedefleme tekniği genel amacı, ek zayıflatma bir vektör genom tropizmi kontrol etmektir. Viral tropizm düzenleyen bu yöntemin yardımcı başlangıçta belirli dokular 14, 15, 16, transgen ekspresyonunu sınırlamak için lentiviral vektörlerde gösterilmiştir. Bu teknik, daha sonra, 17 çoğaltma ve normal dokularda 10, 11, 12, 13, istenmeyen toksisite ortadan kaldırarak bir çok onkolitik virüs güvenlik profilleri artırmak için hem de geliştirilmiş gen terapisi için viral vektörler replike olmayan geniş bir dizi tatbik edilmiştir . Aynı zamanda, güvenli ve e oluşturmak için kullanılmıştırtk in kısım canlı zayıflatılmış aşılar gibi virüs ve aşı üretim 18, 19, 20, 21 süreçleri iyileştirmek için. Üretici sistemleri yabani-tip büyüme seviyelerini muhafaza ederken, mikroRNA hedefleme vektörünün aşılanmış ana veya hedeflenen sistemlerde zayıflama olanak sağlayabilmektedir. MikroRNA hedefleme, diğer ana 22&#39;deki iletim koruyarak bir tür (örneğin insanlarda) iletim kısıtlayarak araştırma amacıyla virüsler biyo-güvenlik geliştirmek için kullanılabilir. Son olarak, derinlemesine viral büyüme 23, 24, 25, 26 ayrıştırarak viral yaşam döngüleri ve patogenez ve bağışıklık hücre tiplerinin belirli roller analizleri için izin verebilir microRNA hedefleme. Bu teknik bir alt sunuyortüm virüs sistemleri için kolay uygulanan yöntem ve uygulanabilir hedefleme ernative. Buna ek olarak, belirli bir hücre tiplerinde farklı ifade desenleri ile olgun microRNA sürekli genişleyen koleksiyon bu tekniğin çok yönlü hale getirir. MicroRNA tabanlı hedefleme sistemi işlevini ödün vermeden virus sistemleri çeşitli etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu tekniğin en önemli sınırlamaları deneme ve hata optimizasyonu, kaçış mutasyonları için potansiyel ve endojen transkript üzerinde potansiyel hedef dışı etkileri sayılabilir. Ancak, bu sınırlamalar genellikle optimize edilmiş ve rasyonel yanıt elemanı tasarımı ile aşılabilir. Pozitif-sens RNA virüsleri nedeniyle genomunun pozitif-duyu yönünde ve tam olarak sitoplazmik replikasyon döngüsü sırasında mikroRNA makine transkript mevcudiyetine microRNA hedefleme özellikle duyarlı olma eğilimindedir. Burada bir microRNA hedefli picarnovirüsün ve experim üretmek için bir protokol açıklarental yöntemler in vitro olarak hedef etkinliğini ve özgüllüğünü doğrulamak için.

<table><tbody><tr><td>Oligonükleotidleri yeniden kodlayan</td><td>IDT</td><td>PAGE-Saflaştırılmış Ultramer</td><td>Dizisi Araştırmacı Tarafından Tasarlanan</td></tr><tr><td>Oligonükleotidler benzersiz kısıtlama bölgesini kodlayan</td><td>IDT</td><td>25nM</td><td>Dizisi Araştırmacı Tarafından Tasarlanan</td></tr><tr><td>Yüksek Kaliteli PCR Kitini Genişletin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11732641001</td><td>Diğer birçok Yüksek Kaliteli Polimeraz PCR kiti mevcuttur</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz Sistemi</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td>RNaz içermeyen</td></tr><tr><td>5 M NH4 Asetat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>MEGAclear Kiti</td></tr><tr><td>Etanol</td> <td>ile GeliyorThermoFisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-2020 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Mirus</td><td>MIR 5404</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-mRNA Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Mirus</td><td>MIR 2225</td><td></td></tr><tr><td>0.2 & m şırınga filtresi</td><td>Millipore SLGP033RS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Vidalı Kapaklı Tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sıyırıcılar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>MicroRNA, Dharmacon'u Taklit Eder</td><td></td>, <td>Çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>MTT Hücre Proliferasyon Testi</td>, <td>ATCC</td><td>30-1010K</td><td></td></tr><tr><td>, Alt Klonlama Verimliliği DH5 ve alfa; Yetkin Hücreler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>pBlueScript II Vektörler</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>Değişken (örn. 212205)Klonlama</td> <td>ve RNA transkripsiyonunu sağlamak için T7 veya T3 promotörlerine sahip farklı plazmitler ve değişken klonlama bölgeleri vardır.</td></tr></tbody></table>

picornavirüs tropizm microrna tabanlı yönetmelik

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Eşzamanlı zayıflama olmaksızın viral replikasyonun hücreye özgü kısıtlaması, aşı geliştirmeye, gen terapisine, onkolitik viroterapiye ve virüslerin biyolojik özelliklerinin anlaşılmasına fayda sağlayabilir. Viral tropizmi düzenlemek için çeşitli mekanizmalar vardır, ancak bunlar virüs sınıfına özgü olma eğilimindedir ve birçoğu virüs zayıflaması ile sonuçlanır. Ek olarak, picornavirüsler de dahil olmak üzere birçok virüs, bazı hedefleme yöntemleri için gerekli olan büyük miktarlarda yabancı genetik materyalin dahil edilmesine izin vermeyen boyut kısıtlamaları sergiler. MikroRNA'lar, haberci RNA'lardaki tamamlayıcı hedef dizileri bağlayarak, translasyonlarını önleyerek veya bozunmalarını hızlandırarak ökaryotik hücrelerde gen ekspresyonunu düzenleyen kısa, kodlamayan RNA'lardır. Farklı hücreler farklı mikroRNA imzaları sergiler ve birçok mikroRNA biyobelirteç görevi görür. Bu diferansiyel ekspresyon modelleri, spesifik mikroRNA'ları eksprese eden hücrelerde gen ekspresyonunu kısıtlamak için kullanılırken, ekspresyonu eksprese etmeyen hücrelerde ekspresyonunu korumak için kullanılabilir. Viral tropizmin düzenlenmesi ile ilgili olarak, spesifik mikroRNA'ları tamamlayıcı diziler, genellikle 3' kodlamayan bölgelerde, viral genoma dahil edilir ve bunları aynı kökenli mikroRNA'ların varlığında yok edilmek üzere hedefler, böylece viral gen ekspresyonunu ve/veya replikasyonu önler. MikroRNA hedefleme, karşılık gelen mikroRNA'ların yokluğunda virüsün gücünü değiştirmeden teorik olarak tüm viral vektörlere uygulanabilen bir tekniktir. Burada, mikroRNA hedefli bir picornavirüs üretme ve bu hedeflemenin in vitro etkinliğini ve özgüllüğünü değerlendirme ile ilişkili deneysel yöntemleri açıklıyoruz. Bu protokol, litik replikasyon döngüsüne sahip hızlı çoğalan bir virüs için tasarlanmıştır, ancak analiz edilen zaman noktalarının ve kullanılan spesifik virüs titrasyon okumalarının modifikasyonu, bu protokolün birçok farklı virüse uyarlanmasına yardımcı olacaktır.

Tablo 1, bir pikornavirüs için bir titrasyon deneyinin tipik bir sonucu temsil eder ve% 50 doku kültürü enfeksiyon dozu hesaplamak açıklamaktadır. Bu yazıda tarif edilen viral tropizm mıkroRNA dayalı bir düzenleme genel kavramının şematik bir temsili, hücre içi etkileşimler, tavlama ve plazmid sokulması için tepki elemanı oligonükleotidlerin uygun tasarımı sırasında tepki elemanı, Şekil 1 microRNA yönlenmede gösterilmiştir ve bir in vitro transk...

Burada, spesifik mikroRNA'lara tamamlayıcı dizileri viral genoma dahil ederek picornavirüs tropizmini düzenlemek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, yaşam döngülerinin uzunluğuna ve doğasına bağlı olarak yapılan değişikliklerle tüm farklı virüs sınıflarına uyarlanabilir.

Picornavirüs tropizm MicroRNA tabanlı Yönetmelik

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Aşağıdaki deneylerin genel amacı, pikornavir tropizminin mikroRNA tabanlı regülasyonunun in vitro etkinliğini ve spesifikliğini değerlendirmektir. Bu, genomlarında mikroRNA yanıt elementleri kodlayan pikornavirler hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, bu virüsler, ilgili mikroRNA'ları eksprese eden veya etmeyen hücreleri enfekte etmek için kullanılır.Ardından, hedeflemenin etkinliğini ve özgüllüğünü belirlemek için viral replikasyon kinetiğini, yayılımını ve toksisitesini değerlendirin. Bu hedefleme yöntemi, viroloji alanında virüs güvenliğini, üretimini ve kullanımını geliştirmek veya bir virüs enfeksiyonunda yer alan biyolojik süreçlerin anlaşılmasına odaklanan araştırmaları kolaylaştırmak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajları, viral genomun minimum düzeyde mühendislik gerektirmesi ve çok sayıda hücresel mikroRNA imzasının tanımlanmış olması nedeniyle oldukça çok yönlü olmasıdır.Bu prosedüre başlamak için, permisif hücreleri 96 kuyucuklu bir plakaya ve tam büyüme besiyerine ekleyin. Enfekte edilmemiş kontroller için birinci ve 12. satırlara virüs içermeyen serumsuz besiyeri ekleyin. Ardından, hücreleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.Ardından, her biri

microrna-based-regulation-of-picornavirus-tropism

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Hedef Kimliği Kütüphane miRNA hedefleri belirlemek için kullanılan klonlanmış cDNA bir plazmid tabanlı, genom koleksiyondur. Burada kullanımı ve uygulama göstermektedir.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

MicroRNA (miRNA'lar), gen ekspresyonu önemli düzenleyiciler ve çok sayıda biyolojik süreçlerin önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. MiRNA-UTR etkileşimleri daha iyi anlamak için, biz, bir roman luciferase geninin ve tahlil reaktif, LightSwitch sistemi ile eşleştirilmiş 3 UTR lusiferaz gazetecilere bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk.

3&#39;UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

Noroviruses karakterizasyonu için gastroenterit henüz moleküler tekniklerin önemli bir nedeni vardır hala nispeten yeni. Burada fare norovirüs (MNV), hücre kültürü içinde yayılır edilebilir bu cinsin tek üyesi etkin kurtarma için iki farklı ters genetik yaklaşımlar rapor.

Bulaşıcı Mürin Norovirüs Ters Genetik Aracılı Kurtarma

Kaynak: Ruiz, A. J. ve Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, kültürlenmiş epitel benzeri hücrelerde viral replikasyonu seçici olarak inhibe etmek için sentetik microRNA taklitlerinin (mimics) kullanımını göstermektedir. microRNA yönlendirmeli genom susturmanın, virüs yayılımını nasıl engelleyebileceğini ve aşağı akış enfeksiyözlük analizi yoluyla hedefleme özgüllüğünü nasıl doğrulayabileceğini vurgulamaktadır.

microRNA Mimik Aracılı Genom Susturma Yoluyla Virüs Yayılımı İnhibisyonunun Değerlendirilmesi

Burada, ilgilenilen bir transkripsiyon faktörünü hedefleyen küçük firkete (sh)RNA ile hücreleri transfekte ettikten sonra, kamuya açık verileri, hesaplama kaynaklarını ve mikroRNA dizilerinden elde edilen yüksek verimli verileri kullanarak, ilgilenilen bir transkripsiyon faktörünün mikroRNA transkriptomu üzerindeki etkisini incelemek için bir strateji öneriyoruz.

MikroRNA transcriptome bir transkripsiyon faktörü bağımlı regülasyonu açıklayan

Arızalı rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo iletim sistemi geliştirmek için yapay bir intronic küçük RNA ifade strateji kullanarak rapor. İnşaat, ambalaj ve larva enfeksiyon gelince de rAaeDV vektörlerin kantitatif analiz için detaylı bir yordam açıklanır.

Sivrisinek larva genlerin fonksiyonel analiz için bir gen teslim vektör olarak rekombinant sivrisinek Densovirus kullanın

RNA virüsü çoğaltma sırasında üretilen çift iplikçikli RNA desen tanıma reseptörleri tarafından doğuştan gelen bağışıklık yanıtının ikna etmek için kabul edilebilir. Negatif anlamda RNA virüsleri için alt düzey dsRNA ve PRRs arasındaki etkileşimi belirsizdir. Arenavirus dsRNA ve tek tek hücreleri içinde PRR görselleştirmek için confocal mikroskopi yöntemi geliştirdik.

Çift iplikçikli RNA ve desen tanıma reseptörleri negatif anlamda RNA virüsü enfeksiyonu confocal görüntüleme

Patatesteki endojen mikroRNA'ları (miRNA'lar) işlevsel olarak karakterize etmek için patates virüsü X (PVX) bazlı mikroRNA susturma (VbMS) sistemi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. İlgi çekici miRNA hedef mimik (TM) molekülleri PVX vektörüne entegre edilir ve hedef miRNA veya miRNA ailesini susturmak için patatesle geçici olarak ifade edilir.

Patates virüsü X bazlı mikroRNA Susturma (VbMS) Patateste.

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Öğrenin picornavirüs tropizmini mikroRNA yanıt elemanları ile düzenleme yöntemini. Bu teknik viral güvenliği artırır ve çeşitli mikroRNA imzalarında uygulanabilir.

Picornavirüs tropizm MicroRNA tabanlı Yönetmelik

Daha fazla video keşfet