Serum- toplanması ve Besleyici serbest Fare Embriyonik Hücre içermeyen Yaklaşım Hücre klimalı Orta Kök

Bu protokolün genel amacı, serum ve besleyici serbest kültür koşulları altında fare embriyonik kök hücrelerinden şartlandırılmış besiyerini toplamak ve bu besiyerinin biyolojik fonksiyonlarını karakterize etmektir. Bu prosedür, yaşa bağlı hastalıklar için güvenli ve hücresiz terapötik yaklaşımın geliştirilmesi için fare embriyonik kök hücrelerinden salgılanan çözünür faktörlerin yaşlanma karşıtı aktivitesi hakkında bilgi sağlar. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımda araştırma profesörü olan Dr.Yun-Ui Bae olacak.

Biyolojik güvenlik başlığında, bir fare embriyonik fibroblast veya MEF hücre kültürünü, 15 santimetrelik bir hücre kültürü kabında 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte iki saat boyunca mitomisin C ile takviye edilmiş 20 mililitre MEF ortamı ile tedavi edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve 37 santigrat derecede üç dakika boyunca üç mililitre tripsin EDTA ile ayırın. Hücreler plakanın altından kalktığında tripsini altı mililitre taze MEF ortamı ile nötralize etmek.

Hücreleri santrifüjleme ile topladıktan sonra, peleti beş mililitre MEF ortamında yeniden süspanse edin ve taze MEF ortamında 10 santimetre kültür kabı başına 10 ila altıncı inaktive edilmiş MEF'leri iki kez plakalayın. Besleyici hücreleri 24 saat boyunca kültürleyin. Daha sonra MEF ortamını fare embriyonik kök hücre ortamı ile değiştirin ve en az 48 saatlik kokültür için besleyicilere iki kez 10 ila altıncı fare embriyonik kök hücrelerini tohumlayın.

Biyolojik bir güvenlik başlığında, bir fare embriyonik kök hücresi plakasını beş mililitre PBS ile durulayın ve hücreleri az önce gösterildiği gibi tripsin artı EDTA ile ayırın. Hücreleri santrifüjleme ile topladıktan sonra, kök hücre peletini beş mililitre taze kök hücre ortamında yeniden süspanse edin ve taze embriyonik kök hücre ortamında tabak başına bir mililitre hücreyi beş jelatin kaplı hücre kültürü kabına yerleştirin. Kültürler% 80-85 birleşmeye ulaşana kadar hücreleri inkübatöre geri koyun.

Daha sonra hücreleri, 10 dakikalık üç yıkama için plaka başına en az sekiz mililitre PBS'de durulayın, ardından azaltılmış serum ortamında 24 saatlik bir inkübasyon yapın. En fazla 24 saat sonra, süpernatanı santrifüjleme için 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ardından 0,2 mikrometrelik bir şişe üstü süzgeçten süzülür.

Embriyonik kök hücre şartlandırılmış ortamın etkilerini yaşlanma ile ilişkili bir beta galaktosidaz testi ile test etmek için, insan dermal fibroblastlarını bir insan dermal fibroblast ortamında altı oyuklu bir plakada tohumlayın. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir gece inkübasyondan sonra, ortamın yarısını 72 saatlik bir kültür için taze fare embriyonik kök hücre şartlandırılmış ortamla değiştirin. Kültürün üçüncü gününde, hücreleri iki 30 saniyelik yıkama için oyuk başına iki mililitre PBS'de durulayın.

Ardından, hücreleri bir davlumbazda oda sıcaklığında beş dakika boyunca% 3.7 paraformaldehit içinde sabitleyin. Sabitledikten sonra, hücreleri iki kez gösterildiği gibi iki mililitre PBS ile yıkayın ve hücreleri karbondioksit olmadan 37 santigrat derecede 17 buçuk saat boyunca bir ila iki mililitre SA beta gal çözeltisi ile etiketleyin. Boyama süresinin sonunda, hücreleri gösterildiği gibi PBS ile iki kez yıkayın.

Ardından, oda sıcaklığında beş dakika boyunca Eosen ile lekeleyin. Başka bir PBS yıkama setinden sonra, hücreleri ışık mikroskobu ile 100 kat büyütmede görüntüleyin. Hücre döngüsü analizi için, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir gece inkübasyon için taze insan dermal fibroblast ortamında altı santimetrelik bir hücre kültürü kabında oyuk başına sekiz kez 10 ila dördüncü insan dermal fibroblastını tohumlayın.

Ertesi sabah, ortamın yarısını fare embriyonik kök hücre şartlandırılmış ortamla değiştirin ve hücreleri inkübatöre geri koyun. 24 saat sonra, hücreleri tripsin EDTA ayrışması ile hasat edin ve ardından bir mililitre PBS çözeltisinde iki yıkama yapın. İkinci yıkamadan sonra peleti 100 mikrolitre soğuk PBS solüsyonunda tekrar süspanse edin.

Daha sonra, girdap yaparken hücreleri 200 mikrolitre soğuk etanolde damla bilge uygulama ile sabitleyin. Hücreleri en az bir saat boyunca dört santigrat derecede saklayın. Ardından, taze PBS solüsyonunda yıkayın.

İkinci santrifüjlemeden sonra, peleti RNaz ile takviye edilmiş 250 mikrolitre sodyum sitrat tamponu ile 30 dakika boyunca karbondioksit olmadan 37 santigrat derecede muamele edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri 20 dakika boyunca propidyum iyodür içeren 250 mikrolitre sodyum sitrat tamponu ile etiketleyin. Ardından, akış sitometrisi ile her numunenin hücre döngüsü aşamalarını değerlendirin.

Kantitatif ters transkriptaz PCR analizi için, üreticinin protokolüne göre fare embriyonik kök hücre şartlandırılmış orta muameleli insan dermal fibroblastlarından toplam RNA'yı izole etmek için bir RNA ekstraksiyon kiti kullanın. Çıkarılan toplam RNA'yı ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Daha sonra, oligo deoksitimidin primerleri ve M-MLV ters transkriptaz içeren reaksiyon karışımını üreticinin protokolüne göre formüle edin.

Daha sonra, reaksiyon karışımını içeren PCR tüpüne toplam RNA'nın bir mikrogramını ekleyin. Son olarak, yeşil PCR ana karışımını ve uygun gen primerlerini kullanarak gerçek zamanlı bir PCR makinesi ile CDNA'nın amplifikasyonunu ölçün. Normal fare embriyonik kök hücre kültürü koşulları altında bir MEF besleyici hücre tabakası üzerinde büyütülen fare embriyonik kök hücreleri, oval bir şekil ve parlak bir görünüm sergiler.

Serum ve besleyici serbest kültür koşulları altında büyütülen fare embriyonik kök hücreleri düzleşmiş ve düzensiz bir morfoloji gösterir. Yaşlanan insan dermal fibroblastının fare embriyonik kök hücre şartlandırılmış besiyeri ile tedavisi, yaşlanma ile ilişkili betagalaktosidaz pozitif hücrelerin sayısını azaltır. Ayrıca, bu hücrelerin hücre döngüsü analizi, fare embriyonik kök hücre şartlandırılmış ortam tedavisinin, G0 / G1 fazındaki hücre sayısını azaltırken, S ve G2 / M fazlarındaki hücre sayısını önemli ölçüde artırdığını ortaya koymaktadır.

Ek olarak, fare embriyonik kök hücre şartlandırılmış besiyeri tedavisi, yaşlanma ile ilişkili genlerin ve yaşlanan fenotiple ilişkili sekreter sitokinlerinin ekspresyonunu azaltır. Bu prosedürü denerken, uzun bir inkübasyon hücre otolizi veya açlıkla apoptoz olasılığını artırdığından, serum ve besleyici serbest ortamı 24 saat sonra toplamayı unutmamak çok önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, hücresiz bir yaklaşım için serum ve besleyici serbest fare embriyonik kök hücre şartlandırılmış ortamın nasıl toplanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Paraformaldehit gibi reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu reaktifi çeker ocakta kullanmak gibi önlemlerin bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman alınması gerektiğini unutmayın.