Name: Serum- toplanması ve Besleyici serbest Fare Embriyonik Hücre içermeyen Yaklaşım Hücre klimalı Orta Kök (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Öğrenin fare embriyonik kök hücrelerinden serum ve besleyici hücre içermeyen koşullarda koşullanmış ortam toplama yöntemini. Bu hücre içermeyen yaklaşım, yaşlanma ile ilişkili hastalıklar için güvenli tedavi potansiyeli sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma Temel Bilimler Araştırma Programı (2013R1A1A2060930) ve Tıbbi Araştırma Merkezi Programı (2015R1A5A2009124) Kore Ulusal Araştırma Vakfı aracılığıyla (UÇK), Bilim, BİT Bakanlığı tarafından finanse edilen ve Gelecek Planlama tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma aynı zamanda Hastanesi Çocuk Hastalıkları (HK Sung) bir Başlangıç ​​İşletim Grant tarafından desteklenmektedir. Biz G4 Mesc hattını sağlamak için bu el yazması ve Dr. Andras Nagy düzenleme onların mükemmel yardım için Laura Barwell ve Sarah JS Kim teşekkür etmek istiyorum.

Not: serum- ve besleyici-CM toplama protokolün bir şeması, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 1. Malzemeler (MEFS Hazırlanması, Orta, Tabaklar, ve Çözümler) <ol><li> Kültür MEF&#39;ler orta 500 ml hazırlayın. % 10 FBS (ESC kalitesi), 50 birim / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin içeren Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) Supplement. </li><li> Kurulmuş bir rutin protokolü 13 aşağıdaki embriyolar MEFS ayırmak ve MEF ortamda onları korumak. </li><li> kültüre mESCs ortamının 500 ml hazırlayın. DMEM% 15 FBS ve 2 mM L-glutamin, 100 uM esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 100 uM β-mersaptoetanol, 100 birim / ml, lösemi önleyici faktörü (LİF), 50 birim / ml penisilin ve 50 ile desteklenir mg / ml streptomisin. </li><li> % 0.1 jelatin çözeltisinin 5 ml&#39;si ile 10 cm hücre kültür kaplarına kaplanarak jelatinleştirilmiş plakaları (5 jelatinleştirilmiş levhalar / 1 Mesc plaka) hazırlayın. En az 10 dakika süreyle inkübe edin<html> oda sıcaklığında. </li><li> mESCs bir serumsuz durum için azaltılmış serum ortamı 500 ml hazırlayın. sodyum bikarbonat, 1.2 g (pH 7.0) serum ortamında Azaltılmış ek. 0.2 mikron şişe üstü filtre ile filtre. </li><li> yaşlanmayla ilişkili β-galaktosidaz (SA β-gal) yaşlanmış hücrelerin saptanması için boyama çözeltisi hazırlayın: 1 mg / ml X-gal, 40 mM sitrik asit / sodyum fosfat tamponu (pH 6.0) (dimetilformamid, DMF içinde çözülmüş), , 5 mM potasyum ferrisiyanür, 5 mM potasyum ferrosiyanür, 150 mM NaCI ve 2 mM MgCl2 14. DİKKAT: (Tehlikeli) DMF toksik ve korozif bir çözümdür. Çözüm işlerken kişisel koruyucu giysiler (örneğin, nitril veya lateks eldiven, bir laboratuvar önlüğü, gözlük ve) giyin. Bir davlumbaz kullanın. </li><li> Kültür insan dermal fibroblastları (HDF&#39;ler, NHDF-Ad-Der fibroblast) orta 500 ml hazırlayın. % 10 FBS ve 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ile DMEM Supplement. </li></ol>Fare Embriyonik Kök Hücreler jove_title &quot;&gt; 2. Kültür (Şekil 1 A ve 2A) NOT: Bir hücre kültürü biyolojik güvenlik kabini tüm adımları uygulayın. <ol><li> 15 cm&#39;lik bir hücre kültür kabı mitomisin C, 10 ug / ml ihtiva eden MEF ortam 20 ml MEFS tedavi edin. 37 ° C de 2 saat ve% 5 CO2 inkübe edin. </li><li> MEF&#39;lerden orta aspire. PBS ile üç kez hücreleri yıkayın. Tripsin-EDTA (TE, 1 x) 3 ml ilave edilir ve 37 ° C de 3 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe edilir. 3 dakika sonra, 300 x g, 3 dakika boyunca MEF orta ve santrifüj 6 ml TE nötralize. </li><li> MEF ortam 5 ml içinde süspanse. tripan mavisi boyama ve hemasitometre kullanarak elde edilen hücre süspansiyonu hücre sayısını belirlemek. MEF ortam içinde 10 cm&#39;lik bir hücre kültür kabı başına 2 x 10 6 hücre yoğunluğunda Plaka etkisizleştirilmiş MEF&#39;ler (besleyici). 37 ° C&#39;de 24 saat% 5 CO2 inkübe edin. </li><li> üzerinde (besleyici kaplama sonrası Mesc orta MEF ORTA 24 saat değiştirinErtesi gün). </li><li> Mesc ortamı ile besleyici 2 x 10 6 hücre yoğunluğunda levhaya mESCs (G4 F1 hibrit ES hücre). 37 ° C&#39;de 48 saat% 5 CO2 inkübe edin. NOT: Mesc-CM anti-aging etkisi alt geçit sayısı mESCs 15-17 kullanıldığında olasılıkla güçlüdür. Biz Lunenfeld-Tanenbaum Araştırma Enstitüsü, Mount Sinai Hastanesi, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Kanada Dr. Andras Nagy bir G4 Mesc hattı satın aldı. </li><li> Bir% 70-80 alt konfluent durumda nispeten daha yüksek bir yoğunluğa ve geçiş hücreleri tutun. günlük taze Mesc orta orta değiştirin. </li></ol> 3. Serum- ve toplama besleyici içermeyen, koşullu ortam (Şekil 1B ve 2B) NOT: Bir hücre kültürü biyolojik güvenlik kabini tüm adımları uygulayın. <ol><li> 5 ml PBS ile Mesc plaka durulayın. TE (2.5 x) 1 ml ilave edilir ve 37 ° C de 3 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe edilir. 3 dakika sonra, Mesc Mediu&#39;nun 2 ml TE nötralizem ve 300 x g &#39;de 3 dakika süre ile santrifüj. </li><li> Mesc ortamı her jelatin kaplı kültür kabı (5 jelatinleştirilmiş levhalar / 1 Mesc plaka) içine Mesc orta ve plakanın 1 mi, 5 ml içinde süspanse. 37 ° C &#39;de kültür ve% 5 CO2 80-85 kadar,% konflüansa ulaşılır. </li><li> Üç yıkama, toplam yıkama başına 10 dakika için hücreler (10 cm plaka başına 8 mi) karşılamak için yeterli PBS ile mESCs yıkayın. 37 ° C&#39;de 24 saat% 5 CO2 için azaltılmış serum Ortamda inkübe edin. NOT: yıkama aşaması FBS bulaşmasını önlemek için önemlidir. Kuluçka süresi 18,19 takip etmek önemlidir. </li><li> 2,500 x g&#39;de 20 dakika boyunca 50 ml&#39;lik konik bir tüp ve santrifüj içine Mesc-CM toplayın. santrifüj sonra süpernatant solüsyonu (CM) toplayın. 0.2 mikron şişe üstü filtre ile filtre. </li></ol> Fare Embriyonik 4. Etkileri Kök Hücre klimalı Orta (Mesc-CM) Not: Mesc-CM etkileri gibi çeşitli yöntemler ile doğrulanmıştırSA β-gal tahlil, hücre döngüsü analizi ve QRT-PCR. <ol><li> SA β-gal testi (Şekil 3A) <ol><li> HDF ortamında 6 kuyulu levhalarda kuyu başına 2 x 10 4 hücre yoğunluğunda tohum HDF&#39;ler. 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe ve% 5 CO2. </li><li> bir gecede inkübasyonu takiben, ıskarta HDF orta yarısı ve Mesc-CM ve kontrol ortamı ekleyin. 37 ° C&#39;de 72 saat% 5 CO2 inkübe edin. Kontrol ortamı mESCs yokluğunda bir jelatin kaplı tabak (serum ortamında azalır), serumsuz ortamda elde edilir. </li><li> İki yıkama, toplam yıkama başına 30 saniye için hücreler (6-çukurlu plaka başına 2 mi) karşılamak için yeterli hücrelerin PBS ile yıkayın. fiksasyonu için% 3.7 paraformaldehid (PFA) ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. DİKKAT: (Tehlikeli) Paraformaldehyde toksik ve korozif bir çözümdür. Çözüm işlerken kişisel koruyucu giysiler (örneğin, nitril veya lateks eldiven, bir laboratuvar önlüğü, gözlük ve) giyin.Bir davlumbaz kullanın. </li><li> sabitleme çözüm aspire. Aşama 4.1.3 de tarif edildiği gibi, iki kez PBS ile sabitlenmiş hücreler yıkanır. </li><li> (1-2 mi göz başına 6 çukurlu bir tablanın bir çukuru) SA β-gal ile boyama solüsyonu ekleyin. 37 ° C&#39;de 17.5 saat süreyle inkübe edin. NOT: Bu bir CO2 inkübatörde inkübe edilmesi değildir. </li><li> SA β-gal ile boyama çözeltisi aspire ve aşama 4.1.3 de tarif edildiği gibi, iki kez PBS ile yıkayın hücreleri. </li><li> Karşı boyama Eosin solüsyonu eklenir. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. Aşama 4.1.3 de tarif edildiği gibi, iki kez PBS ile yıkayın hücreleri. </li><li> sonraki analiz için bağlı bir dijital kamerayı kullanarak ışık mikroskobu ile yakalama görüntüleri kullanarak 100X büyütmede görüntü hücreleri. NOT: hücrelerin toplam sayısı kör bir şekilde sayılabilir ve SA β-gal pozitif mavi hücrelerin yüzdesi hesaplanabilir. </li></ol></li><li> Hücre Döngüsü Analizi (Şekil 3B) <ol><li> bir yoğunlukta tohum HDF&#39;lerHDF ortamında 6 cm hücre kültür kaplarına oyuk başına 8 x 10 4 hücre. 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe ve% 5 CO2. </li><li> bir gecede inkübasyonu takiben, ıskarta HDF orta yarısı ve Mesc-CM ve kontrol ortamı ekleyin. 37 ° C&#39;de 24 saat% 5 CO2 inkübe edin. </li><li> 300 x g, 5 dakika için tarif 3.1 adım ve santrifüj gibi, hücreler tripsinize. Gibi soğuk PBS çözeltisi ile yıkanır hücreler 2500 x g&#39;de 3 dakika boyunca iki kez ve santrifüj (PBS, 0.5 mM CaCl2 ve% 2 FBS, 1.5 mi tüp başına 1 mi) ile. gibi soğuk PBS çözeltisi 100 ul süspanse edin. </li><li> vorteks ederken soğuk etanol 200 ul bırakarak hücreleri sabitleyin. en az 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de depolayın. </li><li> Aşama 4.2.3 de tarif edildiği gibi, iki kez soğuk PBS çözeltisi ile hücreleri yıkayın. </li><li> 50 ug / ml RNase içeren sodyum sitrat tamponunda 250 ul (1.12%, pH 8.5) &#39;de tekrar süspansiyon hücreleri. 37 ° C&#39;de 30 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> sodyum sitrat 250 ul ekleyinTampon 50 ug / ml propidyum iyodür içeren. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 20 akış sitometrisi kullanılarak her numune 10.000 hücre ölçün. </li></ol></li><li> QRT-PCR (Şekil 3C) <ol><li> adımlar 4.1.1 ve 4.1.2 de açıklandığı gibi tohum HDF&#39;ler ve Mesc-CM ekleyin. </li><li> üreticinin protokolüne uygun olarak bir RNA özütleme kiti kullanılarak HDF&#39;ler toplam RNA izole edin. Bir spektrofotometre 21 kullanılarak çıkarılan toplam RNA sayısal olarak. </li><li> Üreticinin protokolüne 20 göre oligo (dT) primerleri ve M-MLV ters transkriptaz ihtiva eden reaksiyon karışımı, 20 ul toplam RNA&#39;nın 1 ug ekleyerek cDNA sentez. </li><li> Yeşil PCR ana karışımı ve özel gen primerler (Ek Tablo 1) kullanarak, gerçek zamanlı PCR makinesi ile cDNA amplifikasyon ölçün. GAPDH ifade ile veri normalleştirmek. Aşağıdaki PCR protokolü kullanın: İlk de95 ° C&#39;de 10 dakika boyunca doğma; 95 ° C&#39;de 15 saniye boyunca 45 devir, 55 ° C&#39;de 20 saniye ve 72 ° C&#39;de 35 saniye; ve 95 ° C, 60 ° C de 1 dakika, 95 ° C&#39;de 30 saniye ve 60 ° C&#39;de 15 C&#39;de 5 saniye, 15 saniye için erime eğrisi aşaması. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Lavasani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-derived+stem%2Fprogenitor+cell+dysfunction+limits+healthspan+and+lifespan+in+a+murine+progeria+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model.</a> Nat Commun. 3, 608(2012).</li>
<li>Woo, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+contribution+of+human+embryonic+stem+cell-derived+hepatocyte-like+cells+to+liver+repair+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice.</a> Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).</li>
<li>Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+as+a+clinical+hurdle+for+pluripotent+stem+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies.</a> Nat Med. 19, 998-1004 (2013).</li>
<li>Moon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+treating+ischemic+disease+using+human+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+without+direct+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation.</a> Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).</li>
<li>Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+angiogenesis+for+critical+limb+ischemia%3A+microvascular+therapies+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age.</a> Circulation. 118, 9-16 (2008).</li>
<li>Lazarous, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+in+patients+with+intermittent+claudication%3A+results+of+a+phase+I+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial.</a> J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).</li>
<li>Adams, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healing+and+hurting%3A+molecular+mechanisms%2C+functions%2C+and+pathologies+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence.</a> Mol Cell. 36, 2-14 (2009).</li>
<li>Harrison, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+fed+late+in+life+extends+lifespan+in+genetically+heterogeneous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice.</a> Nature. 460, 392-395 (2009).</li>
<li>Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+sirtuins+viable+targets+for+improving+healthspan+and+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan.</a> Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).</li>
<li>Martin-Montalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+improves+healthspan+and+lifespan+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Metformin improves healthspan and lifespan in mice.</a> Nat Commun. 4, 2192(2013).</li>
<li>Loffredo, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+differentiation+factor+11+is+a+circulating+factor+that+reverses+age-related+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy.</a> Cell. 153, 828-839 (2013).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li>
<li>Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisenescence+effect+of+mouse+embryonic+stem+cell+conditioned+medium+through+a+PDGF%2FFGF+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway.</a> FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).</li>
<li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+number+affects+the+pluripotency+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+judged+by+tetraploid+embryo+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation.</a> Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).</li>
<li>Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+protein+enrichment+and+analysis%3A+an+optimized+approach+applied+on+cancer+cell+lines+using+2D+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS.</a> J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).</li>
<li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+replicative+senescence+by+insulin-like+growth+factor-binding+protein+3+in+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells.</a> Aging Cell. 6, 535-545 (2007).</li>
<li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cellular+senescence+by+insulin-like+growth+factor+binding+protein-5+through+a+p53-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism.</a> Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).</li>
<li>Eiselleova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mouse+and+human+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.</a> Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

serum- ve besleyici içermeyen Mesc-CM başarıyla toplanması için aşağıdaki öneriler dikkate alınmalıdır. En önemli faktör Mesc-CM toplanması için erken geçiş mESCs kullanıyor. Daha önce, bu erken geçiş Mesc-CM geç geçişli mESCs göre daha iyi bir anti-yaşlanma etkileri olduğu gösterilmiştir. MESCs geçiş sayısı gelişim potansiyeli 16 ve pluripotensini 17 etkilediği bildirilmiştir. Ek araştırmalar, anti-yaşlılık etkilere neden Mesc secretome, belirli faktörleri incelemek iç...

Bu protokolün amacı, serum- ve besleyici içermeyen kültür koşullarından fareye embriyonik kök hücre (Mesc) -conditioned ortamı (Mesc-CM) toplamak ve biyolojik fonksiyonları karakterize etmektir. Genel olarak, embriyonik kök hücreler (EKH) nedeniyle kendini yenileme 1-3 onların pluripotensin ve kapasite rejeneratif tıp ve hücre tedavisinde büyük bir potansiyele sahiptir. Ancak, kök hücrelerin doğrudan nakli gibi bağışıklık reddi ve tümör oluşumu 4,5 gibi çeşitli sınırlamalar vardır. Bu nedenle, bir hücre barındırmayan bir yaklaşım rejeneratif tıpta ve yaşlanma müdahaleler 6,7 için alternatif bir tedavi stratejisini sağlayabilir. Yaşlılık büyüme durması, değişmiş hücre fizyolojisi ve davranışları sürekli devlet tarafından karakterize doku ve organların yaşlanması, bir hücresel meslektaşı olarak görülüyor. kanser dahil yaygın hastalıklar, kardiyovasküler hastalık, t ana risk faktörüdür Yaşlanma2 diyabet ype ve nörodejenerasyon 8. Yaşlanmanın bariz özelliklerinden biri kök hücre yaşlanması ve bitkinlik 9 kaynaklanan dokuların rejeneratif potansiyelinin, düşüş olduğunu. Birçok önemli çalışmalar, sürekli yaşlanmayı geciktirmek ve ömrünü uzatmak için yeteneği var rapamisin 9, resveratrol 10, ve metformin 11 ve kan yoluyla bulaşan sistemik faktörler, yani GDF11 12 gibi farmakolojik molekülleri göstermiştir. Bu çalışmada, Mesc-CM, serum faktörleri ve MEF&#39;lerden salgısal faktör kontaminasyonu ortadan kaldırır serumsuz (fetal inek serumu, FBS) ve besleyici (fare embriyonik fibroblastlar, MEF&#39;ler) katmanları hasat edilmiştir. dolayısıyla Mesc özgü salgı faktörlerin doğru tespit etkin bir serum- ve besleyici içermeyen CM izin Bu koşullar. Bu önerilen protokol nispeten yüksek verimli, etkin maliyet ve kolayçalıştırmak için. Bu teknik, yaşlanma ile ilişkili hastalıklar ve diğer yenileme için girişimler karşı güvenli ve potansiyel olarak avantajlı bir hücresiz terapötik bir yaklaşım geliştirilmesi için kullanılabilecek bir anti-yaşlılık etkisi aracılık edebilen Mesc türetilen çözünür faktörlerin tanımlanması, kavranmasını sağlar tedaviler.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td> <td># 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td> <td>#</td><td>30044333% 20, ES hücre kalitesi</td></tr><tr><td>Penisilin ve streptomisin</td><td>Invitrogen</td> <td># 15140</td><td>50 birim / ml penisilin ve 50&nbsp; mg / ml streptomisin</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Invitrogen</td> <td># 25030</td><td>2&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA)</td><td>İnvitrojen</td><td>#11140</td><td>100&nbsp; &mikro; M</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M3148</td><td>100&nbsp; &mikro; M</td></tr><tr><td>Lösemi inhibitör faktör&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>#ESG1107</td><td>100 birim/ml</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>#22600</td><td></td></tr><tr><td>X-gal&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#B4252</td><td>1 mg / ml</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> <td>Sigma</td><td>P6148</td><td>%3.70</td></tr> <tr><td>Dimetilformamid (DMF)</td> <td>Sigma</td><td>#D4551</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum ferrisiyanür</td><td>Aldrich</td><td>#455946</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>potasyum ferrosiyanür</td><td>Aldrich</td><td>#455989</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>#S7653</td><td>150 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>#M2393</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Mitomisin C</td><td>Sigma</td><td>#M4287</td><td>10&nbsp; &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Propidyum iyodür&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#P4170</td><td>50&nbsp; &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion</td><td>#15596018</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV ters transkript-taze</td><td>Promega</td><td>#M170B</td><td></td></tr><tr><td>Güç SYBR Yeşil PCR ana karışımı&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td> <td># 4367659</td><td></td></tr><tr><td>HDF'ler, NHDF-Ad-Der-Fibroblast&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>#CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>Şişe üstü filtre</td><td>Corning</td> <td># 430513</td><td>0.2 & mu; m</td></tr></tbody></table>

serum- toplanması ve besleyici serbest fare embriyonik hücre içermeyen yaklaşım hücre klimalı orta kök

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

Embriyonik kök hücrelerin (ESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) çeşitli hücre tipleri üretme kapasitesi, rejeneratif tıp alanında yeni yollar açmıştır. Bununla birlikte, faydalarına rağmen, ESC'lerin ve iPSC'lerin tümörjenik potansiyeli, klinik uygulamalar için uzun süredir bir engel olmuştur. İlginç bir şekilde, ESC'lerin doku yenilenmesini teşvik edebilen ve hücresel yaşlanmayı geciktirebilen birkaç çözünür faktör ürettiği gösterilmiştir, bu da ESC'lerin ve iPSC'lerin hücresiz bir müdahale yöntemi olarak da kullanılabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, fare embriyonik kök hücresi (mESC) ile şartlandırılmış ortamın (mESC-CM) serum bileşenlerinin (fetal sığır serumu, FBS) ve besleyici hücrelerin (fare embriyonik fibroblastları, MEF'ler) minimum kontaminasyonu ile hasat edilmesi yöntemi çok talep edilmiştir. Burada, bu çalışma, serum ve besleyici içermeyen koşullar altında mESC-CM'nin toplanması ve yaşlanma ile ilişkili çoklu okumalar kullanılarak mESC-CM'nin karakterizasyonu için optimize edilmiş bir yöntemi göstermektedir. Bu protokol, serum ve besleyici kontaminasyonu olmadan saf mESC'ye özgü salgı faktörlerini toplamak için bir yöntem sağlayacaktır.

Başlangıçta, mESCs FBS ve diğer ek (Şekil 1 A ve 2A) ile Mesc ortam içinde bir MEF besleyici tutulur. CM besleyici tabaka FBS ya da diğer ek (Şekil 1B ve 2B) olmadan düşük serum ortamında mESCs toplanmıştır. Bu kültür durum bize besleyici, FBS veya diğer takviyeleri faktörler tarafından potansiyel kirlenme olmadan klimalı ortam Mesc-özgü toplamak için izin verir. Kontrol ortamı mESCs olmadan aynı kültür koşullarında topl...

Bu protokol, serumdan türetilmiş fare embriyonik kök hücrelerin içinde (Mesc) -conditioned ortamı (Mesc-CM) için bir yöntem sağlar (fetal inek serumu, FBS) - ve besleyici (fare embriyonik fibroblastlar, MEF&#39;ler) bir hücrenin içermeyen koşullar -ücretsiz yaklaşım. Bu yaşlanma ve yaşlanma ile ilişkili hastalıkların tedavisi için uygun olabilir.

Serum- toplanması ve Besleyici serbest Fare Embriyonik Hücre içermeyen Yaklaşım Hücre klimalı Orta Kök

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Bu protokolün genel amacı, serum ve besleyici serbest kültür koşulları altında fare embriyonik kök hücrelerinden şartlandırılmış besiyerini toplamak ve bu besiyerinin biyolojik fonksiyonlarını karakterize etmektir. Bu prosedür, yaşa bağlı hastalıklar için güvenli ve hücresiz terapötik yaklaşımın geliştirilmesi için fare embriyonik kök hücrelerinden salgılanan çözünür faktörlerin yaşlanma karşıtı aktivitesi hakkında bilgi sağlar. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımda araştırma profesörü olan Dr.Yun-Ui Bae olacak.Biyolojik güvenlik başlığında, bir fare embriyonik fibroblast veya MEF hücre kültürünü, 15 santimetrelik bir hücre kültürü kabında 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte iki saat boyunca mitomisin C ile takviye edilmiş 20 mililitre MEF ortamı ile tedavi edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve 37 santigrat derecede üç dakika boyunca üç mililitre tripsin EDTA ile ayırın. Hücreler plakanın altından kalktığında tripsini altı mililitre taze MEF ortamı ile nötralize etmek.Hücreleri santrifüjleme ile topladıktan sonra, peleti beş mililitre MEF ortamında yeniden süspanse edin ve taze MEF ortamında 10 santimetre kültür kabı başına 10 ila altıncı inaktive e

collection-serum-feeder-free-mouse-embryonic-stem-cell-conditioned

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Fare embriyonik fibroblast (MEFS) kalitesi, CF-1 gibi farenin sağ suşu tarafından dikte edilir. Bu elde edilen Pluripotency destekleyici MEFS ve klimalı ortam (CM) işbirliği içinde kendini yenileyen ve pluripotency korumak için aktivin / Düğüm ve FGF yolları için gerekli aktivin A, Gremlin ve Tgfβ1 optimal konsantrasyonu içermelidir.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

Bu video, fare embriyonik kök hücrelerinden kortikal internöron öncüleri oluşturmak için bir yöntem sunar. Protokol, kök hücrelerin, kök hücre çoğalmasını ve embriyoid cisimlere (EB'ler) agregasyonunu kolaylaştıran spesifik küçük molekül inhibitörleri içeren ortamlarda kültürlenmesini gerektirir. Daha sonra, EB'ler enzimlerle ayrıştırılır ve kortikal internöron öncülerine farklılaşmalarını teşvik etmek için adezyon proteinleri ile kaplanmış kültür plakası kuyucukları üzerine kaplanır.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Kortikal İnternöron Öncüllerinin Üretilmesi

Bu video, fare embriyonik kök hücrelerinden (mESC'ler) nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) in vitro olarak üretilmesi için bir yöntemi göstermektedir. mESC'ler, embriyoid cisimcikleri (EB'ler) oluşturmak için süspansiyon halinde kültürlenir ve daha sonra yapışık bir kültürde retinoik asit tedavisi yoluyla NPC'lere farklılaşmaya yönlendirilir.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinden Nöral Progenitör Hücreler Üretmek İçin Bir Teknik

Embriyo kültürlerinde kullanılan serum, özellikle sinyalizasyon etkileşimler içeren çalışmalarda deney sonucunu etkileyebilecek bilinmeyen bileşenleri içerir. Burada bir serum içermeyen kültür sistemi kullanılan oksijenli ve 16-40 saat süre ile kültüre orta gebelik fare embriyo utero gelişen embriyo benzer morfolojik gelişimini gösteren göstermektedir.

Serumsuz Tüm Embriyo Kültür Sistemde Fare Embriyonik Development

Fare embriyonik kök hücreleri, OP9-DL1 ko-kültür sistemi kullanılarak in vitro olarak T hücrelerine farklılaştırılabilir. Bu prosedürde başarı, reaktif/hücre bakımına ve tekniğe duyarlı temel adımlara dikkat edilmesini gerektirir. Burada bu kritik parametreleri tartışıyor ve bu teknolojinin benimsenmesini teşvik etmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

T hücrelerinin türetilmesi İn Vitro Fare Embriyonik Kök Hücreleri

Bu protokol, serum içermeyen tek katmanlı bir yöntem kullanarak embriyonik kök hücrelerden nöral progenitörler üretme yöntemini ayrıntılı olarak açıklar. Bu progenitörler, olgun nöral hücre tiplerini türetmek veya nöral spesifikasyon sürecini incelemek için kullanılabilir ve bileşik tarama için çok kuyulu format ölçeklendirmesine uygundur.

Serum serbest Tek tabakalı Kültüründe Fare Embriyonik Kök Hücre Sinir Farklılaşma

Proteinler genellikle farklı hücresel fonksiyonları sarf edebilirsiniz birden çok etki içerirler. Gen irtibat kutusu kapağı (KO) bu işlevsel çeşitliliği dikkate almaz. Burada, çeşitli işlevsel etki alanları veya bir proteinin varyantlarının moleküler diseksiyon sağlar KO embriyonik kök hücrelerin bir rekombinasyon aracılı kaset değişimi (RMCE) tabanlı bir yapı-işlev yaklaşım sunulmuştur.

Recombinase aracılı Kaset Değişimi Kullanarak Fare Embriyonik Kök Hücre yapı-fonksiyon Çalışmaları

Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Bu iletişim kuralı kortikal interneuron ataları ve sonrası Mitotik interneuron öncüleri fare embriyonik kök değiştirilmiş bir embryoid vücut monolayer yöntemi kullanarak hücre oluşturmak için bir yöntem açıklanır. Bu ataları/hareketlenme öncesi ilk belirtiler kullanılan vitro olabilir fluorescently sıralanmış ve kader tayini çalışmak için yenidoğan yeni korteksimiz içine nakledilen veya tedavi uygulamalarında kullanılan.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

Fare embriyonik kök hücre kültürü çalışmalarının iki kimyasal tabanlı protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu yeni yöntem Tet-aracılı oksidasyon (vitamin C) teşvik ve DNA hypomethylation ve fare embriyonik kök hücreler pluripotent korumak için 5-metilsitozin (PD0325901 tarafından) de novo sentezi bastırmak sinerjik mekanizmaları kullanır.

Fare embriyonik kök hücre kullanarak MEK inhibitörü PD0325901 ve C vitamini genomik Hypomethylation korumak için bir alternatif kültür yöntemi

Burada, biz ChIP-Seq gerçekleştirmek için yöntemleri tarif ve CARIP-yeni nesil sıralama, Kütüphane hazırlık dahil olmak üzere küresel epigenomic ve kromatin ilişkili RNA oluşturmak için Seq, ES hücrelerde eşler.

CARIP-Seq ve ChIP-Seq: kromatin ilişkili RNA ve Protein-DNA etkileşimleri embriyonik kök hücreleri tanımlamak için yöntemleri

Öğrenin fare embriyonik kök hücrelerinden serum ve besleyici hücre içermeyen koşullarda koşullanmış ortam toplama yöntemini. Bu hücre içermeyen yaklaşım, yaşlanma ile ilişkili hastalıklar için güvenli tedavi potansiyeli sunar.

Serum- toplanması ve Besleyici serbest Fare Embriyonik Hücre içermeyen Yaklaşım Hücre klimalı Orta Kök

Daha fazla video keşfet