İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Bu prosedürün genel hedefleri, bir insan endoservikal fırça örneğinden geleneksel olmayan bir intraepitel hücreli, gama delta T hücre popülasyonunu izole etmek ve karakterize etmektir. Bu yöntem, enfeksiyonları önlemek için etkili stratejilerin tasarımına yardımcı olmak için endoservikal intraepitelyal bölme içindeki bağışıklık olaylarının anlaşılmasında kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, endoservikal intraepitelyal gama delta T lenfositlerini in vitro olarak incelemek için güçlü ve verimli bir araç sağlamasıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan kıdemli bir araştırma görevlisi olan Laura Romero olacak. Topladıktan hemen sonra, sitofırçayı içeren tüpü buzun üzerine yerleştirin. Toplandıktan sonraki bir saat içinde, sitofırçayı içeren tüpü 10 saniyelik dört darbe için girdaplayın.

Ardından tüpü santrifüjleyin ve paleti bozmadan fırçayı dikkatlice çıkarın. Daha sonra, hücrelere bir mililitre IMDM ortamı ekleyin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Sitofırçayı 50 mililitrelik konik bir tüpte 100 milimetrelik bir hücre süzgecinin üzerine yerleştirin ve fırçayı 20 mililitre taze IMDM ile yıkayın.

Yıkamayı santrifüjleyin. Paleti bir mililitre taze IMDM'de yeniden askıya alın ve orijinal sitobrush toplama tüpündeki hücrelerle yıkama havuzuna alın. Endoservikal hücreleri akış sitometrisi ile analiz etmek için, beş mililitrelik tüp başına 100 mikrolitre faks tamponunda bir ila üç kez 10 ila beşinci hücreleri alikotlayın ve hücreleri karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika boyunca ilgilenilen antikorlar ve canlılık boyası ile etiketleyin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri kit tamponunun bir mililitresinde yıkayın. Hücreleri döndürdükten sonra, süpernatanı tamamen boşaltın. Kompanzasyon kontrollerini ayarlamak için boncukları ve uygun IgG kontrol antikorlarını kullanın.

Ardından, ilk tüpü yükleyin ve kapıyı toplam endoservikal hücre popülasyonunun üzerine ileri doğru bir saçılma grafiğinde ayarlayın, ardından hücre çiftlerini dışlayın. Ölü hücreleri, canlı CD45 pozitif ve CD3 pozitif hücreler üzerinde geçit yaparak canlılık boya ifadelerine göre hariç tutun. Gama delta bir ve gama delta iki pozitif hücreler, gama delta TCR'yi eksprese eden CD3 pozitif hücrelerin alt popülasyonları olarak tanımlanır.

Gama delta T hücrelerini manyetik boncuk izolasyonu ile izole etmek için, 40 mikrolitre TCR gama delta MicroBead kit tamponunda yeni hasat edilmiş endoservikal hücrelere 10 kata kadar yeniden süspanse edin. Üreticinin iki aşamalı boyama protokolü için talimatlarını izleyerek, hücreleri anti-TCR gama delta hapten antikoru ile etiketleyin, ardından dört ila sekiz santigrat derecede 15 dakika boyunca anti-hapten FITC konjuge MicroBeads uygulayın. İnkübasyonun sonunda, hücreleri kit tamponunun bir mililitresinde yıkayın ve süpernatanı tamamen boşaltın.

Hücreleri 500 mikrolitre kit tamponunda yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu doğrudan uygun ayırıcı mıknatısta ayarlanmış bir manyetik boncuk sütununa uygulayın ve akışı yeni bir tüpte toplayın. Tüm hücreler kolondan geçtiğinde, kolonu 500 mikrolitre taze tamponla üç kez yıkayın ve yıkamaları toplanan hücrelerle bir araya getirin. Gama delta T hücrelerini toplamak için, kolonu konik bir tüpe aktarın ve T hücrelerini kolondan bir mililitre taze tamponla yıkamak için kolon pistonunu kullanın.

Gama delta T hücrelerini floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması ile izole etmek için, hücreleri antikor panelinde az önce gösterildiği gibi bir canlılık boyası ile etiketleyin. Ardından, hücreleri canlı boyalarına ve CD45, CD3 ve gama delta pozitifliğine göre sıralayın. T hücrelerini eksprese eden benzersiz bir gama delta V1 popülasyonu, insan endoservikal hücre örneklerinde kolayca tespit edilebilir.

Kapılı CD3 pozitif gama delta one pozitif hücrelerin detaylı fenotipik analizi, bu hücrelerin çoğunluğunun CD4 ve CD8 negatif olduğunu ortaya koymaktadır. Az önce gösterildiği gibi, endoservikal hücrelerin manyetik boncuk ayrımı, bu TCR gama delta hücrelerinin yaklaşık% 98 saf popülasyonunun saflaştırılması ile sonuçlanır. Bu saflık seviyesi, endoservikal gama delta T hücrelerinin izolasyonu için her iki tekniğin de kullanımını doğrulayan floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması yoluyla da elde edilebilir.

İlginç bir şekilde, kadın HIV ile enfekte hastalardan ve sağlıklı donör kontrollerinden toplanan endoservikal intraepitelyal hücrelerin, gama delta T hücrelerinin analizi, HIV ile enfekte bireylerde bu önemli hücrelerin sayısında ve canlılığında hafif bir azalma olduğunu göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, iyi bir hücre canlılığını korumak için numuneyi hızlı bir şekilde işlemeyi ve hücreleri tüm prosedür boyunca buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, endoservikal intraepitelyal bölme içindeki enflamatuar ve sinyal yolları hakkında ek soruları yanıtlamak için yüksek hassasiyetli verimli multipleks PCR ile birleştirilmiş tek hücre sıralama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, HIV ve bulaşıcı hastalıklar alanındaki araştırmacıların mukozal savunmasızlığın yeni hücre belirteçlerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bir insan endoservikal fırça örneğinden intraepitelyal lenfositlerin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.