Name: İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Öğrenin, insan endoservikal örneklerinden gamma delta T hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometrisi analizi yöntemini. Bu protokol, lokal immün yanıtları anlamak ve enfeksiyon önleme stratejileri geliştirmek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu çalışmalarına katılmak için istekli olduklarını Miami WIHS çalışma katılımcılara teşekkür ederiz. Bu yazıda veriler Miami Kadın Kurumlararası HIV Çalışması (WIHS) ile toplanmıştır. Bu yayının içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Bu çalışma İlerletme Allerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve Kadın Kurumlararası HIV enfeksiyonu Çalışması (WIHS) [hibe sayısı U01 AI103397], Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü, Sağlık [hibe sayısı P30AI073961] National Institutes, Ulusal Merkezi tarafından desteklenen Sağlık translasyonel Bilimleri ve Azınlık Sağlığı ve Sağlık Farklılıkların Ulusal Enstitüsü, Sağlık [hibe sayısı UL1TR000460 ve 1KL2TR000461] Ulusal Enstitüsü, Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi, Ulusal Enstitüsü Ulusal Enstitüsü [hibe sayısı K23HD074489].

Çalışma faaliyetleri Miami Kadın HIV Kurumlararası Çalışması (WIHS) ve AIDS Araştırma Miami Merkezi (SYAO) .Institutional İnceleme Kurulu (Üniversitesi Tıp Miami Miller Okulu) onayı öncesinde elde edilmiştir işbirliği ile Miami HIV Araştırma Birimi Üniversitesi&#39;nde gerçekleşti işe alma ve herhangi bir değerlendirme veya çalışma ile ilgili prosedürlere. 1. Endoservikal Fırça Örnek Toplama NOT: Katılımcılar eğitim MD ya da jinekolog ve cytobrush takarak spekulum muayenesinde altında yapıldı intraepitelyal lenfositler toplanması tarafından gerçekleştirilen bir vajinal muayene yapıldı. <ol><li> katılımcı özellikleri <ol><li> cinsel olarak aktif hamile değil ve kontraseptif ilaçlar veya rahim içi cihaz ile yaş, 18 ila 45 yaş arası kadınlar katılımcıları askere. </li><li> Vajinal muayenede önce, sahip katılımcıların yeşil bir 10 ml kan beraberlik geçmesiperiferik kan mononükleer hücre (hücre) izolasyonu için üst heparin vacutainers. endoservikal intraepitelyal analiz 9 için bir kontrol olarak hizmet vermektedir. </li></ol></li><li> Endoservikal örneklerinin toplanması <ol><li> yağlama olmadan vajina içine uygun büyüklükte bir steril spekulum yerleştirin. spekulum ve mukus temizlemek için steril gazlı bez sokulmasını kolaylaştırmak için ılık su kullanın. spekulum pozisyonu os ve ektoservikste tam görünüm için izin verir. </li><li> Ancak yakın sadece kıllar görünür olana kadar endoservikal kanala endoservikal fırça yerleştirin. 360 ° fırça saat yönünde çevirin. IMDM ortamı 5 ml ihtiva eden 15 mL&#39;lik bir tüp içerisine fırça aktarın. </li><li> Toplandıktan hemen sonra, buz üzerinde cytobrush içeren tüp yerleştirin. Toplanan intraepitelyal hücrelerinin yüksek canlılığını elde edilmesi için, 1 saat içinde ve laboratuar işleme cytobrush sağlar. </li></ol></li></ol><ol><li> 4 kısa (10 saniye) vuruş uygulayarak endoservikal cytobrush içeren vorteks tüp. </li><li> X 250 g 10 dakika süre ile, cytobrush içeren tüp santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle tüpten cytobrush çıkarın (tüpün altındaki pelet rahatsız etmeyin) ve IMDM medya 1 ml ekleyin ve buz üzerinde tüp yerleştirin. </li><li> 50 ml tüp üstünde 100 mm hücre süzgecinden üzerinde cytobrush yerleştirin. </li><li> 20 ml IMDM ile cytobrush yıkayın. </li><li> 250 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj tüpü. </li><li> Süpernatantı Durusu ve pelet hücreler 1 ml IMDM tekrar süspansiyon ve 2.3 tarif zaten yeniden askıya pelet ile birleştirir. </li><li> Otomatik bir hücre sayacı 10 ile hücre sayımı veya tripan mavi boya, 10 uL hücre süspansiyonu 10 uL birleştirerek hemasitometre kullanarak hücreleri sayın. Yavaşça pipetlemeyin yukarı ve on kat aşağı hücreleri karıştırmak ve boya. Yük 10 uLİki hemositometre odaları birinin açıklığı içine karışımı. Beş ızgara alanlarında tüm hücreleri saymak. canlı ve cansız hücreler ayrı sayımı tutun. aşağıdaki formül kullanılarak hücre canlılığı belirlemek:% Canlı hücreler = cansız hücreler x 100 / toplam hücre sayısı hücreleri. Aşağıdaki hesaplamalar kullanarak ml başına müteakip hücre konsantrasyonu (ve hücrelerin toplam sayısı) belirler. ml başına toplam Hücreler = toplam hücre sayılan x (seyreltme faktörü / sayılan kare sayısı) 10.000 hücre / ml x. </li><li> % 10 DMSO ve% 90 FBS ihtiva eden dondurma ortamı kullanılarak izole endoservikal hücreleri dondurun. </li></ol> 3. Akım Sitometri <ol><li> PBS% 1 sığır serum albümini içeren 100 ul FACS tampon maddesi içinde 1-3 X 10 5 endoservikal hücreler (yeniden askıya </li><li> 1 uL / 10 Ekle 6 CANLI / DEAD fixable Sarı Ölü Hücre Leke kiti ve Tablo 1&#39;de açıklanan konsantrasyonlarda yüzey belirteçleri için antikorlar. </li><li> ışıktan korunan + 4 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li><li> 350 xg 5 dakika için 1 ml FACS tampon ve hücreleri santrifüj tüpleri ekleme </li><li> 300 uL% 1 paraformaldehid hücre pelet yeniden askıya. </li><li> FACS tampon 100 ul boncuk bir damla ve örnek boyama için kullanılan antikorlara aynı konsantrasyonda eklenmesi ile boyanması için kullanılan boncuk ve antikorlar kullanılarak dengeleme kontrol hazırlayın. </li><li> sitometre 405 nm, 488 nm ve 635 nm lazer ile donatılmış bir akış lekeli boncuk ve örnekleri edinin. </li></ol> 4. endoservikal Gamma Delta T Hücre İzolasyonu <ol><li> Manyetik boncuk ayırma <ol><li> Yeniden askıya Malzemeler ve Reaktifler Tablo başvurulan TCR gama delta microbead kitine dahil tampon 40 uL, 2.6 anlatılan endoservikal hücre pelet (≤10 7 toplam hücreleri). </li><li> iki adımlı boyama protokolü için kit talimatları uygulayın: Birincisi, zekâanti-hapten mikroboncuklar-FITC H, anti-TCR y ö hapten antikoru ve ikinci </li><li> 4-8 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edildikten sonra, 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de tampon ve santrifüj 1 mL eklenerek hücrelerin yıkayın. Tersine tüp süpernatant süzün ve bir kağıt parçası yardımı ile kuru dokunun. </li><li> Resim tampon 500 uL hücre pelet yeniden askıya ve satıcının protokolüne göre, uygun manyetik ayırıcı yerleştirerek manyetik kolon hazırlanmıştır. </li><li> kolona hücre süspansiyonu uygulayın ve geçmesine etiketsiz hücreleri toplamak ve tampon uygun miktarda (500 uL) ile kolon 3x yıkayın. bir tampon üç kez, kolon rezervuar boş bir kez her zaman ekleyerek yıkama adımları uygulayın. toplam atık toplamak. Bu durum işaretlenmemiş, negatif hücre fraksiyonudur </li><li> Sütun sütun üzerine tampon 1 ml manyetik ayırıcı ve pipet oluşturmak ve hemen manyetik etiket ile fraksiyonu floş kaldırsıkıca kolonu ile birlikte piston uygulayarak hücreleri ed. NOT: manyetik olarak etiketlenmiş anti-hapten mikroboncuklar floresan boya FITC ile konjuge beri İzole gama delta T hücresi zaten floresan akış sitometri analizi için boyandı. </li></ol></li><li> hücre sıralama <ol><li> canlılığı kalıbı ve antikor paneli ile hücre sıralama, etiket endoservikal hücreler için bölüm 3&#39;de tarif edildiği gibi. </li><li> Canlı, CD45 +, CD3 + ve gama delta pozitif hücreler üzerinde elektronik kapıları kurmak ve hücre sıralama gerçekleştirin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kaul, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genital+tract+immune+milieu%3A+an+important+determinant+of+HIV+susceptibility+and+secondary+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission.</a> J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).</li>
<li>Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+early+infection+to+prevent+HIV-1+mucosal+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission.</a> Nature. 464, 217-223 (2010).</li>
<li>Hayday, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma%5D%5Bdelta%5D+cells%3A+a+right+time+and+a+right+place+for+a+conserved+third+way+of+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection.</a> Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).</li>
<li>Nakasone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+gamma%2Fdelta+T+cells+in+the+lungs+and+their+roles+in+neutrophil-mediated+host+defense+against+pneumococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+infection+%2F+Institut+Pasteur%22%5BJournal%5D)">Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).</li>
<li>Autran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+gamma%2Fdelta%2B+lymphocyte+subsets+during+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection.</a> Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).</li>
<li>Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+Cells+in+HIV+Disease%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future.</a> Front Immunol. 5, 687(2014).</li>
<li>Hayday, A. C., Spencer, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19446471">Barrier immunity.</a> Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).</li>
<li>Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+and+dark+sides+of+intestinal+intraepithelial+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes.</a> Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).</li>
<li>Strbo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Intra-Epithelial+Endocervical+Gamma+Delta+%28GD%29+1+T+Cells+in+HIV-Infected+Women%5BTitle%5D)+AND+%22AJRI%22%5BJournal%5D)">Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women.</a> AJRI. 75, 134-145 (2016).</li>
<li>Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+automated+instrument+for+viability+and+concentration+measurements+of+cryopreserved+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Hematol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells.</a> Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).</li>
<li>Alcaide, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Vaginosis+Is+Associated+with+Loss+of+Gamma+Delta+T+Cells+in+the+Female+Reproductive+Tract+in+Women+in+the+Miami+Women+Interagency+HIV+Study+%28WIHS%29%3A+A+Cross+Sectional+Study%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study.</a> PloS one. 11, e0153045(2016).</li>
<li>Masson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+genital+tract+cytokine+signatures+of+sexually+transmitted+infections+and+bacterial+vaginosis+in+women+at+high+risk+of+HIV+infection%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Transm+Dis%22%5BJournal%5D)">Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study.</a> Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).</li>
<li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+%28IL%29-1%2C+IL-6%2C+and+IL-8+predict+mucosal+toxicity+of+vaginal+microbicidal+contraceptives%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives.</a> Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).</li>
<li>Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+isolation%2C+and+flow+cytometric+analysis+of+human+endocervical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples.</a> JoVE. , (2014).</li>
<li>McKinnon, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+viable+leukocyte+sampling+from+the+female+genital+tract+for+clinical+trials%3A+an+international+multi-site+study%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study.</a> PloS one. 9, e85675(2014).</li>
<li>Dominguez, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+quantitation+of+gene+expression+on+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells.</a> J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar bir çıkar çatışması doğurabilecek ticari veya başka ilişki yoktur (örneğin, ilaç hisse senedi sahipliği, danışmanlık, danışma kurulu üyeliği, ilgili patentler ya da araştırma fonu).

kadın alt genital sistem mukoza açığına değerlendirilmesi, HIV edinimi ve bulaşma riskini ele klinik çalışmaların önemli bir bileşenidir. Tipik haliyle, HIV enfeksiyonuna FGT güvenlik genital salgıları (sitokinler, kemokinler ve antimikrobiyal peptitler) 12, 13 içinde çözünür immün modülatörler ölçerek değerlendirilir. Ancak, bu biyobelirteçler, vajinal iltihap sadece göstergesidir fizyolojik ve patolojik olaylardan etkilenir ve her zaman doğrudan mukozal hasarı...

Biz intraepitelyal GD T hücrelerini değerlendirmek için endoservikal fırça örneklerini kullanarak metodolojisini geliştirdi. endoservikal kanal kolumnar epitel tek bir tabaka ile kaplı olduğu. İntraepitelyal lenfositler patojen mikropların 7, 8 karşılaşmak üzerine immün yanıtları hızla başlatabilir epitel tabakası içinde ikamet cephe lenfositler temsil etmektedir. endoservikal intraepitelyal bölmenin immünolojik olayların anlaşılması HIV de dahil olmak üzere hastalıklardan korunmak için etkili stratejiler tasarımı için önemlidir. Önerilen yöntem, bundan başka, HIV enfeksiyonu ya da HIV enfeksiyonu riski taşıyan kadınlarda intraepitelyal GD T hücrelerinin rolünün anlaşılması için çalışmalar yeni toplanmış insan endoservikal örneklerinde hem de dondurulmuş endoservikal hücreler için uygulanabilir. Bu protokolün ana amacı endoservikal intraepitelyal bölmede yeni immünolojik olayları keşfetmek ve değerlendirme, içinHIV enfeksiyonu olan kadınlarda mukozal açığına bir göstergesi olarak e GD T hücresi tepkileri. FGT bağışıklık etrafında bilgide önemli boşluklar başarıyla toplanması ve mukozal örnekleri işleme zorluk kısmen kaynaklanmaktadır. Ayrıca, karmaşık mukozal bağışıklık hücrelerinin heterojen ve birbirleri ile birbirine bağlılığı, bağışıklık sisteminin durumunu ve yeteneği yansıtan klinik olarak önemli ölçümler belirlenmesi için önemli zorluklar vardır. Biz daha olacak FRT dokunulmazlık yatan mekanizmaları belirlemek için kritik olabilir son derece mültipleksli, tek hücreli teknolojileri kullanılarak analiz edebilir yüksek derecede saflaştırılmış intraepitelyal GD T hücrelerini elde etmek için bir yöntem geliştirdi.

<table><tbody><tr><td>Cytobrush Plus GT&nbsp;</td><td>(CareFusion, San Diego, CA, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM, Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Medium&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter otomatik hücre sayacı (Vi-CELL Serisi Hücre Canlılık Analizörü</td><td>Beckman Coulter</td><td>496178</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Dimetil sülfoksit ve nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Fetal Sığır Serumu</td><td>İnvitrojeni, Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen, Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BSA Sigma Aldrich</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Sarı Ölü Hücre Lekesi kiti&nbsp;</td><td>Yaşam</td> <td>Teknolojileri,L349S9</td><td></td></tr><tr><td>%1 paraformaldehit</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D6148</td><td></td></tr><tr><td>Fortessa akış sitometresi&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>ArC Amin Reaktif Kompanzasyon Boncukları (Yaşam Teknolojileri, Grand Island, NY, ABD)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>anti-TCR gama/delta Mikro Boncuk Kiti</td><td>Milteny Miltenyi Biyotec A.Ş.</td><td>130-050-701</td><td></td></tr><tr><td>MS sütunu</td><td></td><td>103-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS ayırıcı</td><td></td><td>4124</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan endoservikal gamma delta t hücreleri İzolasyon ve akım sitometrisi analizi

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

kadın üreme yolları (FRT) mukozal bağışıklık sistemi ilk savunma hattı olarak hizmet vermektedir. Genital mukozanın daha iyi bilgi HIV dahil olmak üzere farklı patojenlerin patojenitesini anlamak için elzemdir. Gama ö (GD) T hücreleri &#39;alışılmamış&#39; T hücrelerinin prototipi ve gamma ve delta zincirlerinden oluşan heterodimerik T hücre reseptörleri (TCR&#39;ler) kendi ekspresyonu ile tanımlanan T hücrelerinin görece küçük alt grubunu temsil eder. Bu alfa-beta TCR ile tanımlanır klasik ve daha iyi bilinen CD4 + yardımcı T hücreleri ve CD8 + sitotoksik T hücreleri ayıran. GD T hücreleri genellikle dokuya özel dağılımını gösteren ve epitelde zenginleştirilmiştir. GD T hücreleri iltihap, tümör gözetimi, enfeksiyon hastalıkları ve otoimmünite immün yanıtları düzenlemişlerdir. Burada, tekrarlanabilir izole ve insan endoservikal intraepitelyal GD T lenfositleri analiz etmek için bir yöntem mevcut. Biz haKadın Kurumlararası HIV enfeksiyonu Çalışması (WIHS) katılan kadınlardan kullanılan endoservikal cytobrush örnekleri ettik. vajinal mukoza hakaret var olduğu koşulları sırasında GD T hücreleri etkileşimleri hakkında bilgi vajinal microbicides.In ek geliştirilmesi dahil olmak üzere, mukozal açığı ele aldığı herhangi bir klinik çalışmada uygulanan olabilir, mukozal GD T hücre yanıtları hakkında bilgi vardır enfeksiyonlu hastalıkların tedavi edilmesi GD T hücre tabanlı immün terapinin uygulanması için potansiyeli.

Son zamanlarda, endoservikal intraepitelyal GD T hücrelerini analiz ve HIV bulaşmış kadınların 9, 11 yılında endoservikal gama delta T hücrelerinin kaybı bildiren ilk sendin. Burada, biz izole etmek ve endoservikal gama delta T hücrelerinin alt kümesini analiz protokol açıklar. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, GD T hücreleri hali hazırda insan endoservikal hücre örneklerinde tespit edilebilir. <p class="jov...

Burada, intraepitelyal gama delta T hücrelerinin analizi için insan endoservikal intraepitelyal lenfositlerini elde etmek için bir izolasyon yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, endoservikal gama delta T hücrelerinin manyetik boncuklar veya hücre sınıflandırması ile saflaştırılması için genişletilebilir.

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Bu prosedürün genel amaçları, bir insan endoservikal fırça örneğinden geleneksel olmayan bir intraepitelyal hücre olan gama delta T hücresi popülasyonunu izole etmek ve karakterize etmektir. Bu yöntem, enfeksiyonların önlenmesine yönelik etkili stratejilerin tasarlanmasına yardımcı olmak amacıyla, endoservikal intraepitelyal kompartman içindeki immün olayların anlaşılmasındaki temel soruların yanıtlanmasına katkıda bulunabilir. Bu tekniğin temel avantajı, endoservikal intraepitelyal gama delta T lenfositlerini in vitro incelemek için güçlü ve verimli bir araç sağlamasıdır.Prosedürü, laboratuvarımdan kıdemli araştırma görevlisi Laura Romero uygulamalı olarak gösterecek. Toplamanın hemen ardından, sitofırça içeren tüpü buza yerleştirin. Toplamadan sonraki bir saat içinde, sitofırça içeren tüpü 10 saniyelik dört puls halinde vorteksleyin.Ardından, tüpü santrifüjleyin ve paleti bozmadan fırçayı dikkatlice çıkarın. Sonra, hücrelere 1 ml IMDM medyumu ekleyin ve tüpü buza yerleştirin. Sitolojik fırçayı, 50 ml'lik konik bir tüp içindeki 100 mm'lik hücre süzgecinin üzerine yerleştirin ve fırçayı 20 ml taze IMDM ile yıkayın.Yıkamayı santrifüjleyin. Peleti bir mililitre taze IMDM içinde yeniden süspande edin ve orijinal sitofırça toplama tüpündeki hücrelerle birlikte birleştirin. Endoservikal hücreleri akış sitometrisi ile analiz etmek için, her beş mililitrelik tüpe 100 mikrolitre fax tamponu içerisinde bir ila üç çarpı 10⁵ hücre şeklinde alikotlayın ve hücreleri ilgilenilen antikorlar ve canlılık boyası ile dört santigrat derecede, karanlıkta 30 dakika boyunca işaretleyin.İnkübasyonun sonunda, hücreleri bir mililitre kit tamponu ile yıkayın. Hücreleri santrifüj ettikten sonra, süpernatanı tamamen dökün. Kompanzasyon kontrollerini ayarlamak için boncuklar ve uygun IgG kontrol antikorlarını kullanın.Ardından, ilk tüpü yükleyin ve bir ileriye yönlü yan saçılım (forward by side scatterplot) grafiğinde toplam endoservikal hücre popülasyonu üzerinde kapı ayarını yapın, ardından hücre dubletlerini dışlayın. Canlılık boyası ekspresyonlarına göre ölü hücreleri dışlayın, canlı CD45 pozitif ve CD3 pozitif hücreler üzerinde kapılama yapın. Gama delta bir ve gama delta iki pozitif hücreler, gama delta TCR ekspresyonu gösteren CD3 pozitif hücrelerin alt popülasyonları olarak tanımlanır.Gamma delta T hücrelerini manyetik boncuk izolasyonu ile ayırmak için, taze olarak toplanmış 1x10⁷'ye kadar endoservikal hücreyi 40 µL TCR gamma delta MicroBead kit tamponunda yeniden süspande edin. İki aşamalı boyama protokolü için üretici talimatlarını izleyerek, hücreleri önce anti-TCR gamma delta hapten antikoru ile, ardından anti-hapten FITC konjuge MicroBead'ler ile 4-8 °C'de 15 dakika boyunca işaretleyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri 1 mL kit tamponu ile yıkayın ve süpernatantı tamamen boşaltın.Hücreleri 500 µL kit tamponunda yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonunu, uygun ayırıcı mıknatısa yerleştirilmiş bir manyetik boncuk kolonuna doğrudan uygulayarak akış sıvısını yeni bir tüpe toplayın. Tüm hücreler kolondan geçtikten sonra, kolonu üç kez 500 µL taze tampon ile yıkayın ve yıkama sıvılarını toplanan hücrelerle birleştirin. Gama delta T hücrelerini toplamak için kolonu konik bir tüpe aktarın ve T hücrelerini bir mL taze tampon ile kolondan dışarı itmek için kolon pistonunu kullanın.Floresanla aktive edilen hücre ayıklama yöntemiyle gama delta T hücrelerini izole etmek için, az önce gösterildiği gibi antikor panelindeki bir canlılık boyası ile hücreleri işaretleyin. Ardından hücreleri canlılık boyası ve CD45, CD3 ve gama delta pozitifliklerine göre ayıklayın. İnsan endoservikal hücre örneklerinde gama delta V1 eksprese eden benzersiz bir T hücresi popülasyonu kolaylıkla tespit edilebilir.Gatelenmiş CD3 pozitif gama delta bir pozitif hücrelerin ayrıntılı fenotipik analizi, bu hücrelerin çoğunluğunun CD4 ve CD8 negatif olduğunu ortaya koymaktadır. Az önce gösterildiği gibi, endoservikal hücrelerin manyetik boncukla ayrıştırılması, bu TCR gama delta hücrelerinin yaklaşık %98 saflıkta bir popülasyonunun saflaştırılmasıyla sonuçlanır. Bu saflık düzeyi, floresan aktivasyonlu hücre ayıklama yöntemiyle de elde edilebilir; bu da endoservikal gama delta T hücrelerinin izolasyonu için her iki tekniğin kullanımını doğrulamaktadır.İlginç bir şekilde, HIV enfeksiyonu olan kadın hastalar ve sağlıklı donör kontrollerinden toplanan endoservikal intraepitelyal hücrelerin, gama delta T hücrelerinin analizi, HIV enfeksiyonu olan bireylerde bu önemli hücrelerin sayısında ve canlılığında hafif bir azalma olduğunu göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik doğru şekilde uygulandığı takdirde iki ila üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, iyi bir hücre canlılığını korumak için numunenin hızlıca işlenmesi ve hücrelerin tüm prosedür boyunca buz üzerinde tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, endoservikal intraepitelyal kompartman içindeki inflamatuar ve sinyal yolakları hakkında ek soruları yanıtlamak için, yüksek hassasiyetli yüksek kapasiteli multipleks PCR ile kombine edilmiş tek hücre ayıklama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, HIV ve enfeksiyöz hastalıklar alanındaki araştırmacıların mukozal savunmasızlığın yeni hücre markerlarını keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, insan endoservikal fırça örneğinden intraepitelyal lenfositlerin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

isolation-flow-cytometric-analysis-human-endocervical-gamma-delta-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Γδ T hücreleri periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) genişletmek için bir yöntem açıklanmıştır. Hücre-kökenli γδ T hücreleri uyarılır ve zoledronate ve interlökin-2 (IL-2) ile genişletilir. Γδ T hücrelerinin büyük ölçekli genişlemesi kanser otolog hücresel immünoterapi uygulanabilir.

Zoledronate İnsan Periferik Kan Genişleme γδ T Hücreler

Bu videoda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) düşük konsantrasyonlu CD4+Vδ1+γδ T hücreleri popülasyonunun manyetik etiketlemeye dayalı izolasyonu için bir protokol gösterilmektedir. FITC konjuge anti-Vδ1 antikorları, manyetik anti-FITC mikro boncuklar ve anti-CD4 antikor kaplı süperparamanyetik boncukların bir kombinasyonu kullanılarak, CD4 + Vδ1 + T hücreleri PBMC popülasyonundan başarılı bir şekilde saflaştırılabilir.

İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden CD4+ Vδ1+ γδ T Hücrelerinin Seçici İzolasyonu

Endoserviksten lenfositleri ve monositleri toplamak için sitobrush örneklemesinin kullanılması, kadın genital sistem bağışıklığının analizi için örnekler sağlayan minimal invaziv bir tekniktir. Bu protokolde, akım sitometri testleri için sitobrush örneklerinin toplanmasını ve immün hücre izolasyonunu tarif ediyoruz.

Toplama, İzolasyon, ve İnsan endoservikal Akışı Sitometrik Analizi

Burada, yakın zamanda gösterdiğimiz gibi, ekstratimik bir αβ T hücresi progenitörü olan periferik Vδ1+CD4+ T hücrelerinin kıt T hücresi varlığının izolasyonu ve klonlanması için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, bu hücrelerin ex vivo kültürde kantitatif olarak izole edilmesine, klonlanmasına ve verimli bir şekilde genişletilmesine izin verir.

İzolasyon ve<em&gt; Ex Vivo</emVδ1 of&gt; Kültür<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T hücrelerinin bir Extrathymic αβT hücre Progenitör

Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Biz burada yalıtmak ve phenotypical ve fonksiyonel özellikleri değerlendirilmesi için insan kadın üreme sistemi içinde farklı anatomik bölmeleri dendritik hücrelerden arındırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer bağışıklık hücreleri veya diğer Mukozal doku dendritik hücrelerden yalıtmak için adapte edilebilir.

İnsan dişi üreme yolu dendritik hücreler yalıtım Phenotypical ve fonksiyonel çalışmaları için

Burada, yalıtım ve CD4 karakterizasyonu için bir protokol+ T hücre alt kümeleri insan periferik kandan açıklanmıştır. Saf CD4+ T-hücreleri tarafından akış sitometresi T foliküler yardımcı hücresi alt kümeleri oranlarını belirlemek için analiz.

CD4 yalıtım+ T-hücreleri ve T foliküler Yardımcısı (cTfh) hücre alt kümeleri üzerinden periferik kan kullanarak 6-renk Akış Sitometresi Analizi, dolaşan

Klonal genleşme antijene özgü T hücre yanıtının önemli bir özelliğidir. Bununla birlikte, antijen yanıt veren T hücrelerinin hücre döngüsü, kısmen teknik sınırlamalar nedeniyle kötü bir şekilde araştırılmıştır. Aşılanmış farelerin dalak ve lenf düğümlerinde klonal olarak genişleyen antijene özgü CD8 T hücrelerini analiz etmek için bir akış sitometrik yöntemi açıklıyoruz.

Aşılanmış Farelerde Antijene Özgü CD8 T Hücrelerinin Hücre Döngüsü Analizi için DNA/Ki67 Tabanlı Akış Sitometrisi Tahlili

Bu, uterus lenfoid hücrelerini hem hamile hem de hamile olmayan farelerden izole etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, FACS fenotipleme, hücre sıralama, işlevsel tahliller, RNA-seq ve proteomik gibi birden çok aşağı akış uygulaması için kullanılabilir. Buradaki protokol, akış sitometrisi ile kandine doğuştan gelen lenfoid hücrelerin fenotip grup 1 rahiminin nasıl olduğunu göstermektedir.

Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

T hücresi sinyalizasyonunun bir ölçüsü olan kalsiyum akışı, T hücresi reseptör stimülasyonuna verilen yanıtları analiz etmenin etkili bir yoludur. Hint-1'i hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoklamak için kullanılan bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanır.

Primer Murin T-hücrelerinde T-hücresi Reseptörü Kaynaklı Kalsiyum Akışının Tam Spektrumlu Akış Sitometrisi ile Analizi

Mevcut protokol, önceden tedavi edilmiş tümör hücreleri ile allojenik bir ko-kültür sisteminde insan T hücresi stimülasyonunun ex vivo analizine izin veren deneysel bir iş akışını açıklamaktadır.

Önceden İşlem Görmüş Tümör Hücrelerinin Allojenik Ko-Kültür Ortamında İnsan T Hücresi Aktivitesinin Analizi

Öğrenin, insan endoservikal örneklerinden gamma delta T hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometrisi analizi yöntemini. Bu protokol, lokal immün yanıtları anlamak ve enfeksiyon önleme stratejileri geliştirmek için güçlü bir araç sunar.

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Daha fazla video keşfet