Bir Monosit Tek tabakalı Testi Kullanımı Fcy reseptör aracılı fagositoz değerlendirin

Bu in vitro fonksiyonel testin genel amacı, FC aracılı fagositozun çeşitli yönlerini değerlendirmektir. Bu yöntem, immünohematoloji ve kan transfüzyon tıbbı alanlarında, kırmızı kan hücrelerine karşı oto- ve allo-antikorların klinik önemi gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, kırmızı kan hücrelerine karşı önceden oluşturulmuş antikorları olan hastalarda transfüzyonun sonucunu tahmin etmek için in vitro olarak gerçekleştirilebilen fonksiyonel bir biyolojik test sağlar.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Cindy Tong olacak. Artık insan kanı ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman koruyucu önlük ve eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Damar delinmesi ile asit sitrat dekstroz içeren vakutainer tüplerde sağlıklı bir donörden bir ila iki adet 10 mililitre tam kan örneği alındıktan sonra, tüpler sınıf II biyogüvenlik kabinine yerleştirilir ve kan, ılık tam ortamda bire bir oranında seyreltilir.

Ardından, katmanları karıştırmamaya dikkat ederek, kan hücrelerini bir santrifüj tüpünün kenarlarından oda sıcaklığındaki yoğunluk gradyanına yavaşça pipetleyin. Hücreleri santrifüjleme ile ayırın. Ardından, üst plazma katmanını atın ve buffy coat içeren PBMC'yi 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarmak için bir cam Pasteur pipeti kullanın.

İzole edilmiş PBMC'leri PBS'de üç kez yıkayın ve üçüncü santrifüjlemeden sonra hücreleri üç ila yedi mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Saydıktan sonra, hücreleri tam ortamda mililitre konsantrasyonunda 1.75 kez 10 ila altıncı hücreye seyreltin ve 37 santigrat derecede bir saatlik inkübasyon için sekiz odacıklı bir slaytın her bir oyuğuna 400 mikrolitre hücre tohumlayın ve% 5 CO2 tam nem ile. R2R2 kırmızı kan hücrelerini opsonize etmek için önce kırmızı kan hücrelerini PBS'de üç kez yıkayın.

Üçüncü santrifüjlemeden sonra R2R2 peletini, aralıklı karıştırma ile 37 santigrat derecede bir saatlik bir inkübasyon için insan serumundan poliklonal anti-D antikorları ile bire bir oranında seyreltin. Opsonizasyonun sonunda, hücreleri inkübatörden çıkarın ve daha sonra gösterildiği gibi PBS'de üç kez daha yıkayın. Peleti tam RPMI ortamında hacimce %1.25'e kadar yeniden süspanse edin.

Daha sonra, sekiz odacıklı slaydın her bir oyuğundan süpernatanı, 37 santigrat derecede iki saat boyunca 400 mikrolitre opsonize R2R2 hücresi ile değiştirin. İnkübasyonun sonunda, fazla R2R2'yi bir kağıt havluyla hafifçe vurarak hazneleri çıkarmak için sürgülü adaptörleri kullanın. Şimdi, 100 mililitrelik bir kabı PBS ile doldurun ve fagositozlanmamış R2R2'nin çoğunu çıkarmak için her slaytı 30 ila 40 kez tuz çözeltisine yavaşça batırın.

Kuruduktan sonra, slaytları 45 saniye boyunca %100 metanol içinde sabitleyin ve numuneleri lamel ile monte etmeden önce hücrelerin kurumasını bekleyin. Ertesi gün, her slaydı 40X objektif lensli bir faz kontrast mikroskobuna yükleyin ve aynı anda monosit sayısını ve fagositozlu R2R2 hücrelerinin sayısını aynı anda ölçmek için her bir eldeki bir sayaç kullanarak en az 200 monosit ve her bir monosit içindeki fagositozlu R2R2 sayısını manuel olarak sayın. İntravenöz immünoglobulin, fagositozu doza bağlı bir şekilde inhibe eden FC reseptörlerine bağlanır ve bloke eder, mililitre başına 200 mikrogram intravenöz immünoglobulin konsantrasyonlarından başlayarak yaklaşık% 100'lük bir inhibisyon gözlenir ve inhibitörün 0.5 mikrogramının altındaki konsantrasyonlarda neredeyse hiç inhibisyon gözlenmez.

Fagositik indeksler R2R2 pozitif kontrolüne %0 inhibisyon olarak normalize edildiğinde, mililitre başına üç mikrogramlık bir IC 50 ile bir inhibisyon eğrisi belirlenebilir. Tecrübe ile, monositleri kontamine kırmızı kan hücrelerinden ve vakuolleri fagositozlu kırmızı kan hücrelerinden ayırt etmek için faz kontrast mikroskobu kullanılabilir. R2R2 kırmızı kan hücrelerinin kantitifikasyonu ve aşırı opsonizasyonu sırasında yoğun hücre kümelerinden ve döküntülerden kaçınılmalıdır, bu da monosit içini aşırı kalabalıklaştıran ve doğru bir fagositik analize müdahale eden yüksek bir fagositoza yol açabilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa altı ila sekiz saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, fagositik protein ekspresyonu, kırmızı kan hücresi etkileşimleri ve bölümlendirme ile ilgili ek soruları yanıtlamak için konfokal mikroskopi kullanılarak immünositokimya veya immünofloresan gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. İlk gelişimi ve daha fazla optimizasyonu ile bu teknik, transfüzyon tıbbı ve hücre biyolojisi alanlarındaki araştırmacıların opsonizasyon sistemlerini keşfetme şeklini bilgilendirecektir.

Bu videoyu izledikten sonra, fagositozu tetikleyen antikor etkileşimi türlerini değerlendirmek için bir monosit tek katmanlı testin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.