Situ Algılama ve Metal Oksit nano tanecikleri nükleer Microprobe analizi ile tek hücre miktar

Nanopartiküller, benzersiz fizyokimyasal özellikleri nedeniyle endüstride ve tıpta giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, uzun süreli nanopartikül maruziyeti ile ilişkili insan sağlığı ile ilgili endişeler devam etmektedir. Bu riskler, hücrelerin içindeki nanopartiküllerin davranışını ve hücrelerin nanopartiküllere karşı indüklenen metabolik tepkilerini inceleyerek ölçülebilir.

Bu kısmen, bir sinkül hücresinde içselleştirilmiş nanopartiküllerin tespit edilmesine ve nicelleştirilmesine izin veren yöntemlerin eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Mikroskopi ve kütle spektrometresi de dahil olmak üzere çok sayıda analitik araç, nanopartiküllerin hücresel alımını tahmin etmek için kullanılabilirken, bunlar yalnızca mikroskobik düzeyde kalitatif bilgi sağlar. Aksine, atomik spektroskopiye dayalı yerinde yöntemler, numune hazırlamadan kaynaklanan görüntüleme artefaktlarının miktarını azaltabilir ve nanopartiküllerin doğrudan gözlemlenmesini sağlayabilir.

Bundan yararlanmak için, nanopartikülleri doğal durumda veya laboratuvar yatağında bir floresan etiketi ile incelememize izin veren bağıntılı bir yaklaşım sunuyoruz. Burada, floresan mikroskobu ve nükleer mikroprob analizinin kombinasyonuna dayanan bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, hücresel yoğunluğun, kimyasal elementin özel dağılımının ve hücre başına nanopartikül miktarının görüntülerini sağlar.

Bir gösteri olarak, hem floresan mikroskobu hem de nükleer mikroprob analizi kullanarak 24 saat boyunca titanyum dioksit nanopartiküllerine maruz kalan hücrelerden araştırma yapacağız. Bu protokol için, polimer PEEK ile yapılmış özel bir numune tutucuya ihtiyaç vardır. Hücre kültürü ve in vitro gözlemler için uygun olmalıdır.

Tutucuyu iki mikron kalınlığında polikarbonat folyo ile örtün. Polikarbonat folyo, ince bir Formvar çözeltisi tabakası ile PEEK kabına yapıştırılır. Monte edildikten sonra numune tutucunun sterilize edilmesi gerekir.

Birden fazla steril numune tutucu, kullanım için ihtiyaç duyulana kadar steril on iki oyuklu bir plakada her oyuk için bir tane olmak üzere saklanabilir. Matris sırası GFP plazmitleri ile transfekte edilen hücreler, transfeksiyonun başarılı bir şekilde gerçekleştiğinden ve floresan proteini eksprese ettiklerinden emin olmak için floresan mikroskobu ile kontrol edilir. Hücreleri tripsin ile hasat edin ve 37 santigrat derecede üç dakika inkübe edin.

Taze kültür ortamı ekleyerek tripsin etkisini durdurun. Hücreleri, dört santigrat derecede dakikada 1200 devirde beş dakika santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve uygun miktarda taze kültür ortamı ekleyin.

Hücreleri sayın ve mikrolitre başına 500 hücrelik bir hücre süspansiyonu elde etmek için taze ve termostatlı tam kültür ortamı ile bir seyreltme gerçekleştirin. Polikarbonat folyonun ortasına 40 mikrolitrelik bir damla yerleştirin. Numuneyi iki saat boyunca hücre inkübatörüne dikkatlice yerleştirin.

Yavaşça iki mililitre taze kültür ortamı ekleyin ve 24 saat bekletin. Floresan modifiye titanyum oksit nanopartikülleri, nanopartikülleri in vitro olarak tespit etmek, izlemek ve lokalize etmek için yaygın olarak kullanılan floroforlarla tasarlandı, sentezlendi ve aşılandı. Bu adım için, mililitre başına bir miligram konsantrasyona sahip ultra saf suda bir titanyum dioksit nanopartikül süspansiyonu zaten hazırlanmış olmalıdır.

Oda sıcaklığında bir dakikalık uzun yoğun sonikasyon darbeleri kullanarak nanopartikülleri dağıtın. Santimetre kare başına dört mikrogramlık bir maruz kalma süspansiyonu elde etmek için nanopartikülleri uygun bir kültür ortamında seyreltin. Önceki hücre kültürü ortamını bu yeni nanopartikül içeren ortama geçirin ve homojen bir nanopartikül dağılımı elde etmek için hafifçe karıştırın.

Titanyum dioksit nanopartikülleri eklenmeden aynı şekilde bir dizi kontrol hücresi hazırlayın. Hücre popülasyonlarını 24 saat boyunca inkübe edin. Paraformaldehit kullanılarak, bu numuneler floresan mikroskobu kullanılarak yerinde ve tek hücreli görüntüleme için sabitlenebilir ve işlenebilir.

Bununla birlikte, kriyojenik fiziksel fiksasyon, hücre üst yapısını ve biyokimyasal bütünlüğünü korur. Daldırmalı dondurma fiksasyonu, hücresel aktiviteyi milisaniyeler içinde hızla durdurur ve fiksatif bileşiklerin kullanılmasını önler. Hücreleri kriyojenik olarak sabitlemek için aşağıdakileri gerçekleştiririz.

Sıvı nitrojen içinde soğutarak bir alüminyum transfer plakası hazırlayın. Plakayı sıvı nitrojenle dolu bir kutuda saklayın ve plaka yüzeyini soğuk nitrojen buharında sıvının üzerinde tutun. Yeterli miktarda 2-metilbütan 150 santigrat dereceye kadar soğutun.

Kültür ortamı ile bir adet 50 mililitre Şahin ve ultra saf su ile iki Şahin hazırlayın. Dondurmadan önce numuneyi kurutmak için emici kağıdın yakınınızda olduğundan emin olun. Kültür ortamında kalan fazla tuzları uzaklaştırmak için hücreleri bir kez kültür ortamında ve ardından iki kez daha steril, ultra saf suda durulayın.

Numuneyi emici kağıt üzerinde hızlı bir şekilde kurutun. Hücreleri soğutulmuş 2-metilbütan içinde 30 saniye daldırarak dondurun ve soğutulmuş alüminyum transfer plakasına yerleştirin. Su buharının soğuk plaka yüzeyinde yoğunlaşmasını önlemek için kutunun mümkün olduğunca kapalı tutulması çok önemlidir.

Tüm numuneler dondurulduktan sonra, herhangi bir suyu süblimleştirmek için aşağıdaki yöntemle dondurarak kurutma gerçekleştirilir. İlk olarak, düşük basınç ve düşük sıcaklıkta 12 ila 24 saat boyunca birincil kurutma gerçekleştirin. Daha sonra, basıncı düşük tutarak, plaka sıcaklığı 40 santigrat dereceye yükseltilerek en az 24 saat boyunca ikincil bir kurutma aşaması gerçekleştirin.

Kriyofiksasyondan sonra numuneler, toz ve nemden korunan steril ve kuru koşullarda birkaç gün oda sıcaklığında saklanabilir. Nükleer mikroprob analizi, Fransa'nın Bordeaux kentindeki Ifera tesisinde gerçekleştirildi. 3,5 megavoltluk bir singletron parçacık hızlandırıcısı, megaelektron volt enerji aralığında bir ışık iyon demeti sağlar.

Kimyasal element görüntülemesi, tamamlayıcı iyon demeti analitik teknikleri kullanılarak mikroprob huzme hattı üzerinde gerçekleştirilmiştir. Mikro-PIXE, parçacık kaynaklı X-ışını emisyonu, STIM, taramalı iletim iyon mikroskobu ve mikro-RBS, rutherford geri saçılma spektrometresi aracılığıyla kullanılan teknikler. Numuneler analiz odasının içine yerleştirilir ve farklı iyon ışını analizleri gerçekleştirmek için farklı parçacıklarla vakum altında ışınlanır.

STIM, hücrelerin farklı yoğunluklara sahip bölgelerinden gevşek geçen enerji parçacıklarına dayalı olarak hücrelerin havadan yoğunluk haritalarını kaydetmek için kullanılır. Mikro-PIXE ve mikro-RBS analizi, kimyasal elementlerin tek hücre düzeyinde uzamsal dağılımını ve miktar tayinini sağlar. 1.5 megaelektron voltluk bir proton mikro ışını, yaklaşık 1 mikrometrelik bir çapa odaklanır ve STIM tarafından tanımlanan ilgili hücreler boyunca taranır.

Numunede bulunan ve sodyumdan titanyuma kadar değişen atomlardan yayılan X ışınları, element konsantrasyonlarının belirlenmesine izin verir. Geri saçılan protonlar, X-ışını yoğunluklarını normalleştirmek için gereken toplam gelen parçacık sayısını ölçmek için toplanır. X-ışını dedektörü yanıtını kalibre etmek için element konsantrasyonlarının miktarının belirlenmesi için sertifikalı kalibrasyon standartlarına sahip olmak çok önemlidir.

İyon ışını verilerini analiz etmek için ImageJ için yeni bir eklenti geliştirdik. İlk olarak STIM yoğunluk haritaları hesaplanmıştır. Tarama iletimi demir mikroskobu görüntülerindeki kontrast, yoğunluktaki yerel farklılıklardan kaynaklanır ve çekirdek ve sitoplazma gibi hücre yapılarının tespit edilmesini sağlar.

Aynı anda birkaç harita işlenebilir. Her harita, gelen parçacıklardan iletilen ortama iletilen enerjiye karşılık gelir. Veri analizindeki ikinci adım, bireysel hücre spektrumlarının hesaplanmasından oluşur.

Parçacık kaynaklı X-ışını emisyon analizi, hem numunenin kimyasal bileşimini hem de kimyasal elementlerin temel haritalarını verir. Kimyasal element haritaları, fotonların kayıt sırasındaki ışın konumuna göre sıralanmasından ve belirli bir element etrafında merkezlenmiş bir enerji penceresi seçilmesinden sonra hesaplanır. Haritalar genellikle ışın konumunda tespit edilen olayların sayısını temsil eder ve nicel veriler içerir.

Seçilen her element için bir tane olmak üzere bir kimyasal harita yığını hesaplanır. Her hücre için ilgi alanları, fosfor için PIXE verileri kullanılarak bulunur. Her bir tam hücreye karşılık gelen spektrumlar daha sonra her bir hücrenin ilgilenilen bölgesindeki bireysel spektrumların toplanmasıyla hesaplanır.

Buradan, her hücredeki kimyasal bolluklarla ilgili nicel veriler, özel PIXE ve IBS analiz yazılımı kullanılarak çıkarılabilir. Burada paraformaldehit fiksasyonundan sonra hücrelerin floresan görüntülerini gösteriyoruz. Üst sıra, titanyum dioksit nanopartiküllerine maruz kalmamış hücreleri gösterirken, alt sıra olmuştur.

Mavi kanal hücre çekirdeğini, yeşil kanal mitokondriyi ve kırmızı kanal titanyumu gösterir. Kontrollerde titanyum dioksit bulunmadığı açıkça görülebilir. Sağdaki birleştirilmiş kanaldan, nanopartiküllerin yalnızca sitoplazmada bulunduğu ve mitokondriden çıkarıldığı görülebilir.

Bununla birlikte, bu yöntemde eksik olan şey, nanopartikül konsantrasyonu hakkında nicel bilgidir. Nükleer mikroprob analizi bunu sağlamayı umabilir. Bu görüntülerin tümü çeşitli mikroprob analiz teknikleri kullanılarak alınmıştır.

Yine üst sıra kontrol hücrelerini, alt sıra ise titanyum nanopartikülleri içeren hücreleri göstermektedir. En soldaki resim, kriyojenik olarak sabitlenmiş hücrelerin yoğunluğunun STIM ölçümlerini göstermektedir. Aşağıdaki üç panel, PIXE tarafından elde edilen hücrelerde bulunan potasyum, fosfor ve titanyum bolluğunu göstermektedir.

Yine, kontrollerde veya hücre çekirdeğinde hiçbir titanyum görünmez. Titanyumun alımını hücre hücre ölçmek için, en sağdaki panelde gösterilen hücre sınırlarına göre ilgi bölgelerini tanımlar ve bu bölgelerdeki element bolluklarını ölçeriz. Bu PIXE ölçümlerinden, kontrol ve maruz kalan popülasyonlar için tek hücre düzeyinde element bolluklarının dağılımını çizdik.

Kontrol popülasyonu beyaz renkle çizilir ve maruz kalan popülasyon sarı renkle çizilir. Burada bulunan titanyumun medyan içeriği, santimetre kare başına dört mikrogram maruz kalma dozuna kıyasla oldukça düşüktür. Titanyum alım aralığı, popülasyon genelinde santimetre kare başına 0.2 mikrogramdan santimetre kare başına 1.8 mikrograma kadar büyük bir varyasyon göstermektedir.

Ayrıca, nanopartiküle maruz kalan örneklerde potasyum ve kalsiyum gibi serbest hücre içi iyonların arttığını fark ettik, bu da titanyum dioksit nanopartiküllerinin varlığının neden olduğu hücresel homeostazda bir değişiklik olduğunu düşündürdü. Nükleer mikroprob analizi, hücre altı seviye hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir ve biyolojik bir numuneyi oluşturan kimyasal elementlerin miktar tayinini sağlar. Bu teknikler birçok avantaj sunar.

Birincisi, kimyasal fiksasyon gerektirmeyen numune hazırlamada. İkincisi, ek ilgi alanlarına odaklanma yeteneği ile daha geniş alanları inceleme imkanı. Üç, kimyasal elementlerin gram başına birkaç mikrogram hassasiyetle miktarının belirlenmesi.

Ve dördüncüsü, çekirdek, nükleol ve sitoplazma gibi hücre bölmelerinin tanımlanması. Nanopartiküllerin tek hücrelerde içselleştirilmesini incelerken bunların doğru bir şekilde belirlenmesi, kantitatif nanopartikül toksikolojisi için esastır. Burada incelenen vakalarda gösterildiği gibi, tek tek hücreler içindeki nanopartikülleri gözlemleme ve ölçme yeteneği, metal oksit nanopartikülleri gibi endojen ve eksojen kimyasal elementlerin değer birikimini daha iyi anlamamızı sağlar.

Bu protokol, canlı hücrelerle nanopartikül etkileşiminin gelecekteki çalışmaları için nükleer mikroprob analizinin uygunluğunu vurgulamaktadır. Kantitatif yaklaşım, bu nanopartiküllerin tespit, tanımlama, lokalizasyon ve miktar tayini açısından ve hem doğal hem de kimyasal modifiye nanopartiküller için tek hücre düzeyinde etkisi hakkında bilgi verir.