İndaktif Plazma - - Lazer Ablasyon Beyin Dokusu Görüntüleme Metaller Kütle Spektrometresi (LA-ICP-MS)

Bu yöntemin genel amacı, lazer ablasyon indüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometrisi kullanarak doku kesitlerindeki metallerin uzaysal dağılımını nicelleştirmektir. Bu yöntem, hem temel biyoloji hem de hastalık araştırmalarındaki temel soruları, özellikle metal biyokimyasının hastalık patolojisinde rol oynadığı durumlar için yanıtlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, geleneksel metal analiz teknikleri kullanıldığında genellikle kaybolan metallere ilişkin uzaysal bilgileri korumasıdır.

Bu tekniğin etkileri, hücre ölümünün görüldüğü beyin bölgelerinde metallerin nasıl değiştiğini izlememize olanak tanıdığı için nörodejeneratif hastalıkların tedavisine ve teşhisine kadar uzanmaktadır. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, uzun ve karmaşık deneyleri kurarken zorluk yaşayabilirler. Deneyi tasarlamak ve verileri analiz etmek zorlayıcı olabildiğinden ve her adımın belirli bir sırayla yürütülmesi gerektiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.

Öncelikle, bir beyin doku örneğini ve matrisle eşleştirilmiş tüm doku standartlarını lazer ablasyon haznesine yerleştirin. Örneklerin LACCD kamera alan derinliği içinde olduğundan emin olun. Hazne kapısını kapatın ve vidaları elinizle sıkın.

Ardından, ICPMS yazılımında taşıyıcı gaz valfini açın ve akış hızını dakikada 1,2 litre olarak ayarlayın. LA yazılımında, ablasyon hücresini taşıyıcı gaz ile 30 dakikalık bir temizleme işlemine tabi tutun. İki hacimli bir ablasyon hücresi için, hücrede kalan hava miktarını azaltmak amacıyla her on dakikada bir numune tablasını haznenin her bir köşesine taşıyın.

ICPMS'i açın ve cihazın iki saat boyunca ısınmasını bekleyin. Cihaz ısınırken, lazer ablasyon yazılımında ilk doku standardının yüzeyi boyunca yaklaşık üç milimetre uzunluğunda bir ablasyon hattı çizin. Ablasyon hattına tıklayarak varsayılan ışın çapını, tarama hızını ve ışınım akısını ayarlayın.

Çizgiyi altı kez çoğaltın ve çizgileri ışın çapı kadar aralıklarla yerleştirin. Bu işlemi her standart için tekrarlayın. Ardından, standartlarla aynı parametreleri kullanarak, çizgi aracını kullanarak örneğin sol üst köşesinden başlayıp en geniş noktasından geçecek şekilde örnek üzerindeki ablasyon alanını çizin.

Standartlarda kullanılanla aynı aralıkta, numunenin tamamen kapsanması için gerektiği kadar çizgiyi çoğaltın. Ardından, numunenin taranmasından sonra en geç 20 saat içinde veya her numune arasında standartların ara ara taranması için bir dizi çizgi çizin. Deneyin sonuna standartların bir taramasını ekleyin.

Hat uzunluğuna ve tarama hızına dayanarak, numune ve standart hatları için analiz süresini belirleyin. Ardından, ICPMS yazılımında yeni bir seri (batch) oluşturun ve zaman çözünürlüklü analiz seçeneğini belirleyin. İlgilenilen kütle/yük oranı değerlerini seçin ve bir döngü için toplam entegrasyon süresi 0.25 saniye olacak şekilde her bir oran için entegrasyon sürelerini ayarlayın.

Yığını kaydedin. Standart bir yığın için, lazer ısınma ve yıkama sürelerini hesaba katmak adına her satırın analiz süresini 15 saniyelik ek bir tampon süreyle doldurun. Her standart satırı için bir veri toplama işlemi içeren bir örnek çalıştırma listesi oluşturun.

Numune grubu için, standart grubu çoğaltın ve süreleri ile kazanım sayılarını numune ablasyon paternine göre uygun şekilde ayarlayın. ICPMS ısındıktan sonra, ilk grubu sıraya ekleyin ve yazılımın LA cihazından tetikleme beklediğinden emin olun. Ardından, LA yazılımında lazer güç kaynağını açın, lazer ısınma ve yıkama sürelerini ayarlayın.

Lazer sekansını başlatın ve ablasyon sonrası ICPMS'in veri toplamaya doğru şekilde başladığını kontrol edin. Veriler toplandıktan sonra, standartlara ait verileri CSV dosyalarından çıkarın. Çekim baz hattı düzeltmelerini gerçekleştirin ve arka plan sinyalini hariç tutun.

Doku standartlarındaki deliklerin neden olduğu sinyal düşüşlerini belirleyin. Bu düşük sinyalli alanları maskeleyin ve ardından verileri bir hesap çizelgesi olarak dışa aktarın. Tanımlanan her element için CPS'den PPM'ye bir dönüştürme faktörü hesaplayın.

Bu işlemi her bir standart için tekrarlayın. Ardından, kantitatif görüntü oluşturma yazılımını açın ve CSV dosyalarındaki örnek verilerini içe aktarın. Arka plan düzeltmesini uygulamak için arka plandan birkaç alan seçin.

Grafik düzenleme aracını seçin, görüntüye sağ tıklayın ve görüntü görünümünü değiştir seçeneğini belirleyin. Arka plan sinyalini iyileştirmek için Z'deki ilk rengi büyük bir negatif değerle değiştirin ve tamam'a tıklayın. Ardından standartlar sekmesinde, her bir standart için CPS PPM düzeltme faktörlerini girin ve başlat'a tıklayın.

Veri sekmesindeki veri tarayıcısını açın, düzeltilmiş bir görüntü dosyasına sağ tıklayın ve yeni görüntü seçeneğine tıklayın. Görüntü görünümünü değiştirme penceresini açarak renk tablosunu ve ölçeği ayarlayın. Görüntüye bir renk ölçeği yerleştirmek için açıklama ekleme aracını kullanın.

Renk ölçeği penceresinden renk ölçeğini ayarlayın. Görüntü renklendirildikten ve açıklama eklendikten sonra, görüntüyü başka bir programa kopyalayıp yapıştırın veya görüntü oluşturma yazılımından dışa aktarın. ROI araçlarını etkinleştirmek için analiz paketlerinden görüntü işlemeyi seçin ve bir görüntü belirleyin.

Görüntü sekmesinde ROI'ye tıklayın ve ROI çizimini başlatın. İlgi bölgesini seçin ve ardından ROI'yi bitir'e tıklayın. ROI verilerini elde etmek için görüntü sekmesinde istatistiklere tıklayın.

Verileri bir hesap tablosuna kopyalayıp yapıştırın ve her ROI eklendiğinde kaydettiğinizden emin olun. İşlemi gerektiği kadar tekrarlayın. Bu teknik kullanılarak vahşi tip bir fare beyninin metal içeriği ve dağılımı incelenmiştir.

Burada karbon, magnezyum ve fosfor dağılımları saniye başına sayım cinsinden gösterilmiştir. Manganez, bakır, demir ve çinko için kantitatif görüntüler sunulmuştur. Karbon dağılımı internal standart olarak kullanılmıştır.

Demir, orta beyinde ve dentat girusda en yüksek miktarda bulunmaktaydı. Çinko ise en çok kortikal bölgelerde görülmekteydi. Bu görüntülerden elde edilen bilgiler, metal bağlayan proteinlerin ekspresyonunu ve işlevselliğini takip etmek için kullanılabilir. Yöntem kavrandıktan sonra, uygun şekilde yürütüldüğünde, birkaç gün süren bir deney bir saat içinde kurulabilir.

Bu prosedürü uygularken, ablasyon hatlarınızı ve veri dosyalarınızı ICPMS ile senkronize etmeniz önemlidir. Bu prosedürün ardından, metallerin spesifik proteinlerle kolokalizasyonu gibi ek bilgiler sağlamak amacıyla, bitişik kesitler üzerinde histolojik boyama gibi ek yöntemler uygulanabilir. Bu yöntem fikri ilk olarak, Parkinson hastalığının laboratuvar modellerinde metal seviyelerinin nasıl değiştiğini incelemek istediğimizde ortaya çıkmıştır.

Bu yöntem nörodejenerasyon hakkında bilgi edinmek için kullanılabildiği gibi, insan dokusu da dahil olmak üzere farklı doku türleri ve hastalık durumları ile bir dizi biyolojik matris için de kullanılabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların hem insan örneklerinde hem de hastalıkların hayvan modellerinde metal seviyelerinin nasıl değiştiğini incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, lazer ablasyon ICPMS deneyinin nasıl kurulacağı konusunda oldukça iyi bir fikre sahip olmalısınız.

Biyolojik materyallerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu donanım giymek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.