Bir Gel Yüzeyinde Büyüyen Bitki kökleri Işık Sac Flüoresan Mikroskopi

Bu prosedürün genel amacı, ışık tabakası mikroskobu kullanarak bir bitki kök sisteminin uzun vadeli gözlemlerini elde etmektir. Bunu başarmak için, nazik bir numune hazırlama yöntemine, kontrollü yetiştirme koşullarına ve ışık tabakası mikroskobu gibi bitki gelişimini değiştirmeyen bir görüntüleme tekniğine sahip olmak çok önemlidir. Başlamak için, bitkiler iki milimetre inceliğinde bir jel tabakasının yüzeyinde yetiştirilir.

Aribidopsis fidesi içeren jel daha sonra kesilir, kepçelenir ve mikroskop numune tutucusuna aktarılır. Mikroskobun içinde bitki doğal dik pozisyonunda büyür. Yapraklar havada kalırken kökler sıvı bir ortamda büyür.

Bir aydınlatma sistemi sadece yaprakları aydınlatır. Kökleri karanlıkta tutmak için su yüzeyi kaplıdır. Bu tekniğin, kökü jelin içine gömmek gibi mevcut yöntemlere göre en önemli avantajlarından biri, bir jelin yüzeyinde bitki yetiştirmeye alışkın olmamızdır.

Bu nedenle, daha önce olduğu gibi aynı büyüyen protokole bağlı kalabiliriz. İkincisi, kök, örneğin ilaç tedavileri için değiştirilebilen sıvı ortamla doğrudan temas halindedir. Yaklaşık 2 milimetrelik bir tabaka oluşturmak için kare bir petri kabına yüzde 1.5 fitojel içeren 30 mililitre taze otoklavlanmış yarı mukavemetli MS ortamı dökün.

Steril tohumları aralarında en az bir santimetre boşluk olacak şekilde yan yana ekin. Ardından plakayı mikro gözenekli bir bantla sarın. Plakayı büyüme inkübatörünüzde 10 güne kadar dikey olarak yetiştirin.

Bu deneyde, yanal köklerin gelişimini gözlemlemek için altı günlük bitkiler kullanıyoruz. Numune tutucuyu 3D yazdırmak için bir model sunuyoruz. Farklı malzemeleri test ettik.

Şeffaf reçineler, sertlik ve su direnci açısından en uygun olanıydı. Katı malzemeden bir numune tutucuyu işlemek için boyutların ayrıntılı bir açıklaması el yazmasında açıklanmıştır. Bir neşter kullanarak bitkinin etrafındaki jeli kesin.

Ardından, bitkinin üzerinde büyüdüğü jel bloğunu alın ve dikkatlice numune tutucuya doğru çekin. Yüzde 1 aggrosu 80 santigrat derecede eritin ve 33 santigrat dereceye kadar soğutun. Jel bloğunu numune tutucuya yapıştırın ve bitkiyi jelin üzerine dikkatlice yapıştırın.

Bitkinin konumunu doğrulamak için bir stereo mikroskop kullanın ve ilgilenilen bölgenin herhangi bir jel ile kaplanmadığından emin olun. Bitkinin kurumasını önlemek için, numune tutucuyu mümkün olduğunda 1.000 mikrolitrelik bir pipet ucuna kaydırın. Tutucuyu bir pipet kutusuna koyun ve gerekirse daha fazla numune hazırlayın.

Mikroskobumuz, büyük bir modifikasyon içermeyen klasik bir açık dönüştür. Mikroskop içinde bitkileri kültürlemek için bir aydınlatma sistemi uyguladık. Kırmızı ve mavi LED'ler bir halka şeklinde düzenlenmiştir.

Yönlü aydınlatma için LED çiftleri ayrı ayrı açılıp kapatılabilir. Aydınlatma sisteminin spektrumu, büyüme odalarımızdakiyle eşleşir. LED'lerden gelen aydınlatmanın neredeyse tamamı GFP için emisyon filtresi tarafından engellenir.

Kameraya ulaşan herhangi bir dağınık ışık tespit edemedik. Bu nedenle, görüntüleme sırasında ışık açık tutulabilir. Işık yoğunluğu, saniyede metre kare başına 30 ila 250 mikro mol arasında ayarlanabilir.

Açık döndürme aşaması kolunun alt tarafındaki LED halkasını vidalayın veya yapıştırın. Mikroskoba geri monte edin ve kabloları bağlayın. Bolluk sistemini monte edin.

Tüpleri numune odasına tek yönlü bir düzenlemeyle bağlayın. Hızı dakikada bir mililitreye ayarlayın. Steril bir siyah plastik folyonun üç milimetre karesini ekleyin ve bunları su yüzeyine dağıtın.

Numuneyi mikroskoba yerleştirin. Numune tutucuya yapışan plastik tabaka olmadığını doğrulayın. Hazneyi siyah alüminyum folyodan yapılmış iki kapakla kapatın.

Işığı açın ve ışık yoğunluğunu ayarlayın. Oda ışığını kapatın ve kayda başlayın. Bu yöntem, burada bir yanal kökün büyümesi ile sunulan, birkaç saatten günlere kadar kök büyümesinin kaydedilmesine izin verir.

Tek bir zaman noktasının z-yığınının görüntüleri, iyi optik kesit özellikleri gösterir. Yanal kök oluşumunun tüm sürecini 3D olarak yakaladık, bu da bu sürecin dinamiklerini incelememize izin veriyor. Bu kaydın tek bir dilimine bakmak, kökün derinliklerinde bile iyi bir çözünürlük gösterir.

Bu videoyu izledikten sonra, ışık tabakası mikroskobu için bitki numunesi hazırlama yöntemini net bir şekilde anlamış olmalısınız. Bu protokolü takiben, artık organogenez, bitki tropizmleri veya bitki adaptasyonu sırasında hücre içi protein lokalizasyonuna veya gen ekspresyon modellerine bakabiliyoruz. Bu, bitki gelişiminin mekansal-zamansal düzenlemesini anlamamıza yardımcı olacaktır.