Otopsi İnsan beyni Donörleri gelen leptomeninkslerde Eksplantasyon Kültürlerin türetilmesi

Ben Birgitt Schule, Parkinson Enstitüsü ve Klinik Merkezi'nde Beyin Bağışı Programı Direktörüyüm. Bu videoda, Parkinson hastalığı olan hastalardan alınan postmortem insan beyninin leptomeninglerinden elde edilen bir eksplant hücre kültürü ve primer fibroblast süresi için bir teknik anlatılmıştır. Bu fibroblastlar, hücre bazlı tahliller de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.

Bu önemlidir, çünkü Lewy cisimciği patolojisi olan sporadik Parkinson hastalığının otopsi ile kanıtlanmış vakalarından elde edilen hücre dizilerini inceleyebiliriz. Gerekli tüm malzemeleri doku kültürü başlığına yerleştirerek başlayın. Kaputa giren tüm nesnelere %70 etanol püskürtülmeli ve silinmelidir.

İlk adım, meninksleri tüpten kesme kabına aktarmaktır. 10 santimetrelik steril bir kesme kabına yaklaşık 10 mililitre fosfat tamponlu salin dökerek başlayın. Burada meninksleri görebilirsiniz.

Steril forseps kullanarak, meninksleri dikkatlice kesme kabına aktarın. Yırtılmayı önlemek için bu adımı yavaşça gerçekleştirin. Bir sonraki adım, mümkün olduğunca fazla kanı çıkarmak için meninksleri PBS'de yıkamaktır.

Numuneniz çok kanlıysa, başka bir kesme kabına aktarmayı düşünebilirsiniz. 10 santimetrelik taze bir tabağa 10 mililitre daha PBS ekleyin. Meninkslerden kanı almaya devam etmek için bu yıkamayı tekrarlayın.

Son olarak, meninksleri PBS içeren 10 santimetrelik taze bir tabağa aktarın. Bittiğinde, tabağın üzerini örtün ve laminer akış başlığındaki diseksiyon mikroskobuna aktarın. Bu sonraki adım, meninksleri daha küçük parçalara ayırmaya devam etmektir.

İki steril neşter kullanarak, sığ bir kazıma hareketiyle kan damarlarını meninkslerden nazikçe ayırın. Bu resimde gösterildiği gibi kabaca 18 adet 3 milimetreye 3 milimetrelik parçalar kesecek kadar büyük bir alan hazırlayın. Daha sonra neşteri alın ve sallanma hareketi kullanarak hazırlanan bölgeyi 3 milimetreye 3 milimetrelik parçalar halinde bölün.

Bunu, önce meninksleri daha büyük parçalara ayırarak ve ardından bu parçaları daha küçük parçalara ayırarak aşamalı bir işlemle yapmak daha kolaydır. Kesme kabını kapatın ve tekrar doku kültürü başlığına aktarın. Daha sonra, meninksleri 30 ila 60 dakika boyunca 1 mililitre yüzde 0.1 jelatin ile oldukça kaplanmış altı oyuklu bir doku kültürü plakasına aktarmaya hazırlanın.

Her oyuğa bir mililitre meninks ortamı ekleyin. Daha sonra, steril forsepslerle, her bir kuyucuğun ortasına üç ila dört meninks parçası aktarın. Bu plaka üzerinde büyüyen hücreler bir geçit sıfır olacaktır.

Bir sonraki adım, meninks parçalarının sabit kalmasını ve kültür kabı ile temas halinde kalmasını sağlamak için lameller kullanır. Meninks parçalarının üzerine steril 15 milimetrelik dairesel bir lamel yerleştirin. Gerekirse, meninks parçalarını bir lamel ile yeniden konumlandırın.

Ardından, forsepsleri kullanarak, parçaların plakaya temas ettiğinden emin olmak için lamel üzerine sıkıca bastırın. Bu görüntü, bir lamel ile yerinde tutulan meninks parçalarını göstermektedir. Kapağı altı oyuklu plakanın üzerine yerleştirin ve plakayı dikkatlice 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite ayarlanmış bir inkübatöre aktarın.

Kültürde iki gün geçirdikten sonra, her bir oyuğa bir mililitre daha taze meninks ortamı ekleyin. Yedi günde, medyayı aspire edin. Ardından, her bir kuyuyu 2 mililitre taze ortamla doldurun.

Yedinci günden sonra, kuyuları her gün 2 mililitre taze ortamla doldurmaya devam edin. Bu görüntü, ters mikroskop altında meninks parçalarının ve kültürün ilk gününü göstermektedir. Yaklaşık altı ila dokuz gün sonra, ilk büyümede hücresel bağlanma gözlenebilir.

15 ila 19 gün arasında hücre sayısı artar ve büyüme yoğunlaşır. Meningeal fibroblastlar, fibronektin ekspresyonu ile karakterizedir. Bu görüntüler, boyanmış ve fibronektin için pozitif olan kültürlenmiş meningeal hücreleri göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, ölüm sonrası insan beyni donörlerinden leptomeninges explant kültürlerinin nasıl türetileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, üç ila altı hafta içinde meningeal fibroblast elde etmek için basit ve sağlam bir yol sağlar ve düşük bir geçiş sayısında 15 ila 20 milyon hücrenin bankalanmasına izin verir.