Name: Otopsi İnsan beyni Donörleri gelen leptomeninkslerde Eksplantasyon Kültürlerin türetilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Öğrenin, otopsi sonrası insan beyni leptomeninkslerinden meningeal fibroblast türetme yöntemini. Bu teknik, Parkinson hastalığı hücre hatlarını incelemek için fibronektin-pozitif hücreler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokolün geliştirilmesi, Parkinson Enstitüsü Beyin Bağışı Programına yönlendirilen özel bağışlarla finanse edilmiştir.

Beyin bağış kaydı bağışlamak için kendi niyet tescil ile belgeleri içerir. yasaların izin verdiği şekilde doku alımı için otopsi izni yakın akraba tarafından sağlanmaktadır. Toplanan otopsi örnekleri kullanarak araştırma çalışmaları Sağlık Sigortası Taşınabilirlik ve Sorumluluk Yasası (HIPAA) düzenlemelerine uyum sağlamak için kurumsal inceleme kurulu (KİK) tarafından gözden geçirilmektedir. NOT: leptomeninkslerde örnekleri beyin diseksiyonu sırasında beyin dissektör veya nöropatolog ile toplanır ve 25-30 ml Meninksler büyüme ortamı içeren 50 ml konik tüpler saklanır. Numune, numune hazırlama kadar 4 ° C&#39;de saklanır. hücre yaşamı sürdürme kabiliyeti zaman otopsi azalır gibi işlem mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır. 1. Ayar leptomeninkslerde Diseksiyon başlayarak önce NOT: - 1.3 biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır olan 1.1 adımlar. <ol><li> 375 mL Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı içinde birleştirerek zarları büyüme ortamının hazırlanması, fetal sığır serumu, 100 mL, 5 mL 10 mM esansiyel olmayan amino asitler, 5 ml 200 mM L-alanil-L-glutamin, 5 ml 100 mM sodyum piruvat, 5 ml 10,000 U / ml penisilin / streptomisin ve 5 mL, 250 ug / ml Amfoterisin B 500 mL filtre ünitesinin. Filtre ve karıştırın. kadar dört hafta ortam kullanın. </li><li> diseksiyon başlamadan önce biyogüvenlik kabini tüm malzemeleri koyun: 4x Petri kapları, 2x 6-kuyu plakaları, 2x neşter, 15-20 sterilize 15 mm kapak fişleri, pipetler aspire fosfat tampon salin (PBS), serolojik pipetler. </li><li> 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna steril otoklava% 0.1 jelatin çözeltisi 1 ml. 30-60 dakika boyunca bir kenara plaka ayarlayın. 2x 6-kuyu tabak hazırlayın. </li></ol> Leptomeninkslerde Numune 2. Hazırlık NOT: - 2.3 biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır olan 2.1 adımlar. <ol><li> PBS yaklaşık 10 ml ekleyinsteril 10-cm doku kültürü çanak ve çanak meninks numuneyi yerleştirin. forseps kullanarak, yavaşça kan kaldırmak için PBS ile leptomeningial yıkayın. </li><li> Taze 10 ml PBS ihtiva eden yeni bir 10 cm&#39;lik bir doku kültürü kabı içine meninksleri aktarın ve yıkama devam edin. mümkün olduğunca çok kan çıkarmak için gerektiği kadar tekrarlayın. </li><li> yaklaşık 6 cm x 6 cm büyük parça halinde dokuya leptomeninkslerde kesilmiş iki neşter, kullanma. </li><li> yatay laminer akış kaputu bir mikroskop bir kültür çanak ve transfer yerleştirin kapağı. </li></ol> Leptomeninkslerde Doku 3. Diseksiyon NOT: - 3.3 diseksiyon mikroskobu kullanılarak yatay laminer akış kaputu içinde yapılmalıdır 3,1 adımlar. <ol><li> en az 20-25 3 mm x 3 mm parçaları oluşturmak için yeterince büyük leptomeninkslerde parça (adım 2.3) bir bölgeden kan damarlarını çıkarın. bir neşter ile yerde leptomeningial tutun ve diğer, nazik ve sığ kazıma mo kullanıntion damarları ayırmak. </li><li> Hazırlanan bölgeden doku küçük kareler kesin. İlk büyük parçaları yapma ve daha küçük bölümlere olanlar dilimleme kademeli süreçte kesin. </li><li> Sallanan hareketi ile doku kesmek için yerinde doku ve başka neşter tutmak için bir neşter kullanabilirsiniz. doku kıvamına bağlı, birbirine karşı neşter slayt zordur. Bu sadece ayrı doku gözyaşı ve düzensiz kenarları sonuçlanır olacaktır. </li><li> 20-25 3 mm x 3 mm parçalar vardır kadar yarısında parçaları kesme devam edin. </li></ol> Doku kültürü plakaları üzerine Dissected zarları Adet 4. Transferi Not: Aşama 4, bir biyo-güvenlik kabini içinde yapılacak olan. <ol><li> 6-çukurlu plaka (adım 1.3) aspire jelatin. Her bir oyuğa zarları büyüme ortamı 1 ml. Steril forseps kullanarak, her kuyuya 3-4 biyopsi parçaları yerleştirin. </li></ol> M üzerinde Kapak Slips 5. YerleştirmeEninges adet NOT: - 5.2 diseksiyon mikroskobu kullanılarak yatay laminer akış kaputu içinde yapılmalıdır 5.1 adımlar. <ol><li> kuyu başına 1-2 steril 15 mm yuvarlak lamelleri ile parçaları örtün. </li><li> adet plakanın alt dokunmadan emin olmak için forseps ile sıkıca bastırın. Bu iyi altına, doku parçalarının bağlanmasına izin vermektedir. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör içine 6-plaka. </li></ol> 6. Hücre kültürü Bakım NOT: - 6.3 biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır olan 6.1 adımlar. lamelleri taşımak ve meninks parçaları çıkarmak değil gerektiği gibi özenle kültür kaplarına anlaştım. <ol><li> kültür içinde 2 gün sonra, her bir oyuğa taze zarları büyüme ortamı ilave 1 ml. </li><li> 7. Günde dikkatle medya aspire ve her iyi taze medya 2 mL ekleyin. </li><li> Gün 9 sonra büyüme ortamı her değişmeye devamkültür kadar geçen gün birleşen. </li></ol> 7. Pasajlanması NOT: Tüm adımlar biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır vardır. Meningeal fibroblastlar Meningeal doku parçaları dışarı göç ve büyük kültür kabına menengial fibroblastlar, kültür geminin kenarlarına doğru büyümeye genişletmek başlar sonra. <ol><li> 15-30 dakika süreyle% 1 jelatin ile Pasajlanması, ceket kültür çanak başlamadan önce. </li><li> Aspire 6-iyi çanak medya ve 2 ml PBS ile yıkayın hücreleri. </li><li> Her kuyucuğa tripsin / EDTA 1 ml ilave edilir ve 5-10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Kapak slipi veya bu aşama için zarı doku kaldırmak için gerekli değildir. </li><li> Hücreler yuvarlak ve, ayırmak kültür ortamı 2 mL ekleyin başladığınızda. </li><li> Pipet hücreleri yukarı ve tamamen tüm kümeleri bozmak ve büyük kültür çanak hücre çözümü transfer aşağı. </li><li> 1 ila 3: 1 bir oran için 4 üç 6 oyuklu tabaklar hücreleri birleştirmekbir T75 kültür çanak. </li><li> Meningeal fibroblastlar hücreleri T75 kültür şişelerinde birleştirilebilmeli sonra, hücreleri trypsinize ve 1x10 6 hücre / ml şişe başına en kriyoprezervasyon medya cryopreserve. konfluan meningeal fibroblastlar Tek T75 kültürü şişesi yaklaşık 5-7 milyon hücre içeriyor. </li></ol> Immün Meningial Fibroblast 8. Karakterizasyonu Not: prosedürü başlamadan önce, PBS (bloke tamponu) içinde% 4 paraformaldehit çözeltisi,% 5 normal keçi serumu hazırlamak% 0.3 Triton X-100, PBS (permeabilizasyon tamponu), primer ve sekonder antikor çözeltileri ve 1 ug / mL Hoechst 33342, 10 mg / ml stok PBS içinde seyreltilmiştir. <ol><li> 8-iyi odasının slayt Tohum 15.000 30.000 meningeal fibroblastlar% 0,1 jelatin ile kaplı. </li><li> Hücreler eklendiğinde 24 saat sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca oyuk başına 100 uL% 4 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit. 1x PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.3 Triton X-100, 150 uL hücreler geçirgenliği. 1x PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 st için bloke etme çözeltisi 200 uL (PBS +% 5 normal keçi serumu) ekleyin. </li><li> Engelleme çözüm aspire ve çözümü engelleme seyreltilmiş istenen birincil antikor 150 mcL ekleyin. çift ​​boyama için, aşağıdaki gibi, buz üzerinde ayrı bir santrifüj tüplerine birincil antikor çalışma dilüsyonları hazırlayın: <ol><li> Anti-Fibronektin + 1 300 seyreltme: çözümü engelleme, anti-Nestin 200 seyreltme 1 hazırlayın. Anti-SERPINH1 + 1 250 seyreltme: çözümü engelleme, anti-Tuj1 1000 seyreltme 1 hazırlayın. 1 hazırlayın: Anti-SERPINH1 250 seyreltme + 1: çözümü engelleme, anti-Sox2 100 seyreltme </li></ol></li><li> gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1x PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Bir çalışan 1 hazırlayın: ikincil antikorlar anti-tavşan keçi floresan etiketli 400 seyreltme (yeşil; Ex / Em 2 </sYukarıya&gt; 495/519 nm) ve keçi anti-fare (kırmızı Ex / Em 2 590/617 nm) bloke çözeltisi içinde ve her bir kuyucuğa 100 uL ekleyin. Oda sıcaklığında, karanlıkta, 1 saat boyunca inkübe edilir. Daha sonra 1 x PBS ile bir kez kuyu yıkayın. </li><li> Her bir çözüm de ve 3 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir; / ml Hoechst 1 ug ile 100 uL 33342 (Örnek / Em 2 358/461 nm mavi) ekleyin. iyi son 1x PBS yıkama bırakarak, 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve alüminyum folyo ile slayt kapsamaktadır. </li><li> floresan mikroskop altında hücrelerin analiz. </li></ol>

<ol><li>Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges%3A+from+protective+membrane+to+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Meninges: from protective membrane to stem cell niche.</a> Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+stem%2Fprogenitor+cells+with+neuronal+differentiation+potential+reside+in+the+leptomeningeal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche.</a> J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges+harbor+cells+expressing+neural+precursor+markers+during+development+and+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood.</a> Front Cell Neurosci. 9, 383(2015).</li>
<li>Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+niches+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell niches in health and diseases.</a> Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).</li>
<li>Hayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+cells+induce+dopaminergic+neurons+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells.</a> Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).</li>
<li>Nakagomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal-derived+doublecortin-expressing+cells+in+poststroke+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain.</a> Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).</li>
<li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+autopsy+donor-derived+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells.</a> Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).</li>
<li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-differentiated+neural+cell+cultures+progress+towards+donor-identical+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue.</a> Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).</li>
<li>Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+autopsy-derived+fibroblasts+as+a+tool+to+study+systemic+alterations+in+human+neurodegenerative+disorders+such+as+Alzheimer%27s+disease--methodological+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease--methodological investigations.</a> J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).</li>
<li>Bliss, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+postmortem+human+dura+mater+and+scalp+for+deriving+human+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures.</a> PLoS One. 7 (9), e45282(2012).</li>
<li>Sproul, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPSC+lines+from+archived+non-cryoprotected+biobanked+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 4(2014).</li>
<li>Adler, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+clinical+diagnostic+accuracy+of+early+vs+advanced+Parkinson+disease%3A+clinicopathologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study.</a> Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).</li>
<li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+clinical+diagnosis+of+idiopathic+Parkinson%27s+disease%3A+a+clinico-pathological+study+of+100+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).</li>
<li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+accuracy+of+clinical+diagnosis+of+Lewy+body+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease.</a> Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).</li>
<li>Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisystem+Lewy+body+disease+and+the+other+parkinsonian+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders.</a> Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> J Vis Exp. (77), e3779(2013).</li>
<li>Byers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNCA+triplication+Parkinson%27s+patient%27s+iPSC-derived+DA+neurons+accumulate+alpha-synuclein+and+are+susceptible+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress.</a> PLoS One. 6 (11), e26159(2011).</li>
<li>Sanders, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutations+cause+mitochondrial+DNA+damage+in+iPSC-derived+neural+cells+from+Parkinson%27s+disease+patients%3A+reversal+by+gene+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction.</a> Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).</li>
<li>Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+%28iPSC%29-derived+dopaminergic+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease.</a> Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol, beyin bağışı ile birlikte toplanan insan postmortem leptomeninks bir meningeal fibroblast kültürü elde etmek için basit ve sağlam bir protokol tanımlamaktadır. postmortem insan malzemeden hücre kültürleri elde etmek için protokoller çok az açıklamaları vardır. İki çalışma, Cilt türevli, fibroblast kültürler 7, 8, 9, bir çalışma dura numuneler 10 tarif eder ve bir başka olmayan dondurulan don...

dura mater, araknoid ve pia mater: zarları beyni korumak üç membranların oluşur. Daha yakın zamanlarda, meninksler da beyin gelişimi ve beyin homeostazında 1 önemli bir rol oynadığı kabul edilmiştir. Zarları mezenşimal ve nöral tepe türetilmiş hücrelerden elde edilir ve ilginç bir şekilde, in vitro ve in vivo, 2, 3, 4 ve transplantasyon sonrası nöronlar ortaya çıkmasına neden olabilir meninks ikamet eden progenitör hücreler gösterilmiştir. Bunlar dopaminerjik nöronlar 5 embriyonik kök hücre farklılaşması için stromal hücre türevli indükleyici aktivite gösterirler zarları kültürleri de başarılı bir şekilde, besleyici tabakalar olarak kullanılmıştır. Ayrıca, leptomeninkslerde doğrudan iskemik koşullarda 6 altında nöronlar, astrositler ve oligodendrositlere içine ayırt etme potansiyeline sahiptir. Bu protokol için, insan postmortem zarları örnekleri topluca, araknoid ve pia mater toplanan leptomeningial denilen ve araştırma amaçlı bir insan beyninin bağışı parçası olarak temin edilir edilir. beyin Diseksiyon ölüm 24 saat içinde gerçekleştirilir, bu protokolde burada gösterildiği gibi leptomeninkslerde Örnek daha sonra 6-8 saat içinde daha fazla işlem için soğuk büyüme ortamı içinde yerleştirilir. Bu protokol, hastaya primer leptomeninkslerde hücre kültürü gelişimi için diseksiyon ve insan beyin zarı numunelerin hazırlanmasını tarif etmektedir. Doku, yaklaşık 3 mm x 3 mm kare 25-30 parçalar halinde kesilir. Üç adet her biri 6-kuyu yerleştirilir jelatin kaplı iyi ve yuvarlak cam lamelleri aşağı düzenledi. zarları diseksiyon yaklaşık 25-35 dakika sürer. Bu kültürün ana zorluk beyin tedarik, taşıma ve diseksiyon olarak sterilite genellikle steril koşullar altında yapılır edilmemektedir. Therefore, penisilin, streptomisin, ve amfoterisin B&#39;nin bir kokteyl ile kültür ortamını desteklemek ve ayrı ayrı kültür doku parçaları çok iyi yemekler kullanmak önemlidir. Meningeal fibroblast akıbet genellikle ilk hafta içinde ortaya çıkar. Hücreler birleştiklerinde kadar Ortam, her iki ya da üç günde bir değiştirilir ve hücreler, enzimatik olarak geçirilir. Meningeal fibroblastlar dondurulması medyada ml / şişe başına 1 Milyon hücre Kriyoprezerve bulunmaktadır. Bu protokol ile, 20-30.000.000 meningeal fibroblastlar dondurulması için 6-8 hafta içinde elde edilebilir. Bu Meningeal fibroblastların Mansap uygulamaları hastalık araştırması, doğrudan nöronal farklılaşma ya da hastalık mekanizmalarının anlaşılması için ve ilaç geliştirme leptomeninks gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin derivasyon için birincil kültürleri vardır.

<table><tbody><tr><td>Corning Petri kapları</td><td>Fisher Scientific</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 6 oyuklu plaka</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>15 mm lamel</td><td>fişler Fisher Scientific</td><td>12-545-83 15CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Neşterler, steril bıçak, No. 15</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli hassas uç forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-122</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Pastör pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230490</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Tuzlu</td><td>Su Fisher Scientific</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL filtre ünitesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>430770</td><td>Ortam bileşenlerini birleştirin ve filtre.</td></tr><tr><td>Nunc Hücre Kültürü İşlem Görmüş Filtre Kapaklı Şişeler, T175 cm2&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>178883</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Growth Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyclone DMEM</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>SH30081.02</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Balıkçı Bilimsel</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat (100 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B (Sarı Çözelti / 250 & mikro; g / mL)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP264520</td><td></td></tr><tr><td>Bambanker Freeze 120 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9582225</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>Fibronektin Boyama</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 kuyu odası kaydırağı&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1256518</td><td></td></tr><tr><td>%20 paraformaldehit&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>%100 Gliserol&</td><td>BioRad</td><td>9455</td><td></td></tr><tr><td>%100 normal keçi serumu&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>101098-382</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fibronektin antikoru [F1]</td><td>Abcam</td><td>ab32419</td><td>1:300 bloke edici solüsyonda seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-SERPINH1</td><td>Sigma</td><td>S5950-200ul</td><td>1:250 bloke edici solüsyonda seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Millipore</td><td>MAB4343</td><td>1:100 bloke edici solüsyonda seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-Nestin</td><td>Millipore MAB5326</td><td></td><td>1:200 engelleme çözeltisinde seyreltme</td></tr>: <tr><td>Anti-TUJ1</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>1: 1.000 engelleme çözeltisinde seyreltme</td></tr><tr>,<td>Alexa Fluor 488 anti-tavşan</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11029</td>, <td>engelleme çözeltisinde 1:400 seyreltme; (Yeşil Kanal; Ör/EM2 495/519 nm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anti-fare</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21424</td><td>1:400 engelleme çözeltisinde seyreltme; (Kırmızı Kanal; Eski/Em2 590/617 nm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 leke</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td>, <td>1.0 & mu'luk bir nihai konsantrasyona seyreltin; g/mL; (Mavi Kanal; Ex/EM2 358/461 nm)</td></tr><tr><td colspan="4">Tedarikçiler öneridir, alternatif satıcılardan benzer ürünler de kullanılabilir.</td></tr></tbody></table>

otopsi İnsan beyni donörleri gelen leptomeninkslerde eksplantasyon kültürlerin türetilmesi

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Büyük ilerleme Parkinson hastalığının klinik karakterizasyonu yapılmış olsa bile, bazı çalışmalar Parkinson hastalığı tanısı patolojik klinik olarak teşhis Parkinson hastalığı% 25 kadar teyit olmadığını bildirmektedir. Bu nedenle, doku yanlış tanı yüksek oranda olabilir idiyopatik Parkinson hastalığı olan klinik tanısı alan hastaların toplanan; Bir klinik öncesi bir model beyhude olabilir gibi dolayısıyla bu tür dokulardan in vitro çalışmalar Parkinson hastalığı incelemek için. Parkinson hastalığının bir teyit nöropatolojik tanısı ile postmortem insan leptomeningial toplama ve nigrostriatal hücre kaybı ve Lewy cisimcikleri denilen hücre içi protein kapanım ile karakterize tarafından, bir klinik gözlenen parkinsonizm altta yatan başka bir hastalık süreci (örneğin tümör, damar sertliği) neden olmadığından emin olabilirsiniz. Bu protokol, miyodiseksiyon ve meningeal fibroblast kültürü türetilmesi için postmortem insan leptomeninks hazırlanması ts. Bu prosedür sağlam ve yüksek bir başarı oranına sahiptir. Beyin tedarik genellikle steril koşullar altında yapılır değil gibi kültürün meydan kısırlık olduğunu. Nedenle, penisilin, streptomisin ve amfoterisin B bir kokteyli ile kültür ortamı tamamlanması önemlidir Parkinson hastalığı olan otopsi doğrulanmış vakaların gelen Meningeal fibroblast türetme Parkinson hastalığı in vitro modelleme için temel sağlar. Meningeal fibroblastlar 3-9 gün numune hazırlandıktan sonra ortaya çıkar ve yaklaşık 20-30 milyon hücre 6-8 hafta içinde dondurularak saklanabilir. Meningeal fibroblast kültürü homojen ve hücreler fibronektin, meninksler tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir işaretleyici ifade eder.

leptomeninkslerde işleme protokolü başarılı olmuştur bu beyin otopsi aralığının uzunluğuna bağlıdır rağmen, meningeal fibroblast akıbet, üç ile dokuz gün diseksiyonu sonrası gözlenen ilk edilir. Şekil 1, dört farklı donörlerin meningeal fibroblast kültürleri göstermektedir. Şekil 1A 10 saat 20 dk otopsi aralığına sahip 88 yaşındaki bir donörden işlendikten sonra doku dört gün etrafında bir cam kapak slip (koyu çapraz çizgi) ve fibroblast akıbet aşağı tut...

İnsan postmortem beyin leptomeninkslerde eksplant kültür protokolü 6-8 hafta içinde fibronektin pozitif meningeal fibroblastlar elde ve yaklaşık 20-30 mikrogram milyon hücre cryopreserve için teknik sağlam ve basit bir yoludur.

Otopsi İnsan beyni Donörleri gelen leptomeninkslerde Eksplantasyon Kültürlerin türetilmesi

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Ben Birgitt Schule, Parkinson Enstitüsü ve Klinik Merkezi'nde Beyin Bağışı Programı Direktörüyüm. Bu videoda, Parkinson hastalığı olan hastalardan alınan postmortem insan beyninin leptomeninglerinden elde edilen bir eksplant hücre kültürü ve primer fibroblast süresi için bir teknik anlatılmıştır. Bu fibroblastlar, hücre bazlı tahliller de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.Bu önemlidir, çünkü Lewy cisimciği patolojisi olan sporadik Parkinson hastalığının otopsi ile kanıtlanmış vakalarından elde edilen hücre dizilerini inceleyebiliriz. Gerekli tüm malzemeleri doku kültürü başlığına yerleştirerek başlayın. Kaputa giren tüm nesnelere %70 etanol püskürtülmeli ve silinmelidir.İlk adım, meninksleri tüpten kesme kabına aktarmaktır. 10 santimetrelik steril bir kesme kabına yaklaşık 10 mililitre fosfat tamponlu salin dökerek başlayın. Burada meninksleri görebilirsiniz.Steril forseps kullanarak, meninksleri dikkatlice kesme kabına aktarın. Yırtılmayı önlemek için bu adımı yavaşça gerçekleştirin. Bir sonraki adım, mümkün olduğunca fazla kanı çıkarmak için meninksleri PBS'de yıkamaktır.Numuneniz çok kanlıysa, başka bir kesme kabına aktarmayı düşünebilirsiniz. 10 santimetrelik taze bir tabağa 10 mililitre daha PBS ekleyin. Meninkslerden kanı almaya devam etmek için bu yıkamayı tekrarlayın.Son olarak, meninksleri PBS içeren 10 santimetrelik taze bir tabağa aktarın. Bittiğinde, tabağın üzerini örtün ve laminer akış başlığındaki diseksiyon mikroskobuna aktarın. Bu sonraki adım, meninksleri daha küçük parçalara ayırmaya devam etmektir.İki steril neşter kullanarak, sığ bir kazıma hareketiyle kan damarlarını meninkslerden nazikçe ayırın. Bu resimde gösterildiği gibi kabaca 18 adet 3 milimetreye 3 milimetrelik parçalar kesecek kadar büyük bir alan hazırlayın. Daha sonra neşteri alın ve sallanma hareketi kullanarak hazırlanan bölgeyi 3 milimetreye 3 milimetrelik parçalar halinde bölün.Bunu, önce meninksleri daha büyük parçalara ayırarak ve ardından bu parçaları daha küçük parçalara ayırarak aşamalı bir işlemle yapmak daha kolaydır. Kesme kabını kapatın ve tekrar doku kültürü başlığına aktarın. Daha sonra, meninksleri 30 ila 60 dakika boyunca 1 mililitre yüzde 0.1 jelatin ile oldukça kaplanmış altı oyuklu bir doku kültürü plakasına aktarmaya hazırlanın.Her oyuğa bir mililitre meninks ortamı ekleyin. Daha sonra, steril forsepslerle, her bir kuyucuğun ortasına üç ila dört meninks parçası aktarın. Bu plaka üzerinde büyüyen hücreler bir geçit sıfır olacaktır.Bir sonraki adım, meninks parçalarının sabit kalmasını ve kültür kabı ile temas halinde kalmasını sağlamak için lameller kullanır. Meninks parçalarının üzerine steril 15 milimetrelik dairesel bir lamel yerleştirin. Gerekirse, meninks parçalarını bir lamel ile yeniden konumlandırın.Ardından, forsepsleri kullanarak, parçaların plakaya temas ettiğinden emin olmak için lamel üzerine sıkıca bastırın. Bu görüntü, bir lamel ile yerinde tutulan meninks parçalarını göstermektedir. Kapağı altı oyuklu plakanın üzerine yerleştirin ve plakayı dikkatlice 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite ayarlanmış bir inkübatöre aktarın.Kültürde iki gün geçirdikten sonra, her bir oyuğa bir mililitre daha taze meninks ortamı ekleyin. Yedi günde, medyayı aspire edin. Ardından, her bir kuyuyu 2 mililitre taze ortamla doldurun.Yedinci günden sonra, kuyuları her gün 2 mililitre taze ortamla doldurmaya devam edin. Bu görüntü, ters mikroskop altında meninks parçalarının ve kültürün ilk gününü göstermektedir. Yaklaşık altı ila dokuz gün sonra, ilk büyümede hücresel bağlanma gözlenebilir.15 ila 19 gün arasında hücre sayısı artar ve büyüme yoğunlaşır. Meningeal fibroblastlar, fibronektin ekspresyonu ile karakterizedir. Bu görüntüler, boyanmış ve fibronektin için pozitif olan kültürlenmiş meningeal hücreleri göstermektedir.Bu videoyu izledikten sonra, ölüm sonrası insan beyni donörlerinden leptomeninges explant kültürlerinin nasıl türetileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, üç ila altı hafta içinde meningeal fibroblast elde etmek için basit ve sağlam bir yol sağlar ve düşük bir geçiş sayısında 15 ila 20 milyon hücrenin bankalanmasına izin verir.

derivation-leptomeninges-explant-cultures-from-postmortem-human-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu makale, olgun oligodendrosit (EKK) üretmek için ayırt primer kültür fare oligodendrosit öncü hücreler (OPC) zenginleştirilmiş nüfus, elde etmek için yöntemler anlatılmaktadır. Buna ek olarak, bu rapor üretmek için teknikler açıklar fare fare dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) neurite yatağa fare OPC ekim ortak kültürler myelinating.

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

Bu protokol, fetal spinal kablolarından Glial Yasak Öncüleri derivasyon özetliyor ve transplantasyon için veya oligodendrocytic soyunun çalışma için ya in vitro korunmuştur.

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

Bu video, yetişkin insan beyninden serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için bir tekniği göstermektedir. Bir vibratom kullanılarak bir beyin bölümünden ince dilimler oluşturulur. Bu dilimler daha sonra doku canlılığını korumak için büyüme faktörleri ile desteklenmiş bir kültür ortamında süspanse edilir.

Yetişkin Bir İnsan Beyninden Serbest Yüzen Dilim Kültürlerinin Hazırlanması

Bu video, glial hücrelerin üç boyutlu bir kültürünü oluşturmak için bir tekniği göstermektedir. Sıçan beyninden türetilen glial hücreler, hücre dışı matris bileşenleri içeren fotokrosçapraz bağlanabilir bir polimer matris içinde kapsüllenir. Bir büyüme ortamında inkübe edildikten sonra, glial hücreler, üç boyutlu bir kültür oluşturmak için destekleyici matris içinde çoğalır.

Sıçan Beyninden Elde Edilen Glial Hücrelerin Üç Boyutlu Bir Kültürünün Oluşturulması

Ventrikül beyin omurilik sıvısı (BOS) embriyo erken beyin gelişimi sırasında nöroepitelyal ve serebral kortikal progenitör hücreler banyoları. Burada biyolojik işlevini araştırmak amacıyla farklı yaşlardaki kemirgen embriyolardan ventriküler BOS yalıtmak için geliştirilen yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, bizim serebral kortikal eksplant diseksiyonu ve kültür ortamı veya BOS minimum hacimlerde eksplant büyüme sağlar kültürü tekniği göstermek.

Dissected Serebral Kortikal Eksplantlarından ile kullanım için Kemirgen Embriyolar arasından Beyin Omurilik Sıvısı İzolasyonu

Bu protokol, beyin bağışı programı ve beyinlerin doğru karakterizasyonu yoluyla bireysel beyin yaşlanma yörüngelerini izlemek için bir yöntem açıklar. Beyin bağışçıları seri çok boyutlu değerlendirmeler de dahil olmak üzere uzun vadeli bir uzunlamasına çalışmada yer almaktadır. Protokol beyin işleme ve doğru bir tanı metodolojisi ayrıntılı bir açıklamasını içerir.

Abbiategrasso Beyin Bankası Toplama, İşleme ve Yaşlanma Beyinleri Karakterize için Protokol

Biz kafatası stabilize edilebilir ucunda bir iğne bükülmüş bir intrasisternal enjeksiyon tarif, böylece altta yatan parankim hasar riskini ortadan kaldırarak. Bu yaklaşım, leptomeningeal hücrelerin genetik kader haritalanması ve manipülasyonları ve beyin-omurilik sıvısı hareketini izlemek için kullanılabilir.

İntrasisternal Enjeksiyon Ile Leptomeningeal Hücre Modifikasyonu İndüksiyonu

Bu makale, beyin, omurilik ve meninksler dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi içindeki yerleşik ve periferik olarak türetilmiş bağışıklık hücrelerini incelemek için optimize edilmiş iki protokol sunmaktadır. Bu protokollerin her biri, kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında bu bölmeleri işgal eden hücrelerin işlevini ve bileşimini belirlemeye yardımcı olur.

İmmün hücrelerin Aşağı Akış Analizi için Merkezi Sinir Sistemi Dokularının ve İlişkili Meninkslerin İzole Edilmesi

Bu protokol, nöro (immüno) loji araştırması için embriyonik gün 17 fare beyinlerinden merkezi sinir sistemi hücre kültürleri üretmenin benzersiz bir yolunu sunar. Bu model, RT-qPCR, mikroskopi, ELISA ve akış sitometrisi dahil olmak üzere çeşitli deneysel teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Yakın zamanda tanımlanmış bir intrakraniyal hücre tipi olan leptomeningeal lenfatik endotel hücreleri (LLEC'ler), işlevleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışma, farelerden LLEC'lerin toplanması ve in vitro birincil kültürlerin oluşturulması için tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, araştırmacıların LLEC'lerin hücresel fonksiyonlarını ve potansiyel klinik etkilerini araştırmalarını sağlamak için tasarlanmıştır.

Leptomeningeal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Hasadı ve Primer Kültürü

Bu makale, M-LMD'yi incelemek için klinik öncesi modeller geliştirmek üzere melanom ile ilişkili leptomeningeal hastalığı (M-LMD) olan hastalardan toplanan serebral omurilik sıvısı dolaşımındaki tümör hücrelerinin (BOS-CTC'ler) çoğaltılması için bir protokolü açıklamaktadır.

Canlı Çekim Melanom Hastalarından Beyin Omurilik Sıvısında Dolaşan Tümör Hücrelerinin Melanomla İlişkili Leptomeningeal Hastalığı İncelemek İçin Kültürü

Öğrenin, otopsi sonrası insan beyni leptomeninkslerinden meningeal fibroblast türetme yöntemini. Bu teknik, Parkinson hastalığı hücre hatlarını incelemek için fibronektin-pozitif hücreler sağlar.

Otopsi İnsan beyni Donörleri gelen leptomeninkslerde Eksplantasyon Kültürlerin türetilmesi

Daha fazla video keşfet