yetiştirme Caenorhabditis elegans Laboratuvarı Üç boyutlu

Bu prosedürün genel amacı, doğal koşulları daha iyi simüle edebilen nematodlar için üç boyutlu bir yetiştirme sistemi üretmektir. Bu yöntem, C elegans gelişimi, fizyolojisi ve davranışı alanındaki temel soruları cevaplayabilir. Bu yöntem için ilk olarak, 3 boyutlu bir ortam olan çürüyen meyvelerde doğal nematod davranışını incelerken aklımıza geldi.

Bu teknik, standart iki boyutlu yetiştirme tekniklerine kıyasla avantajlıdır çünkü nematodlar doğadaki 3 boyutlu habitatlarda bulunur. Bu yöntem C elegans yetiştiriciliği için geliştirilmiş olsa da, diğer nematodlara da uygulanabilir. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Tong Young Lee olacak.

Bu işleme başlamak için, Otto Clave hazırlanan çözeltileri 121 santigrat derecede 15 dakika boyunca bekletin. Daha sonra, mililitre başına 5 miligramda 50 mililitre steril kolesterol çözeltisi hazırlayın. 50 mililitrelik konik bir tüpe 0.25 gram kolesterol ve 50 mililitre% 99.99 etanol ekleyin ve iyice karıştırın.

Daha sonra, kolesterol çözeltisini 0.45 havalandırmalı şırınga filtreli 50 mililitrelik bir şırınga kullanarak sterilize edin ve gelişmemiş kolesterolü çıkarın. Daha sonra, 10 mililitre lizojeni suyu bakteri ile aşılayın. Bakteri aşılamasını gece boyunca çalkalanan bir inkübatörde 37 santigrat derecede kültürleyin.

Seri seyreltmeye hazırlanırken, dokuz mililitre Sodyum Klorür çözeltisini yedi steril 15 mililitrelik konik tüpe ayırın. Opi 50 Suşu E Coli'nin yedinci kat seyreltilmesinden bir çadır yapmak için. Daha sonra, bakteri kültürünün bir mililitresini veya seyreltilmiş bakteri kültürünü dokuz mililitre Sodyum Klorür çözeltisi içeren yeni bir tüpe çıkarın.

Ve karışımı iyice girdaplayın. Bakteri kültürünü hazırladıktan sonra, 500 mililitrelik bir şişeye 0.6 gram Sodyum Klorür, bir gram granül burgu ve 0.5 gram pepton ekleyin. Şişeye manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin.

Ardından 195 mililitre damıtılmış su ekleyin ve şişeyi alüminyum folyo ile örtün. Daha sonra, Otto numuneyi 121 santigrat derecede 15 dakika boyunca Clared yapın. Daha sonra, sıcak Otto Claved şişesini bir karıştırma plakasına koyun, 40 santigrat dereceye ulaşana kadar en az iki saat orta hızda karıştırın.

Alternatif olarak, şişe, bir karıştırma plakasına aktarılmadan önce 15 dakika boyunca 40 santigrat derece su banyosuna yerleştirilerek 40 santigrat dereceye kadar soğutulabilir. Buradan devam ederken yeterince soğuduğunuzdan emin olun. Yüksek bir sıcaklık, bitmiş burgunun bulanıklaşmasına neden olabilir, ancak çok düşük sıcaklık, burgunun erken sertleşmesine neden olabilir.

Burgu ortamının sıcaklığı 40 santigrat dereceye ulaştığında, Kalsiyum Klorür, Kolesterol Çözeltisi, Magnezyum Sülfat ve Potasyum Fosfat Tamponu ekleyin ve çözeltiyi karıştırmaya devam edin. NGT-3D kullanım ömrü testi için, 120 mikromolar nihai konsantrasyonla sonuçlanmak için ortama 80 mikrolitre 150 milimetre FUDR ekleyin. Ardından, altı mililitre burgu ortamını steril bir konik tüpe çıkarın ve bir inkübatörde sıcak tutun.

Bu ortam bakteri içermeyen üst tabaka için kullanılacaktır. Daha sonra, seyreltilmiş bakteri kültüründen altı mililitre şişeye doğrudan sterilize edilmiş bir tezgah üzerinde ekleyin. NGT-3D için, bir bakteri burgu tabakası oluşturmak için sekiz mililitrelik şeffaf plastik test tüplerine 6,5 mililitre ortam dökün.

Ve üstte ince bir bakteri içermeyen tabaka oluşturmak için yarı sert 3D ortamın üzerine 200 mikro litre bakteri içermeyen ortamı dikkatlice dağıtın. Ardından haznenin kapağını sıkıca kapatın. NGB-3D için, 25 santimetre karelik şeffaf plastik hücre kültürü şişesine 65 mililitre ortam dökün.

Ardından, bakteri kolonilerinin en az bir milimetre çapında önemli bir boyuta ulaşmasına izin vermek için odayı bir hafta boyunca oda sıcaklığında dikey olarak konumlandırın. Bu prosedürde, L dört aşamalı bir solucan seçin ve bakteri içermeyen bir NGM plakasına aktarın. Ardından, bakterileri vücudundan uzaklaştırmak için solucanın birkaç dakika serbestçe hareket etmesine izin verin.

Ve işlemi iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, temiz solucanı dikkatlice 3D ortamın yüzeyine yerleştirin. Solucan aslında burguyu 3D burgu matrisine girmiş olmalıydı.

Ardından, 20 santigrat derecede 96 saat inkübe etmek için kapağı gevşek bir şekilde kapatın. Dört gün sonra, kapağı sıkıca kapatın ve burguyu eritmek için NGT-3D kültür odasını 88 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Bir cam pipet kullanarak, erimiş ortamı dokuz santimetrelik plastik bir petri kabına aktarın.

Daha sonra, bir iletim stereo diseksiyon mikroskobu kullanarak, L3, L4 ve yetişkin aşamalarındaki solucan sayısını sayın. Burada gösterildiği gibi, NGT-3D'nin yapısı, burgu boyunca aralıklı küçük bakteri kolonilerine sahip burgu dolu bir test tüpü ile sonuçlanan basit ve anlaşılır bir protokoldür. C elegans'ın NGT-3D'de normal şekilde azalıp büyüyemeyeceğini doğrulamak için, doğurganlık ve larva gelişimi standart 2D NGM plakaları ile 3D olarak karşılaştırılır.

Bağıl kuluçka boyutu testinde, NGT-3D'deki yetişkin C elegans hermafroditleri, bakteri kolonilerinin en az 60 koloni ile bol olduğu durumlarda standart 2D MGM plakalarındaki hermafroditler kadar çoğalır. Ayrıca, NGT-3D'deki larva gelişimi, 96 saat sonra yetişkin durumda solucanların çoğunluğu ile bol miktarda bakteri kolonisi olduğunda normal şekilde ilerler. Bununla birlikte, bakteri kolonileri 3D matriste seyrekse, hem nispi kuluçka boyutu hem de larva gelişimi olumsuz etkilenir.

İşte NGT-3D veya NGM plakalarındaki vahşi tip C elegans'ın hayatta kalma eğrisi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, yaşlanma ve davranışla ilgili soruları 3 boyutlu olarak yanıtlamak için yaşam süresi tahlilleri ve davranış analizi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Geliştirildikten sonra, bu teknik, genetik alanlarındaki araştırmacıların C elegans'ta ekoloji ve evrim hakkındaki soruları keşfetmelerinin önünü açabilir. Bu videoyu izledikten sonra, nematodların 3 boyutlu laboratuvar ortamında nasıl yetiştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.