Hücre kaynaklı Ekstrasellüler Matrix A Hızlı, İzolasyon, Fonksiyonel Çalışmaları Ölçeklenebilir Yöntem ve Analiz

Bu prosedürün genel amacı, normal dokularda ve hastalık süreçlerinde hücre dışı matrisin işlevlerini ve özelliklerini anlamaya yardımcı olmak için çok çeşitli aşağı akış deneyleri için kültürlenmiş hücrelerden hücre dışı matrisi izole etmektir. Bu yöntem, hücre dışı matrisin organizasyonu, moleküler bileşimi, protein etkileşimleri veya fonksiyonel özellikleri gibi hücre dışı matris alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, hücre dışı matris herhangi bir yapışık hücre tipinden hazırlanabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, hücreleri verimli bir şekilde çıkarmak ve hücre dışı matris proteinlerini korumak için farklı ölçeklerde gerçekleştirilebilmeleridir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Silvia Rosini ve doktora sonrası araştırmacı Andrew Hellewell olacak. Başlamak için, canlı hücrelerin ve hücre dışı matrisin veya ECM'nin görüntülenmesi için kapak kızakları üzerindeki plaka hücreleri.

Floresan mikroskobu çalışmaları için sabit bir ECM. Veya küçük ölçekli fonksiyonel çalışmalar için hücre kaynaklı ECM'nin hazırlanması için. Hücrelerin ECM'yi biriktirmesi için uygun bir süre boyunca hücreleri uygun bir sıcaklık ve nemde inkübe edin.

Tipik olarak 16 saatten fazla. Bir davlumbazda, stok çözeltisini bir ila 14 seyreltmek için deiyonize su kullanarak uygun bir kapta 20 milimolar amonyum hidroksit hazırlayın. Hücreleri inkübatörden çıkarın ve kültür ortamını yavaşça çıkarın.

Ardından, yemeğin duvarına hafifçe dökerek kalsiyum veya magnezyum içermeyen PBS ekleyin. Çanağı iki kez sallayın ve sıvıyı dökün. Ardından yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.

Davlumbazda, son PBS yıkamasını çıkarın, 60 milimetrelik tabak başına 1,5 mililitre amonyum hidroksit ekleyin ve plakaları oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Tüm hücrelerin parçalanmasını sağlamak için bulaşıkları her dakika nazikçe çalkalayın. Ardından, her yemeğe bol miktarda deiyonize su ekleyin ve tabağı sallayın.

Daha sonra amonyum hidroksit, parçalanmış hücreler ve deiyonize sudan oluşan amonyum hidroksit çözünmüş malzemeyi dökün. Tüm amonyum hidroksit çözünmüş malzemenin tamamen çıkarılmasını sağlamak için çözünmeyen ECM tabakasını bol miktarda deiyonize suda dört kez daha yıkayın. Deiyonize suda bol yıkama ile hücrelerin tamamen uzaklaştırılması esastır.

Bu adımlar yeterince gerçekleştirilmezse, hücresel materyal çanak üzerinde kalabilir ve aşağı akış analizini kontamine edebilir. ECM'nin immünofloresan ile incelenmesi için, kalan deiyonize suyu çıkarın, ECM'yi %2 paraformaldehit, kısaltılmış PFA ekleyerek sabitleyin ve bulaşıkları oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Her bir düzeltme örneğini iki kez yıkamak için PBS kullanın ve metin protokolüne göre floresan mikroskobu gerçekleştirmeden önce çözeltiyi sıvı bir atık kabına atın.

Laminer akış başlığında, kalsiyum ve magnezyum, 20 milimolar amonyum hidroksit ve deiyonize su içermeyen steril PBS çözeltilerini, her bir çözeltiyi steril bir 0.2 mikrometre filtreden uygun bir steril kaba geçirerek hazırlayın. Steril tekniği korurken, matris üretici hücrelerini kapak fişleri üzerinde üç kez nazikçe yıkamak için steril PBS kullanın. Son PBS yıkamasını çıkardıktan sonra, 60 milimetrelik tabağa 1,5 mililitre steril amonyum hidroksit ekleyin ve aralıklı sallama ile oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Sallanarak tabağa bol miktarda steril deiyonize su ekleyin, hücre lizatını uygun bir atık kabına dökün. Çözünmüş malzemenin tamamen çıkarılmasını sağlamak için bu yıkamayı dört kez daha tekrarlayın. Hücreleri metin protokolüne göre tripsinize ettikten ve peletledikten sonra, test hücrelerini taze steril ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın.

Daha sonra uygun sayıda test hücresi ve kültür ortamını steril izole ECM üzerine örtü kızakları üzerine yerleştirin ve iki ila üç saat veya gereken süre boyunca inkübe edin. Aktin hücre iskeletinin organizasyonunu incelemek için, test hücrelerini% 2 PFA'ya sabitleyin ve F-aktini görselleştirmek için FITC-Phalloidin ve çekirdeği görselleştirmek için DAPI ile boyayın. Çok sayıda hücreyi kültürledikten sonra, hücreleri çıkardıktan ve videoda daha önce gösterildiği gibi ECM'yi yıkadıktan sonra, kalan suyu tabağın dibine boşaltmak için her bir plakayı belirli bir açıyla eğin ve plaka tamamen kuruyana kadar kalan suyu dikkatlice çıkarmak için bir P200 pipeti kullanın.

Aynı zamanda, 100 milimolar DDT içeren SDS-PAGE numune tamponunu iki dakika boyunca 95 santigrat dereceye ısıtın ve immünoblot tarafından incelenecek her 100 milimetrelik plakaya 200 mikrolitre ekleyin. Numuneyi tabağın bir tarafına toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın ve bir tüpe aktarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. ECM'yi kütle spektrometresi ile analiz etmek için, SDS-PAGE numune tamponunu çanaktan toplayarak, 95 santigrat dereceye kadar yeniden ısıtarak ve aynı alikotu iki ila üç ek plaka üzerinde kullanarak daha konsantre bir numune hazırlayın.

ECM materyali kaybını en aza indirmek için hücre sıyırıcı ucundan kalan SDS-PAGE numune tamponu ekstraktını tüpe aktarın. İzole edilmiş ECM'nin SDS-PAGE numune tamponuna etkili bir şekilde ekstraksiyonu için, numune tamponunun 95 dereceye kadar ısıtılması, bir indirgeyici madde içermesi ve plakanın kapsamlı bir şekilde kazınması önemlidir. Burada gösterilen, cam örtü kızakları üzerinde büyütülen COS-7 hücreleridir.

Amonyum hidroksit muamelesi, hücre çekirdeği ve aktin hücre iskeletinin kaybıyla belirlenen hücreleri etkili bir şekilde uzaklaştırdı. Bu şekilde, COS-7 hücreleri RFP etiketi trombospondin-1 ile transfekte edildi. Ve ECM, amonyum hidroksit işleminden önce ve sonra görselleştirildi.

Her iki görüntüde de tanımlanan floresan punktanın ECM ile ilişkili olduğu sonucuna varılmıştır. Bu deneyde, insan dermal fibroblastları amonyum hidroksit ile uzaklaştırıldı ve ECM, karakteristik bir fibula ve ağ boyama paterni gösteren anti-kollajen 1 antikoru ile problandı. Burada gösterildiği gibi, amonyum hidroksit ekstrakte edilen sıçan kondrosarkom hücrelerinden ECM üzerinde fibronektin boyaması gerçekleştirildi.

Bu örnekte, test COS-7 hücreleri, RCS hücreleri tarafından üretilen steril ECM üzerine iki saat boyunca kaplandı ve FITC-Phalloidin boyaması ile F-aktin organizasyonu için analiz edildi. Kendi ECM'lerini üreten COS-7 hücreleri ile karşılaştırıldığında. Bu deneyde ECM, sıçan kondrosarkom hücrelerinden izole edildi ve ECM'den türetilen proteinler daha sonra SDS-PAGE ile ayrıldı.

Ve dört ana bant izole edildi ve kütle spektrometresi ile analiz edildi. Fibronektin, trombospondin-1 ve beş ve matrilin-1 tanımlandı. Son olarak, insan dermal fibroblastlarının endojen ECM'si immünoblotlama ile analiz edildi.

Fibronektin ve trombospondin-1 tespit edilirken, hücre içi proteinler alfa-tubulin ve beta-aktin yoktu. Bir kez ustalaştıktan sonra, hücrelerin amonyum hidroksit ile çıkarılması ve ECM'nin üç adet 100 milimetrelik tabaktan sıcak SDS-PAGE numune tamponu ile ekstraksiyonu, uygun şekilde yapılırsa bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, hücreleri çıkarmak için her seferinde taze amonyum hidroksit çalışma solüsyonları yapmayı unutmamak önemlidir.

Tüm hücreleri çıkardığınızdan emin olmak için deiyonize su ile bol miktarda yıkama yapmak da çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, farklı hücre tipleri tarafından üretilen ECM proteinlerinin nispi bolluğu gibi ek soruları yanıtlamak için ekstrakte edilen ECM'nin proteomik analizi gibi yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin hücre kültürü kaplarından verimli bir şekilde nasıl çıkarılacağını ve ECM'nin nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken davlumbazda çalışmak ve kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.