Bir GFP etiketli TMEM184A kullanarak Heparin Reseptör Kimliğinin Onay için Construct

GFP etiketli bir yapı kullanmanın genel amacı, GFP'yi bir tutamak olarak kullanarak daha önce bilinmeyen bir proteinin kimliğini doğrulamaktır. Bu yöntem, doğrulama için spesifik bir enzim aktivitesi mevcut olmadığında yetim genlerin fonksiyonel olarak tanımlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, GPF etiketinin aynı yapının çeşitli deney türleri için kullanılmasına izin vermesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler sorun yaşayabilir, çünkü transfeksiyon her zaman güçlü yapılı ifade ile sonuçlanmaz ve hücreler her zaman canlanmaz. Bu yöntem için ilk olarak, sadece ona karşı oluşturulan antikorları kullanarak bir proteini tanımlamanın zorluklarını tanımaya başladığımızda aklımıza geldi. İlgilenilen hücreleri bir mililitre HEPES tamponlu salin elektroporasyon tamponunda yeniden askıya alarak başlayın ve hücreleri hemen buzun üzerine yerleştirin.

Mililitre DNA başına 20 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için hücrelere yeterli miktarda GFP-TMEM184A etiketli plazma ekleyin ve yaklaşık 0.4 mililitre hücreyi önceden soğutulmuş bir elektroporasyon küvetine aktarın. Hücreleri elektroporate edin. Daha sonra transfekte edilmiş hücreleri doku kültürü kaplarına görün ve bulaşıkları 24 ila 72 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Transfeksiyon adımı, prosedürün en kritik adımıdır, çünkü hücreler canlı değilse ve GFP etiketli yapının önemli seviyelerini ifade etmiyorsa, kalan deneysel çalışmaların çoğu etkili bir şekilde tamamlanamaz. Uygun deneysel zaman noktasında, GFP-plazmid eksprese eden hücre kültürü ortamına mililitre başına 100 mikrogram Rhodamine Heparin ekleyin ve hücreleri, floresan mikroskobu ile gözlemlendiği gibi istenen boyama seviyesine ulaşılana kadar ışıktan korunarak inkübe edin. Daha sonra, hücreleri PBS ile durulayın ve birkaç saniye hafifçe çalkalayın, ışıktan koruyun, ardından hafifçe çalkalama ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.

GFP etiketli Rhodamine Heparin ko-lokalizasyonunu değerlendirmek için, her ayrı etiketleme deneyinden en az 50 hücreyi görüntülemek için uygun GFP ve Rhodamine uyarımı ve azaltılmış lazerler ile konfokal bir mikroskop kullanın. Her bir floresan görüntüdeki hücreleri daire içine almak için serbest bir el aracı kullanarak, her hücredeki göreceli Rhodamine bulgusunu ve alımını belirlemek için görüntüleri uygun görüntü analiz programında inceleyin. Daire içine alınan her alandaki yoğunluğu belirlemek için ölçüm aracını kullanın, ardından her hücre için aynı miktarda alan için arka planı çıkararak yoğunlukla çarpılan alanı hesaplamak için floresan yoğunluğu verilerini bir elektronik tabloya aktarın.

Hücre başına floresan daha sonra istatistiksel olarak anlamlı veriler elde etmek için tüm hücreler için ortalama alınabilir. GFP TMEM184A'den Rhodamine Heparin'e floresan rezonans enerji transferini kolaylaştırmak için, önce sabit GFP'yi TMEM184A transfekte edilmiş Rhodamine Heparin etiketli hücreleri cam mikroskop slaytlarına monte edin. Rhodamine emisyonunu görüntülemek için hücreleri 405 nanometrede uyarın, ardından GFP emisyonunu görüntülemek için 488 nanometrenin uyarılması ile takip edin.

Ardından, ikinci bir Rhodamine emisyon görüntülemesi için hücreleri 561 nanometrede uyarın. Rhodamine Heparin alımının canlı hücre görüntülemesi için, birleşmeye yakın hücreler elde etmek için GFP TMEM184A transfekte edilmiş hücrelerin 100 mililitrelik birleşik çanak kültürünü 635 milimetre canlı hücre görüntüleme kabına tohumlayın. 48 saat sonra, süpernatanı Fenol kırmızısı içermeyen kültür ortamı ile değiştirin ve bir hücre tabağını 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısınma aşaması ile konfokal bir mikroskoba aktarın.

Mikroskobu odaklayın ve hafifçe karıştırarak hücrelere mililitre başına 100 mikrogram Rhodamine Heparin ekleyin. Ardından hemen canlı görüntüleri kaydetmeye başlayın. Görüş alanı içinde Heparin alımı olmazsa, Rhodamine etiketini içeren en az bir yeşil vezikül içeren hücreleri tanımlamak için tabağı hafifçe hareket ettirin.

İn vitro Heparin bağlayıcı değerlendirme için, bir siyah ativan kaplı 96 oyuklu plakayı ve bir siyah kaplanmamış 96 oyuklu plakayı 200 mikrolitre% 0.2 CHAPS PBS pro-well ile çalkalayarak üç beş dakikalık yıkama için durulayın. Son yıkamadan sonra, her GFP bulma grubu için ativan kaplı plakaya üç nüsha halinde biyotinile edilmiş anti-GFP kuyusu başına 100 mikrolitre 60 pikomol ekleyin. Daha sonra, sadece kontrol kuyularına tampon ekleyin ve çalkalama ile oda sıcaklığında iki saatlik bir inkübasyon için tüm kuyucukları bir plaka kapağı ile kapatın.

İnkübasyonun sonunda, az önce gösterildiği gibi tüm kuyucukları CHAPS PBS'de üç kez yıkayın ve ativan kaplı plakadaki uygun kuyucuklara GFP TMEM184A veya tek başına GFP'nin her kuyucuğu başına 100 mikrolitre beş nanomol ekleyin. Çalkalanarak oda sıcaklığında bir saatlik bir inkübasyondan sonra, tüm kuyucukları taze CHAPS PBS ile yıkayın ve her deneysel floresein-Heparin konsantrasyonundan 100 mikrolitreyi, üç nüsha halinde uygun test kuyucuklarına, ativan kaplı plakaya ekleyin. Konsantrasyon standartlarını hem ativan kaplı hem de kaplamasız plakalara ekleyin ve her iki plakayı da oda sıcaklığında, çalkalanarak, ışıktan korunarak 10 dakika inkübe edin.

Şimdi, her iki plakanın kontrol kuyularındaki ilk Heparin-floresan emisyonunu ve ativan kaplı plakadaki hareketsizleştirilmiş GFP veya GFP TMEM184A ile kuyulardan gelen ilk toplam floresan emisyonunu kaydetmek için bir plaka okuyucu kullanın. Daha sonra, bağlanmamış floresan Heparini, hareketsizleştirilmiş GFP TMEM184A veya GFP ile kuyucuklardan, kaplanmamış siyah plakadaki ilgili kuyucuklara aktarın. Kaplanmamış siyah plaka üzerindeki floresan emisyonunu hemen okuduktan sonra, floresein-Heparin'in çıkarıldığı kuyucuklara 100 mikrolitre taze CHAPS PBS ekleyin ve bu kuyucuklar için floresan emisyonlarını okuyun

Tüm bağlanmamış okumalar elde edildiğinde, ortalama arka plan okumalarını değerlerden çıkararak, her bir oyuğa doğru Heparin seviyelerinin eklendiğini doğrulamak için toplam Heparin emisyon değerlerini kullanın. Daha sonra, emisyonun ölçeğini Heparin miktarına karşı belirlemek için eklenen toplam floresein-Heparine karşı emisyonun bir grafiğini oluşturun ve hem GFP hem de GFP TMEM184A kuyucuklarından üçlü kopyalar için eklenen Heparin'e karşı düzeltilmiş bağlı Heparini çizin. Transfeksiyondan sonraki süre, en az 72 saat boyunca birikmiş gibi görünen GFP TMEM184A dağılımını etkiler ve zamanla paranükleer bölgede daha fazla GFP görülür.

Bu temsili vasküler hücre kültüründeki GFP'nin boyama paterni, GFP'nin proteinin C-terminalinde olduğu göz önüne alındığında, mantıklı bir sonuç olan bir C-terminal peptidine karşı yükseltilmiş bir antikorunkine en çok benzer görünmektedir. Bir floresein-Rhodamine-Heparin ligandının kullanımı, zaman içinde ligand reseptörü ko-lokalizasyonunun gerçek zamanlı değerlendirmesi için de kullanılabilir. Heparin alımı, transfekte edilmiş stabil knockdown hücreleri oluşturmak TMEM184A GFP'de artar, bu da Rhodamine Heparin'i vahşi tip hücrelerin seviyesinde veya üzerinde içselleştirme yeteneğini yeniden kazanabilen hücrelerle sonuçlanır.

Gösterilen plazmid kodlu GFP incelik sistemini kullanarak, anti-GFP antikoru izole edilmiş GFP TMEM184A yapısı, spesifik bir satriple Heparin bağlanması gösterirken, kontrol GFP'si herhangi bir Heparin bağlamaz. Yine antikorlarla basit immünofloresan boyama GFP, geçirgen olmayan hücrelerdeki antikor erişimine dayalı olarak GFP konumu hakkında da bilgi sağlayabilir ve plazma zarında eksprese edilen GFP'nin hücre dışı olduğuna dair ön kanıt sağlar. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 24 ila 48 saatlik kültürden sonra mükemmel GFP yapı ifadesi ile sonuçlanabilir.

Canlı görüntüleme protokolünü denerken, bazı hücrelerin kolokalize tutulumu göstermeyebileceğini hatırlamak önemlidir, bu nedenle genellikle diğer hücreleri incelemek gerekir. GFP ligandları ile bağlanma deneyleri, özellikle deterjan misellerinde iseler, GFP proteininin dimer veya daha yüksek dereceli agregatları ile karmaşık hale gelebilir. Genel olarak, GFP etiketli proteinlerin ekspresyonu, daha önce bilinmeyen bir proteinin kimliğini doğrulamak için çok çeşitli deneyleri kolaylaştırabilir.