Name: Bir GFP etiketli TMEM184A kullanarak Heparin Reseptör Kimliğinin Onay için Construct (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Öğrenin, GFP etiketli TMEM184A yapısı kullanarak heparin reseptör kimliğini onaylama yöntemini. Bu teknik, yetim genlerin fonksiyonel tanımlanmasında ve hücre biyolojisi araştırmalarında değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lowe-Krentz laboratuvarındaki araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden LLK'ya yapılan araştırma hibesi HL54269 tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Pugh, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+Protein+184A+Is+a+Receptor+Required+for+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Responses+to+Heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin.</a> J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).</li>
<li>Daher, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27063980">Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P.</a> Mol Biochem Parasitol. , (2016).</li>
<li>Vit, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+membrane+proteins+based+on+analysis+of+trypsin-protected+transmembrane+segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments.</a> J Proteomics. , (2016).</li>
<li>Attwood, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+based+identification+and+comprehensive+classification+of+four-transmembrane+helix+containing+proteins+%284TMs%29+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome.</a> BMC genomics. 17, 268(2016).</li>
<li>Zou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Identification+of+Jatropha+curcas+Aquaporin+Genes+and+the+Comparative+Analysis+Provides+Insights+into+the+Gene+Family+Expansion+and+Evolution+in+Hevea+brasiliensis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis.</a> Front Plant Sci. 7, 395(2016).</li>
<li>Gilotti, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+responses+in+vascular+smooth+muscle+cells+involve+cGMP-dependent+protein+kinase+%28PKG%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG).</a> J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).</li>
<li>Farwell, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+Decreases+in+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+%28TNFalpha%29-induced+Endothelial+Stress+Responses+Require+Transmembrane+Protein+184A+and+Induction+of+Dual+Specificity+Phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1.</a> J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).</li>
<li>Xu, D., Esko, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demystifying+heparan+sulfate-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Demystifying heparan sulfate-protein interactions.</a> Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).</li>
<li>Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin%2FHeparan+sulfate+proteoglycans+glycomic+interactome+in+angiogenesis%3A+biological+implications+and+therapeutical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use.</a> Molecules. 20, 6342-6388 (2015).</li>
<li>Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+realignment+and+cofilin+regulation+are+essential+for+barrier+integrity+during+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress.</a> J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).</li>
<li>Patton, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+heparin-binding+protein+using+monoclonal+antibodies+that+block+heparin+binding+to+porcine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells.</a> The Biochemical journal. 311, Pt 2 461-469 (1995).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Skalamera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+genome+scale+lentiviral+vector+library+for+EF1alpha+promoter-driven+expression+of+human+ORFs+and+identification+of+human+genes+affecting+viral+titer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer.</a> PloS one. 7, 51733(2012).</li>
<li>Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turn-on+switch+in+parathyroid+hormone+receptor+by+a+two-step+parathyroid+hormone+binding+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).</li>
<li>Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+with+the+EGFP-mCherry+fluorescent+protein+pair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair.</a> Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+the+ATP-sensitive+potassium+channel+complex+examined+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer.</a> J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).</li>
<li>Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+a+Potent+Free+Fatty+Acid+Receptor+1+%28FFA1%29+Fluorescent+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer.</a> J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).</li>
<li>Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+rendered+susceptible+to+proteolysis%3A+positions+for+protease-sensitive+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions.</a> Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada bildirilen protokoller vasküler hücrelerde 1 heparin reseptör olarak TMEM184A tanımlanması için doğrulayıcı kanıt sağlamak için tasarlanmıştır. Nakavt teknikler rutin yeni proteinlerin varlığını teyit etmek için, bir mekanizma olarak kullanılır. Ancak, demonte sonra bazı fonksiyon kaybı aday protein aslında doğru reseptör olduğunu yeterli kanıt (ya da diğer fonksiyonel protein), tipik değildir. Aday proteini aslında işlevi sergiler dair kanıt olması da önemlidir. GFP ile etiketlenmiş yeni ...

yeni işlevler için aday proteinlerin tanımlanması genellikle kısmi sekans belirleme ardından afinite bazlı yalıtım protokolleri bağlıdır. Yeni tanımlanmış proteinlerin son örnekleri transmembran proteini 184a (TMEM184A), heparin afinite etkileşimleri 1 sonra belirlenen bir heparin reseptörü ve TgPH1, fosfoinositid PI (3,5) P2 2 bağlanan bir pleckstrin homoloji alanı protein içerir. Diğer yeni protein tanımlama gibi, diğerleri Vit tarafından bu kadar peptidler doğrudan dizisi analizini içerir. kim daha önce uncharacterized genlerden 3 protein ürünleri tanımlamak için zar peptitler kullanılır. Benzer şekilde, yeni protein sekanslarının tanımlanması gibi, yeni 4tm proteinlerin 4 tanımlanması daha önce, özelliği protein aileleri arayan biyoinformatik kullanılarak gerçekleştirilebilir. aquaporin ailesi geni dizilerinin incelenmesi al varböylece yeni fonksiyonlar 5 ile yeni üyelerin belirlenmesi vermiştir. belirlenmesinden sonra, protein fonksiyonlarının analizi bazen aquaporin durumunda olduğu gibi protein fonksiyonunun belli bir tahlil kullanılarak incelenebilir bir sonraki adım, tipik olarak. Mümkün olduğunda, yeni tanımlanan proteinin fonksiyonu belirli bir enzimatik ya da benzer bir in vitro işlevi testleri ile kontrol edilebilir. Yeni proteinlere birçok fonksiyonu in vitro deneyler, sadece dokunulmamış hücreler ya da organizmalar meydana karmaşık etkileşimler bağlıdır, çünkü her zaman etkili değildir. Bununla birlikte, in vivo deneyler, bu gen sekansına bağlı olduğu bir şekilde tasarlanmalıdır. Hücre kültürü ve / veya basit bir model organizmalarda, demonte protein / fonksiyon tanımlama 6 destekleyici kanıt sağlayabilir. Yukarıda belirtildiği gibi, tanımlanan yeni proteinler ile, bir, fonksiyonu teyit etmek için, sadece bir proteini yıkmak genellikle yetersizdirD gen sekansı bağlıdır, in vivo fonksiyonel analizlerin tasarım yeni proteinlerin karakterizasyonu için önemli hale gelir. Demonte tanımlama ile tutarlı sonuçlar sonra heparin reseptör olarak TMEM184A son tespiti afinite kromatografisi ve MALDI MS 1 kullanarak (diğer bir deyişle damar düz kas ve endotel hücrelerinde enflamatuar yanıtlarda çoğalmasını modüle eden), 7 deneylerin kümesi geliştirmek için bir fırsat temin . Yeni bir gözden heparin birçok büyüme faktörleri, reseptörler, hücre dışı matris bileşenleri, hücre yapışma reseptörlerinin, ve diğer proteinlerin 8 ile spesifik olarak etkileşime doğruladı. Damar sistemi, heparin ve heparan sülfat proteoglikanlardan olarak birkaç yüz proteinler, 9 ile etkileşim (heparin yapı içindeki heparan sülfat zincirlerini içeren). işlevsel tha onaylamak içint TMEM184A heparin alımı ve bağlama ile yer aldı, TMEM184A için gen yapısını istihdam teknikleri geliştirilmiştir. Bu rapor bir GFP-TMEM184A dayalı tahliller bir koleksiyon bir heparin reseptörü olarak TMEM184A kimliğini teyit kullanılmak üzere inşa içerir.

<table><tbody><tr><td>GFP-TMEM184A</td>, <td>OriGene</td><td>RG213192</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-Heparin</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-204</td><td>Işığa Duyarlı</td></tr><tr><td>Floresein-Heparin</td><td>Creative PEGWorks</td><td>HP-201</td><td>Işığa Duyarlı</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>EMD Millipore</td><td>475904-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA, metanol içermez)</td> <td>Thermo Sci Pierce Biotech, Fisher Scientific</td><td>aracılığıyla edinilebilir PI28908 Fisher'da Çeker</td><td>ocakta kullanım</td></tr><tr><td>Reacti-bind nötravidin plakaları (Avidin kaplı siyah 96 kuyulu tabaklar)</td><td>Thermo Sci Pierce Biotech, Fisher Scientific aracılığıyla</td><td>Fisher'da PI15510</td><td>Raf ömrüne dikkat edin</td></tr><tr><td>Siyah 96 oyuklu plakalar</td><td>Fisher</td><td></td>A7r5'teki <td>Fisher Scientific 064432 aracılığıyla satın alınan Corning Life Sciences Plastic</td></tr><tr><td> hat</td><td>ATCC</td><td>CRL 1444</td><td>MEM ortamına değiştirilebilir1</td></tr><tr><td>BAOEC sığır aort endotel hücreleri</td><td>Hücre Uygulamaları, Inc.</td><td>B304-05</td><td>Kültür, başlangıçta önerildiği gibi, devam eden kültür1,7</td></tr><tr><td>BAOSMC sığır aort düz kas hücreleri</td> için MEM ortamına değiştirilebilir <td>Cell Applications, Inc.</td><td>B354-05</td><td>Başlangıçta önerildiği gibi kültür, devam eden kültür1</sup</td></tr><tr><td>>RAOEC sıçan aort endotel hücreleri</td> için MEM ortamına değiştirilebilir <td>Cell Applications, Inc.</td><td>R304-05a</td> Kültür, başlangıçta önerildiği gibi, Fisher Scientific MA5-15256-BTIN <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin kaplı boncuklar</td><td>Sigma</td><td>S1638</td><td></td></tr><tr><td>HeBS</td><td></td><td></td> aracılığıyla devam eden kültür<7 / sup> için MEM ortamına değiştirilebilir.<td> pH,</td></tr><tr>N-terminali <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc292006'ya</td> karşı TMEM184A 6.8<td>antikordur</td><td>Sadece N-terminal bölgesine karşı bilinen TMEM184A antikorudur.</td></tr><tr><td>ProSci Inc, Poway, CA&nbsp'den elde</td> <td>edilen C-terminaline karşı TMEM184A antikor</td>;<td>Pro Sci 5681</td><td>ProSci, <güçlü>Şekil 1</güçlü></td></tr><tr><td>GFP antikorlarında</td> kullanılır <td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc9996</td><td><güçlü>Şekil 5</güçlü></td></tr><tr><td>ikincil antikorlarda kullanılır, TRITC veya Cy3 ile etiketlenmiş</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA</td><td>711 025 152 (eşek anti-tavşan, TRITC) 715 165 150 (eşek anti-fare, Cy3)</td> <td>Spesifik olmayan lekelenmeyi en aza indirmek için minimum çapraz reaktivite.</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C5849'dan</td> Satın Alındı <td>Bu özel katalog numarasının kullanımdan kaldırıldığını unutmayın. Tedarikçi, değiştirme ile ilgili bilgi sağlayacaktır.</td></tr><tr><td>Canlı görüntüleme 35 mm çanaklar</td><td>MatTek (Ashland MA)</td><td>P35G-1.0 & ndash; 20 mm - C</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta, 63X yağa daldırma lensli</td><td><güçlü> görüntüler ve canlı görüntüleme için kullanılır Şekil 1, 2 ve 3</güçlü></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>C2+ 60X yağa daldırma lensli konfokal</td><td><güçlü>Şekil 5</güçlü></td></tr> <tr><td>görüntüler için kullanılırKonfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 880, 63X yağa daldırma lensli</td><td><güçlü>Şekil 2C</güçlü></td></tr><tr><td>Elektroporasyon ekipmanındaki</td> görüntüler için kullanılır <td>Bio-Rad</td><td>Gen Pulser X-Hücre Sistemi</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon küvetleri</td><td>MidSci EC2L'den temin edilebilir</td><td></td><td>Ekipman tedarikçisinden de temin edilebilir</td></tr><tr><td>Plaka okuyucu</td><td>TECAN</td><td>TECAN Infinite&reg; m200 Pro plaka okuyucu</td><td>Kuyuların yüzeyinden ziyade ortasında okumalar.</td></tr><tr><td>Boyama yoğunluğunu ölçmek için bilgisayar programı</td><td>Resim J</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ Program ve bilgiler on-line olarak mevcut</td><td>herhangi bir uygun program kullanılabilir. Daha fazla ayrıntı için https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html bakın&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü tripsin çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>T4174</td>, <td>10x çözelti olarak satın alındı</td></tr></tbody></table>

bir gfp etiketli tmem184a kullanarak heparin reseptör kimliğinin onay için construct

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

yeni proteinler afinite bazlı izolasyon ve biyoinformatik analizi ile tespit edildiğinde, genellikle büyük ölçüde uncharacterized vardır. tahmin edilen dizi içinde spesifik peptitler karşı antikorlar bir yer belirleme deneyleri sağlar. Bununla birlikte, antikorlar diğer muhtemel etkileşimleri genellikle göz ardı edilemez. Bu durum, protein dizisinin bağımlı testlerin bir dizi geliştirmek için bir fırsat sağladı. Özel olarak, proteinin C-terminal ucunda, GFP kodlama sekansına bağlanmış bir gen sekansı ihtiva eden bir yapı elde edilmiş ve bu amaçlar için kullanılmıştır. Deneyler lokalizasyonu, ligand afinitesi karakterize etmek için, ve fonksiyon kazancı ilk olarak tasarlanmış ve bir heparin reseptör 1 ile TMEM184A varlığını teyit etmek için gerçekleştirildi. Buna ek olarak, yapı, membran topolojisi sorular ve ayrıntılı bir protein-ligand etkileşimine yönelik çalışmaları için kullanılabilir. Bu rapor, ar sunarKolayca diğer yeni proteinler için adapte edilebilir vasküler hücrelerde GFP-TMEM184A yapısı temel alan deneysel protokollerinin ange.

Teorik olarak, herhangi bir DNA transfeksiyon lipofilik transfeksiyon reaktifleri ile başarılabilir yapısının hücreler içine, birlikte, daha önceki raporlar GFP daha etkili transfeksiyon, elektroporasyon 12 ile endotel hücrelerine yapıları göstermektedir. Burada verilen protokol, tipik olarak kullanılan primer endotel hücreleri ve düz kas hücreleri% 80&#39;den ekspresyonu GFP-yapı elde. Kullanılan yapı tasarımı hızla bu yapı teslim olabilir piyasada mevcut olan si...

Ökaryotik ekspresyon için tasarlanan karboksi-terminalinde bir GFP etiketli bir konstrukt şifreleyen TMEM184A, vasküler hücrelerde heparin reseptör olarak TMEM184A varlığını teyit etmek için tasarlanan deneylerde kullanılmıştır.

Bir GFP etiketli TMEM184A kullanarak Heparin Reseptör Kimliğinin Onay için Construct

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

GFP etiketli bir yapı kullanmanın genel amacı, GFP'yi bir tutamak olarak kullanarak daha önce bilinmeyen bir proteinin kimliğini doğrulamaktır. Bu yöntem, doğrulama için spesifik bir enzim aktivitesi mevcut olmadığında yetim genlerin fonksiyonel olarak tanımlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, GPF etiketinin aynı yapının çeşitli deney türleri için kullanılmasına izin vermesidir.Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler sorun yaşayabilir, çünkü transfeksiyon her zaman güçlü yapılı ifade ile sonuçlanmaz ve hücreler her zaman canlanmaz. Bu yöntem için ilk olarak, sadece ona karşı oluşturulan antikorları kullanarak bir proteini tanımlamanın zorluklarını tanımaya başladığımızda aklımıza geldi. İlgilenilen hücreleri bir mililitre HEPES tamponlu salin elektroporasyon tamponunda yeniden askıya alarak başlayın ve hücreleri hemen buzun üzerine yerleştirin.Mililitre DNA başına 20 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için hücrelere yeterli miktarda GFP-TMEM184A etiketli plazma ekleyin ve yaklaşık 0.4 mililitre hücreyi önceden soğutulmuş bir elektroporasyon küvetine aktarın. Hücreleri elektroporate edin. Daha sonra transfekte edilmiş hücreleri doku kültürü kaplarına görün ve bulaşıkları 24 ila 72 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Transfeksiyon adımı, prosedürün en kritik adımıdır, çünkü hücreler canlı değilse ve GFP etiketli yapının önemli seviyelerini ifade etmiyorsa, kalan deneysel çalışmaların çoğu etkili bir şekilde tamamlanamaz. Uygun deneysel zaman noktasında, GFP-plazmid eksprese eden hücre kültürü ortamına mililitre başına 100 mikrogram Rhodamine Heparin ekleyin ve hücreleri, floresan mikroskobu ile gözlemlendiği gibi istenen boyama seviyesine ulaşılana kadar ışıktan korunarak inkübe edin. Daha sonra, hücreleri PBS ile durulayın ve birkaç saniye hafifçe çalkalayın, ışıktan koruyun, ardından hafifçe çalkalama ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.GFP etiketli Rhodamine Heparin ko-lokalizasyonunu değerlendirmek için, her ayrı etiketleme deneyinden en az 50 hücreyi görüntülemek için uygun GFP ve Rhodamine uyarımı ve azaltılmış lazerler ile konfokal bir mikroskop kullanın. Her bir floresan görüntüdeki hücreleri daire içine almak için serbest bir el aracı kullanarak, her hücredeki göreceli Rhodamine bulgusunu ve alımını belirlemek için görüntüleri uygun görüntü analiz programında inceleyin. Daire içine alınan her alandaki yoğunluğu belirlemek için ölçüm aracını kullanın, ardından her hücre için aynı miktarda alan için arka planı çıkararak yoğunlukla çarpılan alanı hesaplamak için floresan yoğunluğu verilerini bir elektronik tabloya aktarın.Hücre başına floresan daha sonra istatistiksel olarak anlamlı veriler elde etmek için tüm hücreler için ortalama alınabilir. GFP TMEM184A'den Rhodamine Heparin'e floresan rezonans enerji transferini kolaylaştırmak için, önce sabit GFP'yi TMEM184A transfekte edilmiş Rhodamine Heparin etiketli hücreleri cam mikroskop slaytlarına monte edin. Rhodamine emisyonunu görüntülemek için hücreleri 405 nanometrede uyarın, ardından GFP emisyonunu görüntülemek için 488 nanometrenin uyarılması ile takip edin.Ardından, ikinci bir Rhodamine emisyon görüntülemesi için hücreleri 561 nanometrede uyarın. Rhodamine Heparin alımının canlı hücre görüntülemesi için, birleşmeye yakın hücreler elde etmek için GFP TMEM184A transfekte edilmiş hücrelerin 100 mililitrelik birleşik çanak kültürünü 635 milimetre canlı hücre görüntüleme kabına tohumlayın. 48 saat sonra, süpernatanı Fenol kırmızısı içermeyen kültür ortamı ile değiştirin ve bir hücre tabağını 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısınma aşaması ile konfokal bir mikroskoba aktarın.Mikroskobu odaklayın ve hafifçe karıştırarak hücrelere mililitre başına 100 mikrogram Rhodamine Heparin ekleyin. Ardından hemen canlı görüntüleri kaydetmeye başlayın. Görüş alanı içinde Heparin alımı olmazsa, Rhodamine etiketini içeren en az bir yeşil vezikül içeren hücreleri tanımlamak için tabağı hafifçe hareket ettirin.İn vitro Heparin bağlayıcı değerlendirme için, bir siyah ativan kaplı 96 oyuklu plakayı ve bir siyah kaplanmamış 96 oyuklu plakayı 200 mikrolitre% 0.2 CHAPS PBS pro-well ile çalkalayarak üç beş dakikalık yıkama için durulayın. Son yıkamadan sonra, her GFP bulma grubu için ativan kaplı plakaya üç nüsha halinde biyotinile edilmiş anti-GFP kuyusu başına 100 mikrolitre 60 pikomol ekleyin. Daha sonra, sadece kontrol kuyularına tampon ekleyin ve çalkalama ile oda sıcaklığında iki saatlik bir inkübasyon için tüm kuyucukları bir plaka kapağı ile kapatın.İnkübasyonun sonunda, az önce gösterildiği gibi tüm kuyucukları CHAPS PBS'de üç kez yıkayın ve ativan kaplı plakadaki uygun kuyucuklara GFP TMEM184A veya tek başına GFP'nin her kuyucuğu başına 100 mikrolitre beş nanomol ekleyin. Çalkalanarak oda sıcaklığında bir saatlik bir inkübasyondan sonra, tüm kuyucukları taze CHAPS PBS ile yıkayın ve her deneysel floresein-Heparin konsantrasyonundan 100 mikrolitreyi, üç nüsha halinde uygun test kuyucuklarına, ativan kaplı plakaya ekleyin. Konsantrasyon standartlarını hem ativan kaplı hem de kaplamasız plakalara ekleyin ve her iki plakayı da oda sıcaklığında, çalkalanarak, ışıktan korunarak 10 dakika inkübe edin.Şimdi, her iki plakanın kontrol kuyularındaki ilk Heparin-floresan emisyonunu ve ativan kaplı plakadaki hareketsizleştirilmiş GFP veya GFP TMEM184A ile kuyulardan gelen ilk toplam floresan emisyonunu kaydetmek için bir plaka okuyucu kullanın. Daha sonra, bağlanmamış floresan Heparini, hareketsizleştirilmiş GFP TMEM184A veya GFP ile kuyucuklardan, kaplanmamış siyah plakadaki ilgili kuyucuklara aktarın. Kaplanmamış siyah plaka üzerindeki floresan emisyonunu hemen okuduktan sonra, floresein-Heparin'in çıkarıldığı kuyucuklara 100 mikrolitre taze CHAPS PBS ekleyin ve bu kuyucuklar için floresan emisyonlarını okuyun.Tüm bağlanmamış okumalar elde edildiğinde, ortalama arka plan okumalarını değerlerden çıkararak, her bir oyuğa doğru Heparin seviyelerinin eklendiğini doğrulamak için toplam Heparin emisyon değerlerini kullanın. Daha sonra, emisyonun ölçeğini Heparin miktarına karşı belirlemek için eklenen toplam floresein-Heparine karşı emisyonun bir grafiğini oluşturun ve hem GFP hem de GFP TMEM184A kuyucuklarından üçlü kopyalar için eklenen Heparin'e karşı düzeltilmiş bağlı Heparini çizin. Transfeksiyondan sonraki süre, en az 72 saat boyunca birikmiş gibi görünen GFP TMEM184A dağılımını etkiler ve zamanla paranükleer bölgede daha fazla GFP görülür.Bu temsili vasküler hücre kültüründeki GFP'nin boyama paterni, GFP'nin proteinin C-terminalinde olduğu göz önüne alındığında, mantıklı bir sonuç olan bir C-terminal peptidine karşı yükseltilmiş bir antikorunkine en çok benzer görünmektedir. Bir floresein-Rhodamine-Heparin ligandının kullanımı, zaman içinde ligand reseptörü ko-lokalizasyonunun gerçek zamanlı değerlendirmesi için de kullanılabilir. Heparin alımı, transfekte edilmiş stabil knockdown hücreleri oluşturmak TMEM184A GFP'de artar, bu da Rhodamine Heparin'i vahşi tip hücrelerin seviyesinde veya üzerinde içselleştirme yeteneğini yeniden kazanabilen hücrelerle sonuçlanır.Gösterilen plazmid kodlu GFP incelik sistemini kullanarak, anti-GFP antikoru izole edilmiş GFP TMEM184A yapısı, spesifik bir satriple Heparin bağlanması gösterirken, kontrol GFP'si herhangi bir Heparin bağlamaz. Yine antikorlarla basit immünofloresan boyama GFP, geçirgen olmayan hücrelerdeki antikor erişimine dayalı olarak GFP konumu hakkında da bilgi sağlayabilir ve plazma zarında eksprese edilen GFP'nin hücre dışı olduğuna dair ön kanıt sağlar. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 24 ila 48 saatlik kültürden sonra mükemmel GFP yapı ifadesi ile sonuçlanabilir.Canlı görüntüleme protokolünü denerken, bazı hücrelerin kolokalize tutulumu göstermeyebileceğini hatırlamak önemlidir, bu nedenle genellikle diğer hücreleri incelemek gerekir. GFP ligandları ile bağlanma deneyleri, özellikle deterjan misellerinde iseler, GFP proteininin dimer veya daha yüksek dereceli agregatları ile karmaşık hale gelebilir. Genel olarak, GFP etiketli proteinlerin ekspresyonu, daha önce bilinmeyen bir proteinin kimliğini doğrulamak için çok çeşitli deneyleri kolaylaştırabilir.

using-gfp-tagged-tmem184a-construct-for-confirmation-heparin-receptor

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

Burada GABA hipokampal nöronlar bir reseptör yüzey lokalizasyonu ve, endositoz ölçmek için α-bungarotoksin bağlanmış flüoresan Alexa boya kullanımını göstermektedir. Α-bungarotoksin, plazma zar proteini endositik ticaretinin analiz elde edilebilir bağlanan kısa bir hücre dışı bir etiket taşıyan konstruktların kullanımı yoluyla.

GABA A reseptör Membran Yerelleşme ve Ticareti Eğitim için bir α-bungarotoksin Bağlama Sitesi Tag Kullanımı

Bu el yazması, işlevselleştirilmiş düzlemsel destekli lipid çift tabakası ile temas halinde olan bir T hücresinin immünolojik sinapsı içinde meydana gelirken, T hücresi antijen reseptörü (TCR) ile antijenik peptit yüklü MHC molekülleri arasındaki bağlanma dinamiklerini ölçmek için (tek moleküllü) Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) tabanlı testlerin nasıl yapılacağını açıklar.

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

Nükleer zarf proteinleri birçok temel biyolojik süreçte merkezi bir rol oynar ve çeşitli insan hastalıklarında rol oynamıştır.  Bu protokol, LINC komplekslerinin bozulmasının uzay-zamansal kontrolüne izin veren yeni bir Cre/Lox tabanlı fare modelini açıklar.

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Kalıtsal kardiyak aritmiler genellikle bir veya daha fazla iyon kanallarının yüzey teslim değiştiren mutasyonlar neden olur. Burada, TSA-201 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanallarının göreli ve toplam hücre yüzeyi protein ekspresyonunun bir ölçümünü sağlamak için tahliller flow sitometri uyum sağlar.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Bu makalede, ayrılmış primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptörü (GluR) kaçakçılığı çalışması için bir yöntem sunulur. Endojen veya aşırı ifade reseptörlerinin farmakolojik yaklaşımlar ile birlikte etiketlenmesi için antikor beslemeli bir yaklaşım kullanarak, bu yöntem, GluR yüzey ifadesini düzenleyen moleküler mekanizmaların belirlenmesi için izin verir veya geri dönüşüm süreçleri.

Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı

Bu el yazması, hücre dışı reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için genom ölçeğinde hücre tabanlı tarama yaklaşımını açıklamaktadır.

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Bu makalede, Saccharomyces cerevisiae'de aşırı ifade edilen Candida albicans ABC (ATP bağlayıcı kaset) protein Cdr1'in karakterizasyonu için küçük ölçekli bir plazma membran izolasyon protokolü sunulmaktadır. Cdr1 ile etiket arasında 16 kalıntılı bağlayıcı bulunan proteaz-bölünebilir C-terminal mGFPHis çift etiket, Cdr1'in saflaştırılmasını ve deterjan taramasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.

Candida albicans Cdr1-mGFPHis Analizi için Küçük Ölçekli Plazma Membran Hazırlama

Öğrenin, GFP etiketli TMEM184A yapısı kullanarak heparin reseptör kimliğini onaylama yöntemini. Bu teknik, yetim genlerin fonksiyonel tanımlanmasında ve hücre biyolojisi araştırmalarında değerli bir araçtır.

Bir GFP etiketli TMEM184A kullanarak Heparin Reseptör Kimliğinin Onay için Construct

Daha fazla video keşfet