Name: Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Keşfedin periferik kan mikroveziküllerinin izolasyon ve karakterizasyon yöntemini. Akış sitometrisi ve Western Blotting ile analiz edilen bu teknik, tümör biyobelirteçleri geliştirmeye yönelik hızlı bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Meike Schaffrinski'ye mükemmel teknik yardım için teşekkür ediyor. Periferik kan örneklerinin toplanmasındaki yardımları için aşağıdaki kişilere teşekkür ederiz (tümü Göttingen Üniversitesi Tıp Merkezi'nden): Henrietta Vida (Transfüzyon Tıbbı Bölümü), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Genel, İç Organ ve Pediatrik Cerrahi Bölümü), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Beyin Cerrahisi Bölümü), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Kulak Burun Boğaz Bölümü, Baş ve Boyun Cerrahisi) ve tüm çalışanları interdisipliner kısa süreli onkoloji. Dirk Wenzel'e (Max Planck Biyofiziksel Kimya Enstitüsü, Göttingen) MV'lerin elektron mikroskobu konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. 
Çalışma, Alman Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF) projesi MetastaSys (hibe no. 0316173) ve Alman Kanser Yardımı (hibe no. 109615) tarafından finanse edilmiştir.

İnsan deneklerle dahil olmak üzere tüm deneyler yerel etik kurul (onay no. 3/2/14) tarafından onaylanmıştır. Hastaların seçimi için tür, yaş, cinsiyet, mevcut tedavi rejimleri ve bu nedenle kandaki OG bileşim etkilemek olabilir ve daha pek çok çeşitli faktörler toplama 22,23 örnek önceden dikkate alınması gerektiği not edilmelidir. Plazma örneklerinin hazırlanması 1. <ol><li> EDTA (1.6 mg / ml kan) içeren bir vacutainer kan toplama tüpüne 21-gauge kelebek iğne ile donör başına kan 2 tüpleri - 1 çizin. verimli kan antikoagülan garanti tüp (ler) birkaç kez ters emin olun. Not: - 15 ml daha sonra akış sitometrisi ve Western Blot analizi için kan önerilen hacmi 5&#39;tir. OG bozulmasını ve kaybını önlemek için, kan örnekleri 30 dakika kan kesildikten sonra &lt;ele alınmalıdır. </li><li> 1.200 x g&#39;de 15 dakika süre ile numuneler santrifüj ile plazma numunelerinin hazırlanmasıOda sıcaklığında (RT). </li><li> kan hücreleri (= alt tabaka) geri kalan plazma (= üst tabaka) ayrılmasını yardımcı olmak için bir valf filtre uygulanır. </li><li> 15 ml tüp içine plazma aktarın. </li><li> 1,500 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj, RT daha büyük hücre yıkıntıları pelet haline geri kalan trombositleri çıkarmak için. </li><li> 15 ml tüp içine süpernatant aktarın ve doğrudan -20 ° C&#39;de 6 aya kadar OG yalıtım veya mağaza örnekleri devam edin. NOT: Sunulan protokol, aynı zamanda, hücre kültür süpernatanlarından MVs (ve EXOS) izole etmek için kullanılabilir. 24 için% 80 birleşme - - bunun için, 60 hücrelerinin kültive vezikül tükenmiş FCS ile takviyeli kültür ortamında 48 saat, ve daha sonra supernatant toplamak. 750 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C&#39;de santrifüj kalıntı kayan hücreleri tüketir büyük hücre yıkıntıları pelet haline getirildi 1500 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca tekrar yeni bir 15 ml tüp ve santrifüj içine süpernatant doldurun. Bu yüzer madde daha sonra MVs izolasyonu için kullanılabilmektedir2.16 - Adım 2.1 açıklandığı gibi. </li></ol> MVS 2. izolasyonu <ol><li> uygun bir santrifüj tüpü içinde plazma örneği aktarın. Gerekirse, santrifüj işlemi sırasında ince duvarlı borular çöküşü numunenin seyreltilmesi ve önlemek amacıyla PBS ile tüp doldurun. </li><li> 14.000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 35 dakika boyunca santrifüje. </li><li> Durusu süpernatant, tüpler ters döndü ve bir kağıt havlu üzerine koymak tutun. Kalan tüm yüzer havlu batırılmış ve bu şekilde örnek çıkarılana kadar 5 dakika - 3 bekleyin. </li><li> 1000 uL PBS MV pelletini, bir masa üstü santrifüjü içinde 14,000 x g&#39;de 4 ° C&#39;de 35 dakika boyunca 1.5 ml tüp ve santrifüj aktarın. </li><li> Süpernatant aspire. </li><li> pelet boyutuna bağlı olarak, 500 ul PBS - 50 MV pelletini. Seçenek olarak ise, RIPA tamponu içinde, örneğin, doğrudan lize MVs, (150 mM NaCI /% 0.1 SDS /% 0.5 Na-deoksikolat /% 1 Triton X-100/50 mM Tris, pH 7.2)daha sonra Western blot analizi için. -20 ° C&#39;de saklayın MVs. Onlar birkaç ay boyunca stabil kalır, ancak tekrarlanan donma-çözülme-döngüleri önlemek olacaktır. </li><li> İsteğe bağlı MV verim değerlendirmek ve daha sonraki deneyler için MVs dozlanması amacıyla bir protein tahlili ile OG protein konsantrasyonu (örneğin, Bradford ve Lowry metodu) belirler. </li><li> Ek Exos Plazma örneklerinden izole edilecekse, 110,000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de, 2 saat için bir ultra-santrifuj tüpü ve santrifüj içine adım 2.3 süpernatant süzün. Aşama 2.3&#39;te tarif edildiği gibi süpernatant tortusundan ayırma, 1000 uL PBS Exo pelet tekrar süspansiyon ve küçük (1.5 mL) ultrasantrifügasyon tüplere aktarın. <ol><li> 75 uL PBS veya RIPA tamponu - 50 110.000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de, aspirat süpernatan ve tekrar süspansiyon Ekzo pelet, 2 saat süre ile ultra santrifüj. </li></ol></li></ol> Akış Sitometrisi ile MVS 3. Karakterizasyonu <ol><li> Aktarım 15 uL PBS +% 1 vezikül tüketilmiş sığır fetüs serumu (Fbir akış sitometrisi tüp CS). Not: Vezikül tükenmiş FCS, daha önce, 24 tarif edilen şekilde 0.2 um&#39;lik bir filtre boyunca süpernatan 110,000 x g&#39;de 18 saat FCS (56 ° C&#39;de 30 dakika) ısı ile inaktive edilmiş santrifüj ve süzme yolu ile hazırlanır. </li><li> PBS içinde MVs (3 ug de geçerlidir düşük verim durumunda) 5 ug ekleyin. </li><li> OG yüzeyindeki spesifik olmayan bağlama merkezlerini bloke edebilir ve böylece arka plan boyama azaltmak için, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Protein-faiz karşı floresan etiketli antikor ekleyin. düşük bir sinyal-gürültü oranı optimal konsantrasyonunu belirlemek ve garanti etmek amacıyla kullanılmadan önce Boyama için kullanılan antikor miktarının titre edilir. Ayrıca negatif kontrol olarak lekesiz MVS ile bir tüp ve (antikor 1 ug kullanılması durumunda, örneğin, aynı zamanda izotop kontrol An 1 mikrogram kullanımı aynı konsantrasyonda eşleşen izotip kontrol antikoru ile boyandı MVS bir tüp dahil emin oluntibody) arka plan boyama ölçmek için. Not: Bu farklı fluorochromes bağlanmış bir çok antikor eklenerek sitometri renkli akış gerçekleştirmek de mümkündür. </li><li> karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 250 uL PBS ilave edin ve bir akış sitometrisi kullanılarak numunenin ölçüm devam edin. <ol><li> halinde numuneleri hemen ölçülemez ki 4 ° C&#39;de örnekleri ve mağaza düzeltmek için 150 uL PBS ve 50 uL% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. UYARI: PFA zehirlidir. eldiven ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. </li></ol></li><li> mümkün olan en düşük değere akış sitometresi eşiğini azaltın ve logaritmik ölçekte yan dağılım (SSC) arsa karşı ileri dağılım (FSC) kullanılarak OG nüfus arayın. OG nüfus Kapısı ve buna karşılık gelen bir histogram floresan sinyali değerlendirir. </li></ol> Western Blot tarafından MVS 4. Karakterizasyonu <ol><li> doğrudan MV peletUygun bir liziz tamponu (örneğin, RIPA tamponu). <ol><li> Uygun bir liziz tamponu (örneğin, RIPA tamponu) içinde 1: MV pelet daha önce PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş edilmiş durumda, en az 1 seyreltin. </li></ol></li><li> Lowry testi ile OG numunenin protein konsantrasyonu, örneğin, belirleme. </li><li> 22.5 ul RIPA tamponunda MVS 20 ug - 10 hazırlayın. Daha sonra 95 ° C de 5 dakika boyunca 7.5 mL 4 x Laemmli yükleme tamponu ve ısıtılır. </li><li> bir poliakrilamit jeli üzerinde Numuneleri ve standart protokollere göre immunoblotting gerçekleştirin. </li><li> zarı üzerine proteinleri aktarıldıktan sonra, standart protokollere göre, bir yükleme kontrolü olarak bir Ponceau boyama yapar. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle TBST içinde destain membran. </li><li> TBST içinde% 5 BSA, oda sıcaklığında en fazla 1 saat 30 dakika boyunca blok membran. </li><li> gece boyunca ya da oda sıcaklığında 2 saat boyunca 4 ° C &#39;de primer antikor ile membran inkübe edin. </li><li> TBST&#39;dir 3 x 5 dakika ile membran yıkayın.</li><li> 1 bir seyreltme HRP ile birleştirilmiş ikincil antikor ile membran inkübe: 10,000,% 5 BSA. Not: Yüksek plan sinyalleri durumunda yerine BSA süt tozu kullanımı. </li><li> TBST 3x 5 dakika ile membran yıkayın. </li><li> Bir ECL algılama reaktifi ile membran geliştirmek ve chemilüminesan film ya da bir kemilüminesans görüntüleme sistemi sinyalleri algılar. Not: EXOS gelen MVs ayırt etmek için, tubulin benzeri proteinler kullanılabilir 4-aktinin veya mitofilin esas MVs 16,25 mevcut olması gereken. EXOS için markerler olarak kullanılan en tetraspanin antikorları (örneğin, CD9, CD81), indirgeyici koşullar altında çalışmaz ve bu nedenle 70 ° C &#39;de 10 dakika süre ile ısıtıldı, ardından indirgeyici olmayan yükleme tamponunda hazırlanmalıdır dikkat ediniz. </li></ol>

<ol><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4 (0), (2015).</li>
<li>Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+and+Glioblastoma+cells+release+exosomes+carrying+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA.</a> J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).</li>
<li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nat Commun. 2, 180(2011).</li>
<li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+ras-driven+cancer+cell+vesiculation+leads+to+emission+of+double-stranded+DNA+capable+of+interacting+with+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).</li>
<li>Chi, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+trail+left+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The tumour trail left in blood.</a> Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).</li>
<li>Pisitkun, T., Shen, R. -F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).</li>
<li>Harrington, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+and+biochemistry+of+nanostructures+provide+evidence+for+synthesis+and+signaling+functions+in+human+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebrospinal+Fluid+Res%22%5BJournal%5D)">The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid.</a> Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10(2009).</li>
<li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).</li>
<li>Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).</li>
<li>Nieuwland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+and+procoagulant+properties+of+microparticles+in+meningococcal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis.</a> Blood. 95 (3), 930-935 (2000).</li>
<li>Mfonkeu, J. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Cell-Specific+Microparticles+Are+a+Biological+Marker+for+Cerebral+Dysfunctions+in+Human+Severe+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria.</a> PLoS One. 5 (10), e13415(2010).</li>
<li>Parker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+inflammation+reduces+endothelial+microparticles+in+active+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus.</a> Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).</li>
<li>Nozaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+endothelial+microparticles+in+patients+with+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure.</a> Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).</li>
<li>Galindo-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+concentration+of+microvesicles+isolated+from+peripheral+blood+in+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients.</a> Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).</li>
<li>Menck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+microvesicles+mediate+human+breast+cancer+invasion+through+differentially+glycosylated+EMMPRIN%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN.</a> J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).</li>
<li>Moon, P. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Developmental+Endothelial+Locus-1+on+Circulating+Extracellular+Vesicles+as+a+Novel+Biomarker+for+Early+Breast+Cancer+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection.</a> Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).</li>
<li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypican-1+identifies+cancer+exosomes+and+detects+early+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.</a> Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).</li>
<li>Kahlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Double-stranded+Genomic+DNA+Spanning+All+Chromosomes+with+Mutated+KRAS+and+p53+DNA+in+the+Serum+Exosomes+of+Patients+with+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer.</a> J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).</li>
<li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+typing+of+circulating+microvesicles+allows+real-time+monitoring+of+glioblastoma+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy.</a> Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).</li>
<li>Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+RNA-Containing+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes.</a> J Vis Exp. (59), (2012).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracell Vesicles. 2 (0), (2013).</li>
<li>Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+sex-specific+differences+in+blood-borne+microvesicles+from+apparently+healthy+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Sex+Differ%22%5BJournal%5D)">Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans.</a> Biol Sex Differ. 6, (2015).</li>
<li>Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> J Extracell Vesicles. 3 (0), (2014).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).</li>
<li>Dignat-George, F., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Many+Faces+of+Endothelial+Microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">The Many Faces of Endothelial Microparticles.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).</li>
<li>Esser, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Incorporation+of+CD45%2C+CD80+%28B7-1%29%2C+CD86+%28B7-2%29%2C+and+Major+Histocompatibility+Complex+Class+I+and+II+Molecules+into+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Virions+and+Microvesicles%3A+Implications+for+Viral+Pathogenesis+and+Immune+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation.</a> J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).</li>
<li>Canellini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+microparticles+and+blood+group+antigens%3A+an+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Transfus%22%5BJournal%5D)">Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry.</a> Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).</li>
<li>Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., Lösche, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+tissue+factor+from+platelets+to+monocytes%3A+role+of+platelet-derived+microvesicles+and+CD62P%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P.</a> Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).</li>
<li>Berckmans, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+microparticles+circulate+in+healthy+humans+and+support+low+grade+thrombin+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation.</a> Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).</li>
<li>Rupp, A. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+EpCAM+expression+in+breast+cancer+derived+serum+exosomes%3A+role+of+proteolytic+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage.</a> Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).</li>
<li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

<html> Kandaki EVs üzerinde son çalışmalar, EV kompozisyon ve sayımlar çeşitli hastalıkların nedeni sırasında değişiklik olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu AGH analizi ve ileri karakterizasyon daha fazla teşhis ve prognoz için hastalık biyobelirteçlerinin olarak potansiyel kullanımını değerlendirmek ya da tedavi yanıtları değerlendirmek için yüksek ilgi görmektedir. Burada mevcut protokol herhangi bir hücre organellerini içermeyen 600 nm çapında veziküllerin izolasyonu sağlar. Bu gözlemler MVS güncel bir tanımlama ile uyumlu ve apoptotik cisimlerin 2 varlığını dışlamak. genellikle Ekzo belirteç olarak kullanılan tetraspanins CD9 ve CD81 sadece biraz ifade edildi Western Blot kullanarak, izole edilmiş MVs tubulin yüksek ifade gösterdiği göstermek mümkün oldu. Bu MVs Exos farklı olduğunu teyit ve proteomik 25 tarafından son derinlemesine karakterizasyonu ve hem EV popülasyonlarının karşılaştırmak için uyuyor. Kan örneklerinin elde edilmesi sırasında içeriği &quot;&gt;, MV bozunmasını önlemek için, kısa sürede damar delinerek ve plazma hazırlama arasındaki zaman kalması açısından çok önemlidir. Ayrıca, kan örneklerinin uzun süreli depolama geliştirilmiş MV neden kan hücrelerinin aktivasyonuna yol açabilir sonuçta apoptotik cisimlerin salınımına neden apoptoz dökülme ve. OG izolasyonu için bir başka önemli husus nedenle, aşağı iplik sonra mümkün olduğunca süpernatant kadar çok kaldırmak için kritik öneme sahiptir. plazma proteinlerine veya daha küçük Exos MV hazırlıkları kirletmesini önlemek için topak, normal olarak görünür ve sıkı bir şekilde borunun duvara bağlı olduğu 14,000 x g&#39;de MVs., süpernatan kolay bir pipet ucu ile temizlenebilir. EXOS aksine yüksek hızlı ultra-santrifüj tarafından hazırlanması sırasında agregatlar oluşturması için eğilimi olan genellikle tekrar süspansiyon zor bu sorun MVs oluşmaz. Çalışmamız bu Possi olduğunu gösterirflow sitometri ile kanda bulunan OG subpopülasyonunun karakterize etmek için ble. En akış sitometrelerinde tespit limiti yaklaşık 200 olmasına rağmen - 300 nm, MVs tekrarlanabilir açıkça arka plan sinyallerinden kendi ayrım izin Aynı analiz parametreleri ve kapıları ile donör yanı sıra hücre kültürü örneklerinde ölçüldü. PBS akış sitometrisi (Şekil 3) sırasında yüksek bir arka plan neden olabilecek herhangi bir kirletici partiküller ihtiva etmez analizler için kullanılan ölçümlerinden önce kontrol edilmesi önemlidir. Bazı küçük MVs bir akış sitometri yaklaşımla ele olmayabilir rağmen, tüm büyük kan hücre popülasyonlarının (örneğin, trombositler, kırmızı kan hücreleri, lökositler, endotel hücreleri) MVS tespit edildi. 29 - Bizim analizlerde daha önce MVS 26 bulunmuştur farklı kan hücreleri için standart belirteçler kullanılır. Belirtilmelidir ki t akış sitometrisi ile mümkün olan en iyi sonuçları elde etmek içinO miktar ve antikor konsantrasyonu, söz konusu antijeni ifade eden bir MV numune üzerinde titre edilmelidir. Kanda spesifik MV alt popülasyonlar daha yüksek özgüllük ile tespit edilir ise, ilgili MVS iki farklı antijenlerin karşı çifte boyama gerçekleştirmek ve sonraki 23 analizleri için yalnızca tüm çift pozitif MVS dikkate almak mümkündür. Şu anda, sağlıklı bireylerin 23,30 kanında MV alt popülasyonlar standart bir dizi tanımlamak için çabalar vardır. Bu çalışmalar, daha önce trombosit türevli MVs gözlemlerimiz ile uyumlu olarak bir kan MVs büyük nüfus oluşturmaktadır göstermiştir. OG örnekleri karakterize etmek flow sitometri bir avantajı, bu yöntem zaten iyi günlük klinik teşhis biyomarkırların olarak MVs olası kullanımını sağlayacak birçok klinik merkezlerinde tanı amaçlı kurulmuş olmasıdır. çoğunlukla odak kandaki EVs önceki çalışmalarküçük Exos üzerinde ed, seçici istenen Exo hedef nüfusu 31,32 analiz özel sıralama prosedürleri ya güvenmek ya da analiz 18 öncesinde boncuk Latexe Exos birleştirilmesi ile zaman alıcı (2 gün) izolasyon süreci gerektirir. Kendi yayınlanmamış gözlemler tam kan hazırlıkları MVS akım sitometri analizi bile böyle böyle bir seçim süreçleri olmadan tümör kaynaklı MVS olarak MVS algılanmasını sağlar düşündürmektedir. Burada sunulan protokol standardı laboratuar ekipmanları ile periferik kan örneklerinden MVs hızlı izolasyonuna izin verir ve onların sonraki karakterizasyonu akım sitometri ve Western Blot kullanarak, birlikte ele alındığında. Bütün bu süreç hastalık biyobelirteçlerinin olarak MVs potansiyelini değerlendirmek için gerekli olan hastaların kanındaki OG profilleri gelecek çalışmalara kolaylaştıracaktır yaklaşık 2 saat içinde yapılabilir.

Son yıllarda in vitro çalışmalar, birçok hücre dışı veziküller (EVS) arası iletişimde önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Yaşayan hücreler sürekli boyut, içerik ve biyogenezine farklılık kesecikler döken. En iyi çalışılan AGH onlar multiveziküler organları intraluminal kesecikler olarak depolandığı endozomal sisteminden kaynaklanan eksozomlar vardır. Plazma zarı ile ikinci sigorta kez içeriyordu veziküller Eksozomlann olarak yayımlanan (Exos, çap 30-100 nm 1). Plazma zarı 2 doğrudan kapalı tomurcuk - Son yıllarda artan ilgisini topladı EV ikinci nüfus büyük microvesicles (1000 nm MVs, çapı 100) vardır. 5, ve komşu C transfer proteinlerin bir bolluk - veziküllerinin her iki tipi, örneğin, DNA, mRNA veya miRNA 3, bir lipid iki katmanının ile çevrilidir ve nükleik asitleri içerirlerarşın. Genel olarak veziküllerin protein bileşimi kökenli hücrenin durumunu yansıtırken, bazı proteinler seçici hedef ve AGH 1 zenginleştirilmiş gibi görünüyor. Bir önemli araştırma ilgi roman biyomarkırların olarak AGH kullanımına izin verebilir belirli EV imzaları belirlemek amacıyla anormal ve hastalıklı hücrelerden AGH karakterize etmektir. Özellikle tümörün kendisi kolayca erişilebilir olmadığı kanser, içinde, kanda tümör spesifik AGH hedefleyen sıvı biyopsi tedavi yanıtları izlenmesine olanak veya invaziv işlemler 6 gerek kalmadan primer tümör karakterize yardımcı olabilir. Gerçekten de EVS başarıyla idrar 7, CSF 8, anne sütü 9 ya da kan 10 de dahil olmak üzere, çeşitli vücut sıvılarından izole edilmiştir. Çeşitli çalışmalarda, farklı insan hastalıklarında EV sayılarında değişiklik ve kompozisyon belirledi. Örneğin, sepsis hastalarında ön pıhtılaştırma MVs sayısıdırönemli ölçüde sağlıklı bireylerin 11 oranla artmıştır. Ayrıca şiddetli serebral sıtma olan hastalarda kandaki toplam MVS bir artış görülebilir ve trombosit kaynaklı MVS sayıları koma derinliği ve trombositopeni 12 ile ilişkilidir. Diğer çalışmalar bu kardiyovasküler olaylar 13,14 daha yüksek bir olasılık ile ilişkilidir, sistemik lupus eritematozus veya kalp yetmezliği olan hastalarda ve ikincisi durumunda endotel kökenli veziküllerin yüksek sayıda rapor. Özellikle kanser, kandaki AGH halen tanısal ve prognostik değeri olan yeni biyomarkerların olarak tartışılmaktadır. Bu MUC1, EGFR veya FAK tümör-ilişkili proteinler eksprese MVs seviyeleri meme kanserli hastaların 15,16 kanında yükselmiş olarak görülmektedir. Ayrıca EXOS için son zamanlarda yapılan çalışmalar gibi glipikan-1 erken hastalık DE izin göğüs kanseri için pankreas kanseri veya del-1 için olduğu gibi, tümör spesifik antijenler taşıyan kan türevi EXOS göstermiştiryüksek özgüllük ve duyarlılık 17,18 ile koruması. Buna ek olarak, serum kaynaklı tümör Exos gibi Kras ve tedavi tahmini 19 için kullanımlarını göstermektedir p53 gibi mutasyonların saptanması için kullanılabilir DNA içerebilir. Son gelişmeler, belirli bir mikroakışkan çip ile glioblastoma hastaların kanında EXOS bu analiz tedavisi 20 izlenmesine olanak sağlar göstermiştir. Birlikte ele alındığında, bu bulgular veziküllerin hastalığa özgü alt popülasyonlar analizi tanı, prognoz yanı sıra tedavi seçenekleri ve başarı hakkında değerli bilgiler verir ima. Bununla birlikte, kan EXOS izolasyonu ve analizi, zaman alıcıdır, özel laboratuar ekipmanları gerektirir ve bu nedenle henüz rutin klinik teşhis için uygun değildir. Bunun aksine, MVs bu EXOS 18 için gerekli olan sitometri lateks boncuk çift bunları gerek kalmadan kolayca akış sitometrisi ile analiz edilebilir nedeniyle büyük bir boyuta, çok daha hızlı biçimde izole edilebilir ve21. Bu nedenle, burada kan örneklerinden MVs standartlaştırılmış izolasyonu ve akış sitometrisi ile OG altgrupları müteakip özellik tayini için kullanılabilecek bir protokol mevcut. Bu protokol, daha fazla çalışma ve günlük klinik teşhis için MVS kullanmak için gerekli olacak büyük hasta gruplarında OG profilleri derinliği karakterizasyonu sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>kelebek iğnesi (21 gauge)</td><td>Hospira Deutschland GmbH</td><td>490P29201</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini Fraksiyon V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td>10x TBS için 24.2 g Tris baz ve 80 g NaCl ağırlığında, ad 1 L H2O ve pH'ı 7.6</td></tr><tr><td colspan="4"> 1x TBS-T için 100 mL 10x TBS'yi 900 mL H2O ile karıştırın ve 1 mL Tween-20</td></tr><tr><td>CD235a-PE</td><td>ekleyin Beckman Coulter</td><td>A07792</td><td>5 ve mikro kullanın; l boyama için</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>7782</td><td>5 & mikro kullanın; l boyama için</td></tr><tr><td>CD62E-PE</td><td>Biolegend</td><td>336008</td><td>0.8 & mikro kullanın; boyama için g</td></tr><tr><td>CD62P-PE</td><td>Biolegend</td><td>304905</td><td>0.1 ve mikro kullanın; </td></tr><tr><td>CD81 antikoru</td><td>Biolegend'ı</td> boyamak için g <td></td><td>TBS-T'de% 5 BSA'da 349501 1: 2.000; Western Blotting</td></tr><tr><td>CD9 antikoru</td><td>için</td> indirgeyici olmayan koşullar kullanın <td>TBS-T'de% 5 BSA'da 21270091 1: 1.000; Western Blotting</td><td></td></tr><tr><td>Kemilüminesans görüntüleyici ImageQuant LAS-4000</td> için indirgeyici olmayan koşulları kullanın <td>Fujitsu Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DC protein test kiti II</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>5000112</tr><tr><td>ECL tespit reaktifi</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Kan alma için EDTA vakum cihazları</td><td>Sarstedt</td><td>01.1605.001</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td> fetal buzağı serumu <td></td><td></td></tr><tr><td>(FCS)</td><td>İnvitrojen</td><td>10091148</td><td>ısıyla inaktive edilmiş (30 dk, 56 &°; C)</td></tr> <tr><td>filtre 0.22 ve mikro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>HRP'ye bağlı anti-fare ikincil antikoru</td><td>santa cruz</td><td>sc-2005</td><td>TBS-T'de %5 süt tozunda 1:10.000 kullanın</td></tr><tr><td>HRP-bağlantılı anti-tavşan ikincil antikoru</td><td>santa cruz</td><td>sc-2004</td> TBS-T 4x Laemmli yükleme <td>tamponunda %5 süt tozunda 1:10.000 kullanın</td></tr><tr><td>, Roti-Load 1</td><td>Roth</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>mikrofüj SIGMA 1-15K</td><td>Sigma Laborzentrifugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>süt tozu (Kurutma Dereceli Engelleyici, yağsız kuru süt)</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>multifuge 3 L-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, Ca ve Mg olmadan</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>perfüzör şırınga 50 mL</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau-S boyama solüsyonu</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2935,0500</td><td></td></tr><tr><td>rotor Ultrasantrifüjleme için Sw32.1 Ti (6 x 17 mL)Ultrasantrifüjleme için</td> <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor TLA-120.2 (10 x 1.5 mL)</td><td>Beckman </td> Akış sitometrisi için Coulter <td></td><td></td></tr><tr><td>tüpleri (5 mL, yuvarlak tabanlı)</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>ultrasantrifüj için tüpler (15 mL)</td><td>Ultrasantrifüjleme için Beckman Coulter</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>tüpleri (11* 34 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin antikoru</td><td>Millipore</td><td>05-829</td><td>1:5.000 in %5 BSA in TBST</td></tr><tr><td>ultrasantrifüj Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultrasantrifüj TL-100</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>valf filtresi Seraplas V15</td><td>Sarstedt</td><td>53,428</td><td></td></tr></tbody></table>

periferik kan microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

küçük endozomal türetilmiş Eksozomlann (Exos, çap &lt;100 nm) ve büyük plazma zarı kaynaklı microvesicles (MVs, çap&gt; 100 nm) dahil dışı veziküller (AGH) serbest bırakılması bütün canlı hücrelerde meydana temel hücresel bir süreçtir. Geldikleri hücre için ve in vitro çalışmalar belirli Bu veziküller taşıyıcı proteinler, lipidler ve nükleik asitler arası iletişimin arabulucu olarak önemlerini sermiştir. EVs başarıyla çeşitli vücut sıvılarından izole edilmiştir ve kan, özellikle EVs kanser veya bulaşıcı hastalıklar için biyolojik sözü olarak tespit edilmiştir. Kandaki MV alt popülasyonlarının çalışma imkan vermek üzere, periferik kan örneklerinden MVs standartlaştırılmış izolasyonu ve karakterizasyonu için bir protokol mevcut. MVs diferansiyel santrifüjleme ile EDTA antikoagüle Plazma örneklerinden topak haline getirildi ve tipik olarak 100 bir çapa sahip olan - 600 nm. Nedeniyle büyük bir boyuta, onlarKolayca flow sitometri, rutin klinik teşhis kullanılan ve en laboratuvarlarda mevcut olan bir teknikle incelenecektir. İzole MVs kalite kontrol testleri için birkaç örnek verilecektir ve kan farklı OG alt toplulukların ayrımı için kullanılabilen işaretleyiciler sunulacaktır.

tarif edilen protokol takip izole edilebilir MVs verimini ölçmek amacıyla, 10 donörlerin kan numunelerinden izole MVs miktarı hesaplanmıştır. Bir Lowry protein deneyinde değerlendirildi OG verim mL kan için 19.2 ug MVs (Tablo 1) &#39;in bir ortalama ug ila 30 kadar, 10 arasında değişmektedir. Nanoparçacık izleme analizi (NTA) ile tespit edilen partikül konsantrasyonu, 1.66 x 10 9&#39;dan ml plazma, numune başına 5.9 x 10 9 parçacıklar (Tablo 2), ortalama 2.36 x 10 ila 10 arasında değişmektedir. Transmisyon elektron mikroskobu ile MVs ileri karakterizasyonu bir lipit çift katmanı ile çevrili ve herhangi bir hücre organelleri (Şekil 1A) içermeyen bir çapı&gt; 100 nm olan veziküller nüfusu ortaya koymuştur. NTA izole MVs büyüklüğü 600 nm (Şekil 1 b) ve ortalama OG boyutuna kadar 100 arasında değişmektedir doğruladı 201 idimil (Şekil 1C). Western Blot tarafından tipik OG ve Exo belirteçleri için boyama izole MVs tubulin pozitif ve Exos tubulin negatif ve BS9 ve CD81 (Şekil 2) zenginleştirilmiş ise sadece, BS9 ve CD81 hafif bir ifade gösterdi olduğunu gösterdi. Akış sitometrisi (Şekil 3A) izole MVs analizi, normal olarak hücre kültür süpernatanlarından izole MVs için kullanılan ile aynı parametreler kullanılarak kapı olabilir tanımlanmış bir vezikül popülasyonu ortaya ve PBS ölçümü ile elde edilen arka plan sinyali açıkça farklıdır + % 1 MVs (Şekil 3B) ilavesi olmaksızın FCS veziküller tükenmiş. Kanda mevcut farklı OG popülasyonları analiz etmek için, MVs ör CD62P, trombosit türevli MVS, CD45 lökosit-türevi MVS, CD235a, farklı kan hücre popülasyonları için kurulan işaretleri ile boyandıKırmızı kan endotel hücre-türevli MVs (Şekil 4) MVs ve CD62E hücre kökenli. Bu nitelendirme MVs çoğunluğu tüm örneklerde trombositler tarafından döken gibiydi iken OG alt popülasyonlar yüzdesi araştırılmıştır donör kan örnekleri arasında farklılık göstermiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> Şekil 1: periferik kandan izole MVs boyutları dağılımı. A, izole edilmiş MVs transmisyon elektron mikroskobu ile görülür hale getirilirler. B, veziküllerin boyut dağılımına gösteren MVs temsili nanopartikül izleme analizi (NTA). C, 10 bağımsız hazırlıkları ortalama MV boyutu NTA (ortalama) ile ölçüldü. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">Al görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın Arger sürümü. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> Şekil 2: Western Blot ile izole edilmiş MVs karakterizasyonu. İki vericilerden izole MVs ve EXOS Diferansiyel Protein ifadesi, western lekeleme ile görselleştirildi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> Şekil 3: Akış Sitometrisi ile MVS analizi. A, MVs ilk ilgili OG nüfus kapısına sidescatter (SSC) araziler karşı ileri (FSC) görsel edilir. Daha sonra, bu MVs ilgili antijen tarafından karakterize edilir<html> antijene karşı floresan etiketli antikorlar kullanılarak. B, iki donörlerin plazmadan izole MVS SSC araziler karşı Tipik FSC. Karşılaştırma olarak, sadece PBS +% 1 vezikül tükenmiş MVs olmayan FCS kullanarak hücre kültürü üstte yüzen hem de bir negatif kontrol izole A549 akciğer kanseri hücreleri, tümör hücresi türevli MVs için tipik bir arsa sağ tarafta gösterilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> Şekil 4: Akış Sitometrisi ile İzole MVS karakterizasyonu. Üç vericiden MVs akış sitometrisi ile oluşturulan kan hücre belirteçleri (kırmızı) ekspresyonu için karakterize edilmiştir. İlgili izotip kontrolleri gri renkle gösterilir.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Örnek </td><td> MVs / ml kan [ug] </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 29.4 </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> 3. </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> 4. </td><td> 31.1 </td></tr><tr><td> 5. </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> 6. </td><td> 22.7 </td></tr><tr><td> 7. </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> 8. </td><td> 18.7 </td></tr><tr><td> 9. </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> 10. </td><td> 11.9 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Periferik Kan Örneklerinden OG Protein Verimi. </strong&gt; Gösterilen 10 donörlerden alınan mL periferik kandan başına MVS miktarıdır. OG verimleri Lowry testi ile ölçülmüştür. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Örnek </td><td> MVs / ml plazma [partikül sayımı] </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> 3. </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> 4. </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> 5. </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> 6. </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> 7. </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> 8. </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> 9. </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> 10. </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Periferik Kan Örneklerinden MV Parçacık Verim. </stRong&gt; MV 10 donörler ve partikül sayımları nanoparçacık izleme analizi ile belirlendi plazma örneklerinden izole edilmiştir. Üç bağımsız ölçümün ima edilen bir değerdir gösterilmiştir.

Kanda bulunan hücre dışı veziküller çeşitli hastalıklar için yeni biyobelirteçler olarak önerilmiştir. Burada, periferik kan örneklerinden büyük plazma zarından türetilmiş mikroparçacıkların izolasyonu ve bunların konvansiyonel akış sitometrisi ve Western Blot ile müteakip analizleri için bir protokol sunuyoruz.

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Bu yöntemin genel amacı, periferik kandaki plazma zarından türetilmiş mikro-parçacıkların popülasyonlarını karakterize etmek ve incelemektir. Tümör hastalarından alınan mikro-parçacıklar, proinvaziv ve fonksiyonel testlerdir. Bu nedenle, daha fazla karakterizasyon, bu veziküllerin aslında invazyon ve metastaza nasıl katkıda bulunduğu hakkında bilgi sağlayacaktır.Bu tekniğin temel avantajı, karmaşık veya pahalı malzeme ve ekipmanlara ihtiyaç duymadan kandaki mikro-parçacıkların nispeten hızlı bir şekilde analizine izin vermesidir. Bir gönüllüden EDTA içeren toplama tüplerine bir veya iki tüp kan aldıktan sonra, etkili kan antikoagülasyonunu garanti etmek için tüpleri birkaç kez ters çevirin. Kan alımından sonraki yarım saat içinde, numuneleri santrifüjleyin ve plazmayı kalan kandan ayırmaya yardımcı olmak için tüplere bir valf filtresi ekleyin.İkinci bir santrifüjleme için plazmayı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Süpernatanı hasat edin ve yeni bir tüpe aktarın. Gerekirse PBS ekleyin.Mikro-parçacıkları toplamak için gerektiği gibi PBS'de seyreltilmiş süpernatan içeren plazmayı santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı boşaltın ve tüpleri üç ila beş dakika boyunca bir kağıt havlu üzerine baş aşağı yerleştirin. Kalan tüm süpernatan havluya batırıldığında, kalan plazmayı tüplerin kenarından çıkarın ve mikro-parçacık peletini bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.Çözeltiyi 1.5 mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspire edin ve peletin boyutuna bağlı olarak peleti 50 ila 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra bir protein tahlili ile mikrovezikül protein konsantrasyonunu belirleyin.Mikrovezikülleri akış sitometrisi ile karakterize etmek için,% 1 vezikül tükenmiş FCS ile desteklenmiş 15 mikrolitre PBS'yi bir akış sitometri tüpüne aktarın, ardından PBS'de süspanse edilmiş üç ila beş mikrogram mikro-zikül izleyin. Mikrovezikül yüzeyindeki herhangi bir spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, karanlıkta 20 dakikalık bir oda sıcaklığında inkübasyon için floresan etiketli ilgilenilen antikoru ekleyin.Daha sonra, numuneyi 250 mikrolitre taze PBS ile seyreltin ve mikro-parçacıkları akış sitometresine yükleyin. Akış sitometresinin eşiğini mümkün olan en düşük değere düşürün ve logoritimik bir ölçekte ileri ve yan saçılma grafiği kullanarak mikro-parçacık popülasyonunu arayın. Daha sonra mikro-parçacık popülasyonunun etrafında bir kapı açın ve floresan sinyalini karşılık gelen bir histogramda değerlendirin.Donör kan örneklerinden elde edilen mikro-parçacık verimi, Lowry protein testinde, milileter kan başına 10 ila 30 mikrogram vezikül arasında tipik verimler ve 1.66 kez 10 ila 9. arasında değişen bir partikül konsantrasyonu ile değerlendirilebilir. Mikro-parçacıkların transmisyon elektron mikroskobu ile daha fazla karakterizasyonu, herhangi bir hücre organeli içermeyen bir lipit çift tabakası ile çevrili 100 nanometreden daha büyük bir çapa sahip bir vezikül popülasyonunu ortaya çıkarır. Nanopartikül izleme analizi ayrıca, izole edilen mikro-parçacıkların ortalama boyutunun 100 ila 600 nanometre arasında değiştiğini ve ortalama 201 nanometre olduğunu doğrulamaktadır.Tipik mikrovezikül ve eksozom belirteçleri için western blotlama ile boyama, kan izole edilen mikro-parçacıkların tipik olarak tübülant için pozitif olduğunu, CD9 ve CD81'in zayıf bir ekspresyonu ile eksozomların genellikle tübülant için negatif olduğunu ve diğer iki belirteç ile zenginleştirildiğini gösterir. Akış sitometrisi, hücre kültürü süpernatan izole edilmiş mikro-parçacıklar için kullanılan aynı parametreler kullanılarak kapılanabilen, tanımlanmış bir donör kaynaklı vezikül popülasyonunu ortaya çıkarır. Bu aynı zamanda, yalnızca %1 vezikül tükenmiş FCS numuneleri ile desteklenmiş kontrollü PBS için gözlemlenen arka plan sinyalinden açıkça farklıdır.Farklı kan hücresi popülasyonları için belirlenmiş belirteçlerle mikrovezikül boyama, mikrovezikül alt popülasyonlarının yüzdesinin kan donörü örnekleri arasında farklılık gösterdiğini ve mikro-parçacıkların çoğunun tüm örneklerde trombositler tarafından döküldüğü görülmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, mikro-parçacıkların izolasyonu ve ardından akış sitometrisi ile karakterizasyonu yaklaşık 2-1 / 2 saat içinde gerçekleştirilebilir. Mikro-parçacık alt popülasyonlarının karakterizasyonu, kontrollere karşı hastalarda bir tümör imzasının tanımlanmasına yardımcı olacaktır.Bu, karşı teşhis ve tedavi için bir biyobelirteç olarak yararlı olabilir.

isolation-and-characterization-of-microvesicles-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, 10 kadar ul serum örneklerinden, hücre dışı veziküller (EVS), hücrelerden salınan küçük zar parçacıkları izole etmek için bir yöntem göstermektedir. Bu yaklaşım, ultra-santrifüj ihtiyacını önlediği deney süresi sadece birkaç dakika sürer ve sınırlı hacim örneklerinden EV'lerin izolasyonunu sağlar.

Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar

Safra sıvısı, potansiyel olarak önemli biyobelirteçler içeren hücre dışı veziküller/eksozomlar için değerli bir kaynaktır. Bu protokol, miRNA profillemesi de dahil olmak üzere daha ileri analizler için eksozomları insan safrasından izole etmek için sağlam bir yöntemi temsil eder.

İzolasyon ve profil MicroRNA içeren İnsan Bile dan ekzozomlar

Mycobacterium tuberculosis düşük demir koşullarına yanıt olarak ekstrasellüler üretimi ve salınımını gösterir. Bu çalışma, demir eksikliğine yanıt olarak salınan mikobakteriyel ekstrasellüler saflaştırma ve karakterizasyonu için düşük demir koşulları ve yöntemleri oluşturmak için bir protokol ayrıntıları.

Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Periferik kan mononükleer hücrelerinin Sézary Sendromu tanısı alan hastalardan elde edilen tam kandan izole edilmesi, ardından CD4 + T hücrelerinin seçimi, forbol12-miristat13-asetat ve A23187 iyonofor ile uyarılmaları ve transkriptomik profilleme için RNA'nın hazırlanması için basit bir protokol sunuyoruz.

Transkriptomik Profilleme için İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin ve CD4 + T hücrelerinin Sézary Sendromu Hastalarından İzole Edilmesi

Bu protokol, periferik kan ve katı dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve daha sonra yüzey antijenlerinin ve protein kargolarının profillenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Mevcut protokol, temsili EV'leri (eksozomlar ve mikro-parçacıklar) kültürlü insan MSC'lerinden izole etmek ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeyi açıklamaktadır. Bu EV'lerin diğer uygulamaları da bu makalede açıklanmaktadır.

Kültürlenmiş İnsan Mezenkimal Kök Hücrelerinden Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Terapötik Uygulaması

Bu makale, insan plazmasından türetilmiş hücre dışı veziküllerin (EV) izolasyonu, karakterizasyonu ve miktar tayinifisi için bir metodolojiyi açıklar ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) kullanılarak EV proteomunun etiketsiz analizi için bir iş akışı sunar.

Kardiyovasküler Biyobelirteç Keşfi için Plazma Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Proteomik Analizi

Burada, insan deneklerin gözyaşı ve tükürük gibi biyolojik sıvılarından toplanan hücre dışı veziküller (EV'ler) için karakterizasyon yöntemini gösteriyoruz. Bu yöntemde kullanılan tarayıcı, numunenin 1 μL'sinden EV'lerin fenotipini, boyutunu ve toplam partikül sayısını tespit etme yeteneğine sahiptir.

Biyolojik Sıvılardan Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu

Bu protokol, enzimatik sindirim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak morin iskelet kası ve kemik iliğinden küçük ekstrasellüler veziküllerin izole edilmesini açıklar; böylece yapısal olarak karmaşık, düşük verimli dokulardan vezikülle zenginleştirilmiş fraksiyonların tekrarlanabilir şekilde geri kazanılmasını mümkün kılarak sonraki moleküler analiz için mümkün olur.

Boyut Dışlama Kromatografisi ile Küçük Ekstrasellüler Veziküllerin Fare, İskelet Kası ve Kemik Iliğinden İzole Edilmesi

Burada, fare pulmoner endotel hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol açıklar. Bu yöntem, mekanik ve enzimatik akciğer dokusunda ayrılma yanı sıra anti-PECAM-1 ve çoğunlukla mikrovasküler kökenli saf bir endotel hücre popülasyonu üreten manyetik boncuk, konjuge anti-ICAM-2 antikorları kullanarak 2-aşamalı bir arınma süreci kapsar.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Keşfedin periferik kan mikroveziküllerinin izolasyon ve karakterizasyon yöntemini. Akış sitometrisi ve Western Blotting ile analiz edilen bu teknik, tümör biyobelirteçleri geliştirmeye yönelik hızlı bir yaklaşım sunar.

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

Daha fazla video keşfet