Name: Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Öğrenin fare iskelet kasında kriyoseksiyon ile bitişik dokulardan histolojik ve moleküler analiz yöntemini. Bu teknik, tek dokudan gen ifadesi ve doku morfolojisini ilişkilendirerek kas biyolojisi araştırmalarını güçlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre ve Junna Luan teknik yardım sağladı. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü tarafından AR065077 numaralı ödülle desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarın sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

<ol><li>Foltz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+skeletal+muscle+regeneration+plus+mild+alterations+in+mature+fiber+type+specification+in+Fktn-Deficient+Dystroglycanopathy+Muscular+Dystrophy+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice.</a> PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).</li>
<li>Bartoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+monitoring+of+therapeutic+gene+transfer+in+animal+models+of+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies.</a> Gene Ther. 13, 20-28 (2006).</li>
<li>Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+RNA+preparation+options+for+archived+myocardial+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung+Circ%22%5BJournal%5D)">Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies.</a> Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).</li>
<li>Beedle, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+fukutin+deletion+impairs+dystroglycan+processing+and+recapitulates+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy.</a> J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).</li>
<li>Foltz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-week+rapamycin+treatment+improves+muscular+dystrophy+in+a+fukutin-deficient+mouse+model+of+dystroglycanopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy.</a> Skeletal Muscle. 6, 20(2016).</li>
<li>AVMA Guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). Available from: 
 <a target="_blank" href="www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx">www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx</a> 1-102 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).</li>
<li>Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+commercial+RNA+extraction+kits+for+preparation+of+DNA-free+total+RNA+from+Salmonella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells.</a> BMC Res. Notes. 3, 211(2010).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).</li>
<li>Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+Myf5+to+support+myogenic+differentiation+without+myogenin%2C+MyoD%2C+and+MRF4%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4.</a> Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).</li>
<li>Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+transgenic+skeletal+muscles+with+altered+timing+of+expression+of+the+basic+helix-loop-helix+muscle+regulatory+factor+MRF4%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4.</a> Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).</li>
<li>Chomczynski, P., Mackey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+chloroform+by+bromo-chloropropane+in+the+single-step+method+of+RNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation.</a> Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).</li>
<li>Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+RNA+from+tough+tissues+with+high+proteoglycan+content+by+cryosection%2C+second+phase+separation+and+high+salt+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation.</a> J. Biol. Methods. 2 (2), 20(2015).</li>
<li>Guo, D., Catchpoole, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+RNA+following+cryosections+of+archived+frozen+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue.</a> BioTechniques. 34, 48-50 (2003).</li>
<li>Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flexible+mouse-on-mouse+immunohistochemical+staining+technique+adaptable+to+biotin-free+reagents%2C+immunofluorescence%2C+and+multiple+antibody+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining.</a> J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).</li>
<li>Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+gene+analysis+of+130+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy+with+a+special+reference+to+muscle+mRNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis.</a> Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).</li>
<li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).</li>
<li>Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection technology.</a> Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).</li>
</ol>

Yazar, birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı olmadığını beyan eder.

fazlalık reçine toplanmış cryosections toplanması yavaş olacak ve RNA izolasyonu reçine kirlenme gömme artabilir, çünkü bu yöntem ile en iyi sonuçları elde etmek için, doku kriyoprezervasyon sırasında kas alt üçüncü ya da yarısına sınırlı reçine gömme tutun. Ayrıca, iğne homojenizasyon sırasında dikkatli dikkat verimi en üst düzeye çıkarmak ve iğneyi tıkanma olasılığını en aza indirmek için önemlidir. protokol iğne bloke ve yapışmasına neden çıkarmak için yüksek basınç gerektiren hale gelirse örnek kaybına karşı korumak...

Bu tekniğin amacı, tek bir küçük iskelet kası kaynak dokusundan erişilebilir gibi histoloji ve gen ifadesi olarak farklı modaliteleri, birden fazla deneysel analiz yapmaktır. Mikroskopi uygulamaları dikkatle dondurulması sırasında buz kristali eserler oluşumunu sınırlamak için kontrol edilmelidir koruma yöntemleri, örnek en duyarlıdır. Böylece, yöntem geliştirme tibialis anterior dayanmaktadır (TA) kas kısmen immünfloresan mikroskopi ve gen ifadesi hem analizleri için kaynak materyal olarak -140 ° C sıvı nitrojen soğutmalı 2-metilbütan banyosunda reçine gömme ile kaplı dondurulmuş. çeşitli teknik yaklaşımlar için aynı kaynak materyal kullanma ihtiyacı sol ve sağ kaslar farklı koşullar, deneysel ve tek kontrol temsil eden kas içi enjeksiyon tabanlı deneyler için özellikle önemlidir. Örneğin, kas yenilenmesi çalışmalarında, tek bir muSistemik lupus karşı kas aracı ile enjekte edilmiş kontrol 1 olarak hizmet ederken yaygın doku hasarına neden olmak için, bir toksin ile enjekte edilir. Benzer bir şekilde, kas Gen tedavisi yapılan çalışmalarda genellikle karşı tarafa 2 boş vektör olmayan vektör veya taşıyıcı kontrol ile karşılaştırıldığında gereken kas içine enjeksiyon ile gen terapi vektörünün doğrulama ile başlar. Nedenle, farklı bir uygulama için her bir ta kas kaynak yapmak mümkün değildir. Bu konu ile ilgili ortak stratejiler şunlardır: i) ii) Ek fareler kullanmak, veya iii) her uygulama için kas bir parça kesmek için, her uygulama için farklı bir kas grubunu kullanmak için. Ancak, kas grupları arasında önemli farklılıklar zor ayrı uygulamalardan verileri karşılaştırmak için yapmak ve ek hayvanlar gider artırmak ve diğer alternatifler varsa kötü haklı. farklı uygulamalar kaynak diseksiyonu sonrası kas bölme en iyi seçenek in birçok durumda. Bununla birlikte, kas parçalar genellikle homojenleştirme 2-5 için sıvı azot ya da mekanik öğütme teknikleri altında toz haline kullanmak için çok küçüktür. kas hücre dışı matris ve kontraktil proteinlerin ile kaplı olan bir yüksek yapısal doku gibi, yetersiz mekanik homojenleştirme daha sonra, DNA, RNA ya da protein düşük verime yol açar. Burada açıklanan yöntem çoklu uygulamalarda kullanılacak bir kaynak kas dokusunun küçük miktarlarda sağlar ve krio-bölümleme ve iğne toz haline dahil iyi RNA verimi için mekanik homojenizasyon artırır.

<table><tbody><tr><td>Mantar</td><td>VWR Scientific</td><td>23420-708</td><td>Keskin bir bıçakla küçük kareler halinde kesin.</td></tr><tr><td>Plastik lamel</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td>Donma sırasında kası yönlendirmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Düşük sıcaklık termometresi</td><td>VWR Scientific</td><td>89370-158</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbütan</td><td>Sigma</td><td>M32631-4L</td><td>Dikkat: tehlikeli kimyasal. Yanıcı dolapta saklayın.</td></tr><tr><td>Gömme reçine: "kriyomatris"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6769006</td><td>Diğer gömme reçineleri kriyomatris yerine kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>microm HM550, tek kullanımlık bıçak taşıyıcılı</td><td>Çalışan herhangi bir kriyostat protokol için yeterli olmalıdır.</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık kriyostat bıçağı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3052835</td><td>Kullanılacak kriyostat için uygun bir bıçak veya bıçak kullanın.</td></tr><tr><td>RNAse dekontaminasyon solüsyonu: "RNase Zap"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Analitik terazi</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>Boya fırçası</td><td>Daler Rowney</td><td>214900920</td><td>Kriyoseksiyonları işlemek için kullanın. Basit sanat malzemeleri ile mağazalarda bulunabilir.</td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı</td><td>VWR Scientific</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lamı</td><td>VWR Scientific</td><td>48311600</td><td></td></tr><tr><td>RNA organik ekstraksiyon reaktifi: TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Dikkat: TRIzol tehlikeli bir kimyasaldır. Not: İskelet kasından RNA ekstraksiyonu için sadece organik ekstraksiyon reaktifleri önerilir.</td></tr><tr><td>18 gauge iğne</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305185</td><td></td></tr><tr><td>22 gauge iğne</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305155</td><td></td></tr><tr><td>26 gauge iğne</td><td>VWR Scientific</td><td>BD305115</td><td>Opsiyonel. RNA ekstraksiyon protokolünde üçüncü bir numune öğütme turu için kullanılabilir.</td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>VWR Scientific</td><td>BD309659</td><td>Çok yüksek değerli numuneler için bir Luer-Lok şırınga önerilir (örn., VWR BD309628).</td></tr><tr><td>1-bromo-3-kloropentan (BCP)</td> <td>Sigma</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>DEPC suyunda% 70 etanol için: 200 geçirmez alkol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>+M18027161M</td><td>35 ml 200 geçirmez alkol + 15 ml DEPC suyu karıştırın.</td></tr><tr><td>DEPC suyunda %70 etanol için: DEPC ile arıtılmış su</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9922</td><td>35 ml 200 geçirmez alkol + 15 ml DEPC suyu karıştırın.</td></tr><tr><td>RNA saflaştırma kiti: PureLink RNA minikit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>RNA hazırlamanın son adımları.</td></tr><tr><td>DNase/Rnaz içermeyen su&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td>DEPC ile arıtılmış su da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Spektrofotometre: Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific NanoDrop</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2222</td><td>Aşağı akış uygulamalarından önce herhangi bir DNA kontaminasyonunu gidermek için saflaştırılmış RNA'yı tedavi edin.</td></tr>İmmünofloresan protokolü için <tr><td>hidrofobik kalem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>PBS'si.</td></tr><tr><td>Eşek serumu</td><td>Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc</td><td>017-000-121</td><td>Normal eşek serumu stoğunu üreticinin talimatlarına göre rehidre edin, ardından immünofloresan için bir alikotu %5'e seyreltin.&nbsp; Normal keçi serumu da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>eMHC antikoru</td><td>Iowa Üniversitesi Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası</td><td>F1.652</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen VI antikoru</td><td>Fitzgerald Industries</td><td>#70R-CR009x</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-tavşan AlexaFluor488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG1 AlexaFluor546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21123</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6- diamidino-2-fenilindol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Sulu montaj ortamı: Permafluor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td>Yalnızca solma önleyici özelliklere sahip floresan uygulamaları için tasarlanmış montaj ortamını kullanın.</td></tr><tr><td>Cam lamel</td><td>VWR Scientific</td><td>16004-314</td><td>İmmünofloresan protokolün sonunda slaytları monte etmek için kullanın</td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı: ImageProExpress</td><td>Media Cybernetics, Inc.</td><td>Image-Pro Express veya daha gelişmiş ürünler</td><td>Ücretsiz ImageJ, manuel sayım için de çalışmalıdır. Segmentasyon yeteneklerine sahip daha gelişmiş yazılımlar, sürecin kısmi otomasyonuna izin verebilir; ör, ImageProPremier.</td></tr><tr><td>Bölüm görüntülerini birleştirme ve eşleme: Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Sigma</td><td>C9659</td><td>Sigma C9659 kullanımdan kaldırıldı. Kardiyotoksin için diğer seçenekler EMD Millipore #217503; Amerikan Özel Kimyasallar A.Ş. # BIO0000618; veya Ge Script # RP17303; Ancak bunlar doğrulanmadı.</td></tr><tr><td>ters transkripsiyon kiti: Üst simge III Birinci iplikli sentez sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080051</td><td>Herhangi bir doğrulanmış, yüksek kaliteli ters transkripsiyon reaktifi kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Standart PCR: GoTaq Flexi polimeraz sistemi</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td>Herhangi bir doğrulanmış, yüksek kaliteli Taq polimeraz sistemi kullanılabilir. PCR'nin aşağı akışındaki herhangi bir uygulama için DNA dizilimi kullanılacaksa, bunun yerine yüksek kaliteli bir PCR sistemi kullanılmalıdır.</td></tr><tr><td>SYBR yeşil</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7585</td><td>Özel bir qPCR ana karışımı kullanılmadığında qPCR'de kullanım için. SuperROX (Uygulamalı Biyosistem cihazları için) ve GoTaq Flexi polimeraz ve tamponları ile birlikte kullanın.</td></tr><tr><td>ROX: SuperROX, 15 mM</td><td>BioResearch Technologies, Inc. Novato CA</td><td>SR-1000-10</td><td>SuperROX, PCR reaksiyonunda daha kararlıdır, bu nedenle ROX (karboksi-X-rodamin) yerine qPCR pasif referans boyası olarak kullanılması tercih edilir. Applied Biosystems cihazları ile qPCR için</td></tr><tr><td>Gerçek zamanlı PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT</td><td></td></tr></tbody></table>

gen İfade ve histolojik analizler tek fare İskelet kası bitişik bölgeler cryosectioning

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

Bu yöntem ile, birbirini takip eden cryosections tek bir fare iskelet kası, bitişik bölgeleri kullanılarak gen ifadesi için doku histolojisi ve RNA zenginleştirilmesi için, her iki mikroskop uygulamaları sağlamak için toplanır. Tipik olarak, tampon hacimleri verimli taşlama uygulamaları için çok düşük olabilir, çünkü henüz yeterli mekanik kesinti olmadan, küçük iskelet kas örneklerinin yeterli homojenizasyonu sağlamak için zorlu, tampon reaktif kas sınırları penetrasyon yoğun doku mimarisi, sonuçta düşük RNA verim neden olur. Burada bildirilen protokolü takip ederek, 30 mikron kesitler toplanır ve tampon penetrasyonu maruz yüzey alanını arttırarak, krio-bölümleme ve sonraki iğne homojenizasyon kas bozabilir mekanik izin toplanmış. tekniğin başlıca kısıtlamaları bir kriyostat gerektirir, ve nispeten düşük bir kapasiteye sahip olmasıdır. Bununla birlikte, yüksek-kalitede RNA toplanmış m küçük örnekler elde edilebiliruscle cryosections, birçok farklı iskelet kaslarında ve diğer dokular için bu yöntem erişilebilir hale getirmek. Ayrıca bu teknik eşleşti sağlayan analizler (örneğin, doku histopatolojik ve gen ifadesi) ölçümleri doğrudan deneysel belirsizliği azaltmak ve küçük bir doku kaynak için gerekli replikatif hayvan deneyleri azaltmak için uygulamalar arasında mukayese edilebilir, böylece tek bir iskelet kası komşu bölgelerden birden çok uygulama.

Kas cryosection RNA kalitesi yüksek ve uygulamaların çoğu için yeterli verim sağlar On altı çizgili kas RNA preparatları analizleri 8 kontrol farelerinden alınan havuzlanmış tibialis anterior (TA), kas 19.4 41 mg kullanılarak Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. Hem sol (L) ve sağ (R) ta kasları yöntemlerle kas yaralanmasına neden 3 gün tuz veya 10 uM cardiotoxin 25 ul uzunlamasına kas içinden enjeksiyondan sonra alın...

Ardışık kriyo-bölümleri tek bir fare iskelet kası, bitişik bölgeleri kullanılarak gen ekspresyonu ölçümleri için histolojik uygulamalar ve RNA zenginleştirme sağlamak için toplanır. doğrudan uygulamalar arasında karşılaştırılmıştır toplanmış cryosections ve ölçümlerin 30 mg - Yüksek kaliteli RNA 20 elde edilir.

Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

Bu prosedürün genel amacı, tek bir dokunun bitişik bölümlerinden histolojik ve moleküler parametrelerin analizini sağlamaktır. Bu yöntemle, iskelet kası biyolojisi ve hastalığı alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabiliriz. Örneğin, kas yaralanmasından sonra rejeneratif etkiler nelerdir ve kas içi enjeksiyon ile viral gen iletiminin etkileri nelerdir?Bu yöntemin avantajı, histolojik ve moleküler verilerin tek bir dokudan doğrudan ilişkilendirilebilmesidir. Bu, daha etkili veri analizi ve deney dokularının daha iyi kullanılmasını sağlar. Diseksiyonları tamamlamadan beş dakika önce, kriyoprezervasyon banyosunu soğutun.Doku örnekleri gömülmeye hazır olduğunda, önce kasın mantarla buluştuğu dokunun alt üçte birlik kısmına ila yarısına gömülü reçine uygulayın. Bu, aşağı akış adımlarıyla reçine girişimini azaltmak için düzgün bir şekilde yapılmalıdır. Ardından, mantarı hemen eksi 140 santigrat dereceye soğutulmuş 2-Metilbütan banyosuna bırakın.Parti başına en fazla sekiz doku preparatı ekleyin. Banyoda, dokuları 30 saniye boyunca karıştırın, doku mantarlarının çözeltiye donmasını önlemek için beherin altını kazıyın. 30 saniye sonra, metal bir alet kullanarak, 2-Metilbütan'dan

cryosectioning-contiguous-regions-single-mouse-skeletal-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ayrık fare beyin bölgelerinin RNA ekspresyon profillemesi, hassas ve tekrarlanabilir bir doku toplama stratejisi gerektirir. Burada, hem koronal beyin kesitlenmesi hem de doku orajörü yardımıyla mikrodissection kullanan bir protokol açıklanmaktadır. Elde edilen örneklerden sağlanan toplam RNA'nın verimi ve kalitesi, özetlenen yöntemin kullanışlılığını doğrulamaktadır.

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

Bu videoda, kas dokusunun dondurulması ve ince kesitlerinin elde edilmesi prosedürü açıklanmaktadır. Teknik, kolon kanseri fare modellerinde kansere bağlı kaşeksi çalışmasına yardımcı olabilir.

Kesit için kas dokusunun hızlı dondurulması: hızla donmuş murin kas dokusunun ultra ince kesitlerini elde etmek için bir protokol

Nöromüsküler kavşak (NMJ), bazen sinaptik yetmezlikle sonuçlanabilen çeşitli durumlarda değişir. Bu rapor, bu tür yapısal değişiklikleri ölçmek için floresan mikroskobu tabanlı yöntemleri açıklamaktadır.

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

Burada, artefaktların donmasını önlemek için kas biyopsilerinin dondurulması, gömülmesi, kriyoseksiyonu ve boyanması için en etkili yöntemleri gösteriyoruz.

Histolojik Analiz kas cryosections Hazırlanmasında Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Burada, uzamsal olarak farklı murin kolonik epitel yüzey hücrelerinin alttaki kript bazlı hücrelerden izolasyonu için basit bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Kolon Mukozanın Mikrodisseksiyon için Cryosectioning Yöntemi

Burada, donma ve beyin dokusu birden çok hayvanlardan tek beyin işleme için zaman kazandıran bir alternatif olarak bölüm için bir protokol mevcut. Bu immünhistokimya sırasında boyama değişkenliği azaltır ve zaman cryosectioning ve görüntüleme azaltır.

Birden çok kemirgen beyin aynı anda Cryosectioning

Kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için lazer yakalama mikrodisseksi (LCM) protokolü geliştirilmiştir. Mevcut çalışma fare uyluk bölümleri üzerinde duruluyor. Ancak, burada bildirilen LCM protokolü herhangi bir sert doku hücrelerinde gen ekspresyonu çalışmak için kullanılabilir.

Taze Dondurulmuş Fare Kemiklerinden Yüksek Kaliteli RNA Veren Lazer Yakalama Mikrodisksiyon Protokolü

Bu protokol, fare embriyosu taze dondurulmuş bölümlerinden kıkırdak ve kemik izolasyonu için lazer yakalama mikrodizeksiyon açıklar. Kıkırdak ve kemik hızla cresyl menekşe boyama ile görselleştirilmiş ve transkripsiyonanalizi için yüksek kaliteli RNA verim hassas toplanabilir.

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Fare beyninin çıkarılması ve taze beyin dokusundan ayrı bölgelerin diseksiyonu için uygulamalı, adım adım, hızlı bir protokol sunuyoruz. Moleküler analiz için beyin bölgelerinin elde edilmesi birçok sinirbilim laboratuvarında rutin hale gelmiştir. Bu beyin bölgeleri, sistem seviyesi analizi için yüksek kaliteli transkriptomik veriler elde etmek için hemen dondurulur.

Fare Beyninin İşlevsel ve Anatomik Olarak Farklı Bölgelere Mikrodiseksiyonu

Artan kanıtlar, iskelet kası içindeki lipitlerin aşırı infiltrasyonunun lipotoksisite ve diyabet ile sonuçlandığını göstermektedir. Burada, lipit damlacıklarının boyutunu, yoğunluğunu ve hücre altı dağılımını lif tipine özgü bir şekilde ölçmek için doku işleme, Bodipy ile boyama, görüntü elde etme ve analiz dahil olmak üzere eksiksiz bir protokol sunuyoruz.

İskelet Kasında Lipid Damlacık İçeriğinin Lif Tipi ve Subhücresel-Spesifik Analizi

Bu çalışma, bir doku kesitinin doğrudan uzamsal barkodlamasını tek hücreli çoklu analiz ile birleştiren bir uzamsal Trekker–CUT&amp;Tag çoklu protokolü sunmaktadır. Bu yaklaşım, gen ekspresyonunun ve histon H3K27ac modifikasyonunun aynı anda mekansal olarak çözülen tek hücreli profillenmesini sağlar ve doku mikroanatomisi bağlamında gen düzenlemesine mekanik içgörüler sunar.

Donmuş doku kesitlerinde transkriptom ve epigenomik hedeflerin mekansal çözülmüş, entegre tek hücreli multiomik profillenmesi

Öğrenin fare iskelet kasında kriyoseksiyon ile bitişik dokulardan histolojik ve moleküler analiz yöntemini. Bu teknik, tek dokudan gen ifadesi ve doku morfolojisini ilişkilendirerek kas biyolojisi araştırmalarını güçlendirir.

Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning

Daha fazla video keşfet