Gen İfade ve histolojik Analizler Tek Fare İskelet Kası bitişik Bölgeler Cryosectioning

Bu prosedürün genel amacı, tek bir dokunun bitişik bölümlerinden histolojik ve moleküler parametrelerin analizini sağlamaktır. Bu yöntemle, iskelet kası biyolojisi ve hastalığı alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabiliriz. Örneğin, kas yaralanmasından sonra rejeneratif etkiler nelerdir ve kas içi enjeksiyon ile viral gen iletiminin etkileri nelerdir?

Bu yöntemin avantajı, histolojik ve moleküler verilerin tek bir dokudan doğrudan ilişkilendirilebilmesidir. Bu, daha etkili veri analizi ve deney dokularının daha iyi kullanılmasını sağlar. Diseksiyonları tamamlamadan beş dakika önce, kriyoprezervasyon banyosunu soğutun.

Doku örnekleri gömülmeye hazır olduğunda, önce kasın mantarla buluştuğu dokunun alt üçte birlik kısmına ila yarısına gömülü reçine uygulayın. Bu, aşağı akış adımlarıyla reçine girişimini azaltmak için düzgün bir şekilde yapılmalıdır. Ardından, mantarı hemen eksi 140 santigrat dereceye soğutulmuş 2-Metilbütan banyosuna bırakın.

Parti başına en fazla sekiz doku preparatı ekleyin. Banyoda, dokuları 30 saniye boyunca karıştırın, doku mantarlarının çözeltiye donmasını önlemek için beherin altını kazıyın. 30 saniye sonra, metal bir alet kullanarak, 2-Metilbütan'dan bir doku mantarı çekin.

Ardından, destekleyici kapak fişini hızlı bir şekilde çıkarın. Fazla 2-Metilbütanı tekrar banyoya batırın ve ardından doku mantarını dış nitrojen banyosuna bırakın. Tüm dokular sıvı nitrojene aktarıldıktan sonra, bunları bir kaba taşıyın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Kriyostatı hazırladıktan ve bir doku örneğini monte ettikten sonra, örneği bıçağa değecek şekilde bıçağa kadar ilerletmek için kaba ve ince kontrolleri kullanın. Bu noktada kesit kalınlıklarının toplamını sıfıra sıfırlayın. Ardından, kriyostatı kesit kalınlığı 30 mikron olan trim fonksiyonuna ayarlayın.

Ve istenen doku derinliğine kadar bölümleri kesin ve atın. RNA ekstraksiyonu için kriyoseksiyonları verimli bir şekilde toplamak için önce toplama tüpünü açın ve bıçak taşıyıcısının yanına yerleştirin. Orada, her bölümü almak ve tüpe aktarmak için önceden soğutulmuş, temiz bir fırça kullanın.

400 ila 4.000 mikron doku derinliğinden alınan havuzlanmış 30 mikronluk fare tibialis ön bölümleri tipik olarak 25 ila 50 miligram kas verir. Gömülü reçine kriyoseksiyonu çevreliyorsa, el frenini kilitleyin ve kasın üst kısmında sadece ince bir tabaka kalana kadar küçük reçine parçalarını tıraş etmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Reçineyi her zaman bıçak kastan uzağa açılı olarak kesin.

İnce bir gömme reçine tabakası, aşağı akış RNA ekstraksiyonunu önemli ölçüde bozmaz. Daha kalın gömme reçinesi varsa, kriyoseksiyonu toplama tüpüne taşımadan önce kastan uzaklaştırmak için fırçalar kullanın. Kesit alma işlemi sırasında, histolojik kesitler istendiğinde, kriyostat kontrollerini kullanarak dilim kalınlığını yedi mikrona sıfırlayın.

Ardından, tutarlı, eşit bir doku yüzeyi elde etmek için dört ila yedi bölümü kesin ve atın ve bu doku derinliğini not edin. Şimdi, iyi bir bölüm kesin ve bıçak taşıyıcısının yüzeyine yönlendirin. Oda sıcaklığında bir mikroskop lamı kullanarak, bölümü alın ve slaydı oda sıcaklığına getirin.

İstenen tüm bölümleri toplayın ve ardından son doku derinliğini not edin. Kesitlemeyi tamamladıktan sonra, RNA izolasyonu için havuzlanmış kriyokesitlerin ağırlığını hızlı bir şekilde kaydedin. Bölümlerin sıcaklığını eksi 20 santigrat dereceye yakın tutmak için tüpü hemen kriyostat odasına geri koyun.

Havuzlanmış kriyoselektörleri hızlı bir şekilde buza aktararak ve 50 miligram kriyoseksiyon başına yaklaşık bir milileter organik RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyerek başlayın. Reaktif ne kadar erken uygulanırsa, RNA o kadar az bozunur. Daha sonra, 18 gauge iğneli bir mililitrelik şırınga kullanarak, tekrar tekrar bir çözelti çizerek ve tüp duvarlarına çıkararak çok fazla kabarcık oluşturmadan kriyoseksiyonları homojenize edin.

Topaklanmış parçaları dağıtmak için iğne ucunu kullanın. Her beş vuruştan sonra, numuneyi serin tutmak için kısa bir süre buza geri koyun. Homojenize edildikten sonra, numuneyi beş vuruş daha kullanarak dikkatlice ezmek için 22 gauge bir iğne kullanın.

Ardından numuneyi buza geri koyun. Çok ince dağılmış bir doku homojenliği elde etmek için bu işlemi üç veya dört kez tekrarlayın. Son homojenat yapıldıktan sonra, moleküler kompleksleri bozmak için oda sıcaklığında beş dakika inkübe etmesine izin verin.

Daha sonra, bir davlumbazda, mililitre RNA izolasyon reaktifi başına 0.1 mililitre BCP ekleyin. Ardından tüpü 15 saniye kuvvetlice çalkalayın. Girdap kullanmayın.

Ardından, numuneyi oda sıcaklığında iki ila üç dakika inkübe edin. Kısa inkübasyonun ardından, numuneyi 12.000 g ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Ardından, RNA'yı içeren berrak üst fazı dikkatlice toplayın.

Temiz bir tüpe aktarın ve derin deniz suyunda oluşan eşit hacimde% 70 etanol ekleyin. Tüpü kısa bir süre girdapladıktan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmesine izin verin ve metin protokolünü takip ederek devam edin. İskelet kası RNA preparatları fare tibialis anteriorundan yapıldı.

Üç gün önce, bazı kaslara 10 mikromolar kardiyotoksin ve diğerlerine salin enjekte edildi. Bu örneklerden elde edilen RNA'nın saflığı ve verimi mükemmeldi. Toksin yaralanması sonrası tibialis anterior kaslarında RNA verimi anlamlı olarak daha yüksekti.

Doku bütünlüğü ve RNA üretimi bu gözlemi etkileyebilir. Hazırlanan RNA kalitesinin kalıcılığı, 18 ay boyunca eksi 20 santigrat derecede depolanan bir mikrolitre RNA kullanılarak değerlendirildi. Belirgin 18S ve 28S ribozomal RNA bantları, yüksek RNA kalitesi gösteren örneklerde hala belirgindir.

Yedi mikronluk kesitler, kırmızı ile görülen embriyonik miyozin ağır zincirinin ekspresyonu için boyandı. Yenileyici lifleri tespit etmek için, kollajen altı için boyanmış, kas liflerini ana hatlarıyla belirten yeşil renkte görülür ve çekirdekleri gözlemlemek için mavi renkte dappy ile boyanır. Kötü bir toksin enjeksiyonu olduğunda, yaralanma minimal görünür.

Başarılı bir toksin enjeksiyonu, hedeflenen kas bölmesinin çok daha geniş bir bölgesinin etkilenmesine neden olur. Yaralanma derecesi, RNA analizi için dahil etme kriterleri olarak kullanılabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, RNA ekstraksiyonu ve histolojik slayt için kesme bölümleri, tek bir doku için yarım saatin altında tamamlanabilir.

Bu prosedürü takiben, çok çeşitli soruları cevaplamak için diğer histolojik immünofloresan boyalar takip edilebilir. Havuzlanmış kriyokesitler, DNA veya protein toplamak için de kullanılabilir.