Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

Bu prosedürün genel amacı, bir bakteri suşu tarafından üretilen ve ikinci bakteri suşuna karşı inhibe edici olan ajanları taramaktır. Bu yöntem, bir dizi mikrobiyolojik alandaki soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, ancak mikrobiyal ekolojide, antagonistik bakteri etkileşimlerini anlamada özellikle yararlıdır. Bu tekniğin en büyük avantajı, ucuz olması ve gerçekleştirilmesinin ve yorumlanmasının kolay olmasıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarda bir öğrenci olan Aretha olacak. Deneye başlamak için, tek bir P syringae kolonisini 3 mililitre King's Medium B suyuna veya KB'ye aşılayın. Kültürü gece boyunca kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, et suyu kültürünü 1 ila 100 arasında 3 mililitre taze KB suyuna seyreltin.

Kültürü oda sıcaklığında çalkalayarak üç ila dört saat inkübe edin. Kültürün bulanıklığında gözle görülür bir artış olduğundan emin olun ve ardından Mitomisin C'yi ekleyin.Ardından, kültürü gece boyunca oda sıcaklığında çalkalayarak inkübe edin. Ertesi gün, bir ila iki mililitre Mitomisin C kaynaklı kültürleri tezgah üstü bir mikro santrifüjde peletleyin.

Süpernatanı 0.22 mikrometre gözenek boyutunda bir filtreden geçirerek kültür süpernatantlarını çıkarın ve sterilize edin. Bir molar konsantrasyona ulaşmak için sodyum klorür ekleyin ve steril süpernatana %10'luk bir nihai konsantrasyona kadar polietilen glikol veya PEG 8000 ekleyin. Hem sodyum klorür hem de PEG tamamen çözülene kadar numuneleri tekrar tekrar ters çevirin.

Numuneleri bir saat boyunca bir buz banyosunda inkübe edin. Ardından, numuneleri santrifüjleyin. Döndürdükten sonra, süpernatanı boşaltın ve tekrar tekrar pipetleyerek peleti tamponda yeniden süspanse edin.

Artık PEG'yi eşit hacimde kloroform ile iki ardışık ekstraksiyonla çıkarın. Kloroform ile yeniden süspanse edilmiş pelet ile birleştirin ve karışımı 15 saniye boyunca girdaplayın. Daha sonra karışımı beş dakika boyunca 20.000 kez G'de santrifüjleyin.

Üst sulu fazı taze bir mikrofüj tüpüne aktarın. Sulu ve organik faz arasında beyaz bir arayüz görünmeyene kadar bu ekstraksiyonu iki kez tekrarlayın. Çeker ocakta ekstrakte edilen süpernatantlardan artık kloroformun buharlaşmasına izin verin.

Bir P şırınga suşunun tek bir kolonisini üç mililitre KB'ye aşılayın ve kültürü gece boyunca oda sıcaklığında çalkalayarak inkübe edin. Ertesi sabah, kültürü 1'den 100'e kadar taze KB'ye seyreltin. Kültürü oda sıcaklığında çalkalayarak üç ila dört saat inkübe edin. Daha sonra, ultra saf suda bir agar süspansiyonunu otoklavlayarak sterilize su agar hazırlayın.

Erimiş yumuşak agarı kullanmadan önce 60 derecelik bir su banyosunda muhafaza edin. Steril bir serolojik pipet kullanarak, üç mililitre yumuşak agarı steril bir kültür tüpüne aktarın. Erimiş halde tutmak için kültür tüpünü su banyosuna geri koyun.

Kaplamayı dökmeden önce, erimiş agarın soğumasını bekleyin, ancak katılaşmasına izin vermeyin. Agarın aşılamadan önce sıcak, tamamen erimiş bir durumda tutulması çok önemlidir. Aksi takdirde, kaplama grenli bir görünüme sahip olacak ve yorumlanması daha zor olacaktır.

Steril bir başlıkta, 100 mikrolitre test cihazı süzme kültürünü yumuşak agarın içine aşılayın ve karıştırmak için girdap haline getirin. Kültürü elle 10 ila 15 saniye döndürün, ardından bir agar plakasının dibine dökün. Yumuşak agarın alt agarı eşit şekilde kapladığından emin olmak için plakayı her yöne eğin.

Plakayı örtün ve katılaşması için 20 ila 30 dakika bekleyin. Katılaşırken plakayı rahatsız etmemeye dikkat edin. Katılaştıktan sonra, kaplamanın üzerine iki ila beş mikrolitre süpernatan yerleştirin.

Plakaların gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmesine izin verin. Ertesi sabah sonuçları gözlemleyin ve kaydedin. Bu yöntemi kullanarak, iki P şırınga suşu farklı bakteriyosinler tarafından inhibe edilir.

Suş A, yüksek moleküler ağırlıklı bir bakteriyosin Taolosin'e duyarlıdır, ancak alternatif, düşük moleküler ağırlıklı bir Bakteriyosin'e duyarlı değildir. Tersine, Suş B, Tailoksin'e karşı duyarsızdır, ancak düşük moleküler ağırlıklı Bakteriyosin'e duyarlıdır. Taolunsin, PEG çökeltisini takiben verimli bir şekilde geri kazanılırken, daha düşük moleküler ağırlıklı Bakteriyosinler geri kazanılmaz.

Bakteriyofaj aracılı öldürme, bir seyreltme serisini karşılaştırarak diğer replikatif olmayan anti-mikrobiyallerden ayırt edilir. Bakteriyofaj aracılı temizleme durumunda, süpernatantın seyreltilmesi tek tek plaklara veya temizleme bölgelerine çözülürken, Bakteriyosin aracılı temizleme bu tür plaklara çözülmedi. Bu prosedür, inhibitör ajanları tanımlamak için bir başlangıç ekranı olarak kullanılabilir ve bu aktivitenin kaynağını tanımlamak veya doğrulamak için aşağı akış genetik manipülasyonları ile birleştirilebilir.