Name: Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Öğrenin bakteriyel inhibitörleri yumuşak agar üst tabaka tekniğiyle taramayı. P. syringae suşları kullanılarak mikrobiyal ekolojide antagonistik etkileşimleri incelemek için uygun maliyetli ve etkili bir yöntemdir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü'nden KLH'ye 2015-67012-22773 sayılı Tarım ve Gıda Araştırma Girişimi rekabetçi hibesi tarafından desteklenmiştir.

Süpernatan hazırlanması 1. Aktivite için test edilecek <ol><li> Steril 0.1 M MgSO 4 tampon (örneğin 1 mg mitomisin C / 2 ml tampon), uygun bir miktarda çözülmesi mitomisin C 0.5 mg / ml stok çözelti hazırlayın. Bir ışık korumalı bir kapta 4 ° C&#39;de saklayın stok (mitomisin C duyarlı ışık). </li><li> King aracı maddesi B (KB) suyu 14 3 ml P. syringae&#39;nin tek bir koloni inoküle. Oda sıcaklığında (200 rpm) çalkalama ile gece boyunca inkübe (21-25 ° C). </li><li> Sonraki sabah, taze KB suyu 3 ml çorba kültürünün 1/100 seyreltin. Oda sıcaklığında çalkalanarak 3-4 saat süreyle inkübe edin. mitomisin C (0.5 ug / ml, son konsantrasyon) eklenir. Oda sıcaklığında çalkalanarak gece boyunca kültür inkübe edin. Not: Mitomisin C ve böylece bakteriyofaj ve bakteriyosinlerin hem üretimine yol açan, hücrenin SOS tepkisine uyarıcı iki iplikçikli DNA kırılmaları neden olur. </li><li> Pelet 1-2 ml mitomisin C, bir tezgah üstü mikrosantrifüjde 5 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüj ile kültürleri uyardı. </li><li> Çıkarın ve 0.22 um gözenek boyutlu filtreden geçirilerek süpernatan geçirilmesiyle veya kloroform ile süpernatant (1 ml süpernatant başına 100 ul kloroform) muamele yoluyla, kültür süpernatantlar sterilize edin. <ol><li> kloroform kullanılarak takdirde, yaklaşık 15 saniye boyunca vorteks karışımı 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 5 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüj karışımı. NOT: Kloroform etkin bir şekilde membranlar çözülmesi ile hücreleri öldürür. filtre sterilizasyonu üzerinde kloroform kullanılarak yararı daha ucuz ve ölçek-up daha kolay olduğunu ise bir anda birçok (&gt; 20) örnekleri işleme. Belirli bir öldürme aktivitesi organik faza bölümleme sonucu kloroform tedaviden sonra kaybolur ihtimali söz konusu olabilir. </li><li> taze, steril bir 1.5 veya 2.0 ml 1 mL pipet kullanılarak, üst sulu faz kaldırmamikrofuge&#39;ye tüp. Alt kloroform tabakasının herhangi aktarmak için dikkatli olun (taşınmasını önlemek için sulu fazın az kaldırmak için daha iyidir). </li><li> Kalıntı kloroform (birkaç saat) buharlaşmaya izin vermek için bir çeker ocak içinde kapağını açıp transfer süpernatant inkübe edin. 4 ° C&#39;de saklayın süpernatantlar. </li></ol></li></ol> Polietilen glikol (PEG) çökelmesiyle Yüksek Moleküler Ağırlıklı Bakterisit Bileşiklerin 2. Ayırma ve konsantre <ol><li> Steril süpernatan, sırasıyla, 1 ve% 10 son konsantrasyonlara NaCl ve PEG 8000 ekleyin. NaCl ve PEG de tamamen çözülür kadar art arda örnek ters çevirin. 1 saat ya da gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta bir buz banyosu içinde inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüj örnekleri. Bir pelet santrifüj tüpünün dibinde oluşturmalıdır. süpernatant süzün ve (örneğin 1/10 ya da orijinal süpernatant vol 1/100 olarak istenilen hacimde peletume) tekrar pipetleme tamponu (10 mM Tris, 10 mM MgSO 4, pH 7.0). </li><li> kloroform, eşit hacimde iki ardışık ayrıştırma kalıntı PEG çıkarın. <ol><li> 10 ila 15 saniye boyunca yeniden süspanse pelet ve vorteks ile kloroform birleştirin, daha sonra 5 dakika için 20,000 x g&#39;de karışımı santrifüj. yeni bir mikrofüj tüpe üst, sulu faz transfer. sulu ve organik faz arasında beyaz bir arayüz görünene kadar, bu çıkarma tekrarlayın (genellikle 2 ekstraksiyon toplam) hazırlandı. Kalıntı kloroform davlumbaz ekstre süpernatanlarından buharlaşmasına izin verin. </li></ol></li></ol> Aktivitesi, kaplama ve test süpernatanların 3. hazırlanması <ol><li> P. syringae soyunun tek bir koloni KB 3 ml duyarlılığı bakımından test edilecek inoküle, oda sıcaklığında çalkalanarak gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Ertesi sabah, geri taze KB içine kültürü 1/100 sulandırmak. Oda temperatu çalkalayarak 3-4 saat bekletinyeniden. </li><li> ultra saf su içinde agar (w / v) bir süspansiyon 0,35-0,7% otoklav ile sterilize su agarı hazırlayın. Not: Yumuşak su agarı bir stok bir mikrodalga fırında eritilir ve tekrar tekrar yeniden kullanılabilen, yeni bindirme her bir deney için hazır olmasına gerek yoktur. su-agar yeniden kullanılır, tamamen mikrodalga aşağıdaki erimiş emin olmak için önemlidir. Değilse, bindirme yorumlanması zor hale getirecek katılaşmadan üzerine grenli doku olacak. Bu durum ortaya çıkarsa, uzun önceden yapılması daha mikrodalgada birkaç dakika agar eritebilir. </li><li> Kullanımdan önce 60 ° C&#39;lik bir su banyosu içinde, erimiş yumuşak agar koruyun. Bir steril kültür tüpüne transfer yumuşak agar 3 ml steril serolojik pipeti kullanarak. Bir eriyik halinde tutmak için su banyosuna kültür tüpü geri dönün. </li><li> İlk (sıcak ama dokunmak sıcak değil hissetmeniz gerekir) erimiş agar soğumasını bekleyin, kaplamayı dökmek için, ancak katılaşmaya izin vermez. </li><li> steril bir başlık olarak, 100 ul inoküleyumuşak ağar ve girdap içine test suşu kültür karıştırın. Bir alt Agar (KB ağan) üzerine dökün, ardından 10-15 saniye elle kültür döndürün. yumuşak agar eşit alt agar kapsar sağlamak için her yöne plaka eğin. NOT: Alt agar testi suşu şiddetle büyür hangi herhangi katılaşmış (% 1.5 ağar) bir araç olabilir. Standart 100 mm çaplı Petri kabı için ~ 20 ml orta eridi kullanın. (Kurutulmadan 4 ° C de muhafaza) veya aynı gün hazırlanabilir taban agar vaktinden birkaç hafta hazırlanabilir. bindirme yapmadan aynı gün hazırlanan ise, 3.4 adıma kadar önce yapmak en iyisidir. </li><li> plaka örtün ve 20-30 dakika katılaşmaya izin verir. sertleşirken plaka rahatsız etmemek için dikkatli olun. </li><li> Bir kez süpernatan 2-5 ul nokta, katılaşmış bindirme üzerinde (bölümleri, yukarıda 1 ve 2, elde edilmektedir). Plakalar, oda sıcaklığında gece boyunca inkübe izin verin. Incelenir ve kaydedilir sonuçları ertesi sabah. Bunu not etyapar ve süpernatan, bir seri seyreltme nokta için yararlı olabilir. Bu araştırmacılar bakteriyofaj ve bakteriyosin takas etkinliği ayırt sağlayacaktır. 5 ya da 1:10 seyreltiler Bu durumda, 1 gerçekleştirmek tavsiye edilir. </li></ol>

<ol><li>Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriocins+and+their+position+in+the+next+wave+of+conventional+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+of+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics.</a> Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).</li>
<li>Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+Predictive+Understanding+of+Earth%27s+Microbiomes+to+Address+21st+Century+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges.</a> MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).</li>
<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).</li>
<li>Michel-Briand, Y., Baysse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pyocins+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The pyocins of Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).</li>
<li>Ghequire, M. G. K., De Mot, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomally+encoded+antibacterial+proteins+and+peptides+from+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas.</a> FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).</li>
<li>Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colicin+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+and+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Colicin Biology.</a> Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).</li>
<li>Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+Microbial+Invasions%3A+Amplification+Allows+Virus+Carriers+to+Invade+More+Rapidly+When+Rare%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare.</a> Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).</li>
<li>Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crystal+Structure+of+the+Lipid+II-degrading+Bacteriocin+Syringacin+M+Suggests+Unexpected+Evolutionary+Relationships+between+Colicin+M-like+Bacteriocins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins.</a> J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).</li>
<li>Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Co-Option+of+a+Tailed+Bacteriophage+into+a+Killing+Complex+in+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas.</a> MBio. 6 (4), (2015).</li>
<li>Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytotoxic+properties+of+Pseudomonas+syringae+pv.+syringae+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).</li>
<li>Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+Genomics+of+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+of+Plant-Associated+Bacteria%22%5BJournal%5D)">Ecological Genomics of Pseudomonas syringae.</a> Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).</li>
<li>Panec, M., Katz, D. S. Plaque Assay Protocols. , Available from:
 <a target="_blank" href="Microbelibrary.org at http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3073-plaque-assay-protocols">Microbelibrary.org at http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3073-plaque-assay-protocols</a> (2013).</li>
<li>Gratia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+Relationships+between+Lysogenic+Bacteria+and+Particles+of+Bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Inst+Pasteur%22%5BJournal%5D)">Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage.</a> Ann Inst Pasteur. 57, 652(1936).</li>
<li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).</li>
<li>Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeng%2C+NCK+%22Bacteriocins%22">Bacteriocins</a>. (Chapter 4), 45-92 (2007).</li>
<li>Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+Method+for+Bacteriocin+and+Distribution+of+Bacteriocin-producing+Strains+in+Lactobacillus+acidophilusGroup+Lactic+Acid+Bacteria+Isolated+from+Human+Feces%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada açıklanan yumuşak agar bindirme tekniği yaygın olarak bakteriyofajlar veya bakteriyosinlere ilgilenen araştırmacılar tarafından on yıllar boyunca uygulanmıştır. Bu yaklaşımın temel yararları, basit, ucuz ve yorumlamak nispeten kolay olmasıdır. PEG çökeltme ve seri dilüsyonu ile yumuşak agar kalıbı birleştirerek, antimikrobiyal ajanlar (örneğin bakteriofaj genel tailocin sırasıyla) replikatif olmayan genel düşük moleküler ağırlıklı maddeler genel yüksek ve replikatif maddeler ayrılabilir. Son olarak, farazi bakteriyosin veya profajından loci hedeflenen genetik manipülasyon (silme ve tamamlama) birleştirilmesi sıkıca belirli bir antagonistik bileşiğin kimliğini kurabilir. Biz son zamanlarda yeni bir bakteriyofaj türevi Pseudomonas syringae arasında yaygın bakteriyosin 9 suşları tanımlamak için bu yöntemi kullanmışlardır. Pseudomonas sy için iyi bu protokol çalışmalarında gösterilen büyüme ortamı ve koşullarıringae ve büyük olasılıkla, bu koşullar altında kuvvetli bir şekilde büyümesi için diğer Gram-negatif bakteriler için yeterli olacaktır. Ancak, bu yöntemi kullanarak araştırmacılar kendi sistemi için zamanlama, kültür ortamı, indüksiyon yöntemi ve inkübasyon sıcaklığı optimize etmek isteyeceksiniz. kritik parametreler, logaritmik büyüme fazı sırasında üretim kültürü doğurma, hem de düzgün bir bakteriyel dağılımını sağlamak için yeterli Logaritmik faz kültürü ile yumuşak agar kalıbı tohum, ancak potansiyel temizleme bölgeleri belirsiz olacaktır aşırı derecede kültürü içerir. Orada SOS cevabının bir parçası olarak bağlı olmayan birçok bakteriyosinler, daha çok bu gibi peptid bazlı çekirdek algılama sistemleri, bu şekilde, bir araştırmacı, birkaç farklı indüksiyonu taranması için isteyebilir (15, özellikle Gram-pozitif bakteriyosinlerin) (aracılığıyla indüklenir uyarıcı ortam, ya da üreten bir suşundan uzun inkübasyon) sağlayan besin içeriğinin değiştirilmesi. KullanırkenBu teknik, yumuşak agar katlamalı önce iyice tohumlama gerginlik ilavesinden 55-60 ° C&#39;de eritilir ve muhafaza edilmelidir. Biz (görsel olarak ortaya çıktı gerçi) ve grenli görünüme sahip bir bindirme sonuçlandı yumuşak agar iyice erimiş değildi çeşitli deneyler vardı. grenli kaplama sonuçları hala ancak bu (gözlemlemek daha zor olacaktır zayıf inhibisyon) inhibe gücüne bağlıdır, genellikle yorumlanabilir olabilir. Bu teknik kullanılarak, erimiş agar sıcaklığı tohumlama gerginlik öldürme önlemek için, önceden tohumlama suşu ile aşılama soğumaya için yeterli bir zaman izin verilen zaman son bir, karıştırıcı bir değişken dikkate. Bu sorunu önlemek için, biz yumuşak agar dokunmak, sıcak, sıcak, ama olmadığından emin olun. Bu doğrultuda, biz de erimiş agar ACCLIMATE bir tohumlama kültürü için yetersiz zaman vermek durumunda, bindirme dökülmesinden önce, biz genellikle kötü bakteri g kurtarmak olduğunu gözlemledimBelirli engelleme zor veya imkansız yorumlanması yorumlamak için yapar rowth. Biz vorteks ve bindirme dökme arasındaki inkübasyon 10-15 ek süre bekleyin nedeni budur. Tamamen erimiş halde agar muhafaza arasındaki ticaret-off (sıcak değil daha iyidir) muhtemelen deneme yanılma yoluyla bir araştırmacı tarafından belirlenecek gerekecektir biridir tohumlama zorlanma değil öldürücü (sıcak iyidir). PEG ile çöktürme kademesi kullanılırsa, steril sıvı ortamı kültür yüzey ile aynı şekilde işlenen bir negatif kontrol dahil etmek yararlı olacaktır. Bu aktiviteyi öldürme örnek süpernatant içinde kalan PEG veya kloroform sonucu olmadığını sağlayacaktır. bakteriyofajlar ve bakteriyosinler hem son derece spesifik olma eğilimi de, soyların, belirli bir kombinasyonu ile belirgin bir öldürme aktivitesini karşılaşmaya bir durum değildir. Bu soy spesifik yeniden çeşitli kaynaklanabilirdirencin mekanizmaları, bir test suşu yoksun veya belirli bir bakteriyosin veya bakteriyofaj göre hedefleme için gerekli reseptörünün tanınmayan bir sürümü vardır ya varlık. Alternatif bir yöntem, bakteriyosin tarama yöntemi Kawai ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir. Ama mahzurlar ve yaygın 16 kabul edilmemiştir. Özel olarak, bu teknik, külfetli olabilir zaman aralıklarında suyu örnekleri görülmesini gerektirmektedir ve türetilmiş-bakteriyofaj ve bakteriyosin türetilmiş öldürme faaliyetleri arasındaki ayrım izin vermez. Bu tekniğin temel sınırlamaları iyi sağlam büyümek değil (ve böylece kolayca ayırt edilebilir takas bölgeleri olacak eksikliği) ya da sağlam laboratuvar koşullarında üretilmiş olmadığını liman prophages veya bakteriyosinleri organizmalar için uygun değildir olmasıdır. Bu tekniğin adaptasyon programı genişletmek istiyorum, hem çevresel örneklerde üretilen bakteriyosinleri tespit etmek içinve bu tekniğin doğal ortamlarında bakteriyosinlerin rolüne daha fazla fikir kolaylaştırır.

Son zamanlarda, antibiyotiğe dirençli patojenlerin 1,2 mücadelede kullanmak için mikrobiyal ekoloji anlayışı (çeşitli ortamlarda özellikle microbiomes) yanı sıra, yeni antibakteriyel bileşikler derinleştirilmesi önemli ilgi olmuştur. Bu çıkarları arasında bir ara bağlantı teması doğal ortamda bakteri türleri arasında uzlaşmaz etkileşimleri anlamaktır. Bakteri rakipleri 3 antagonize ettiği sayısız yolu vardır. Bakteriyosinler, proteinli, antibakteriyel bileşiklerin çeşitli bir grup, uzun Pseudomonas aeruginosa 4,5 ve Escherichia coli 6, önemli insan patojenleri olmanın en çok çalışılan türlerin ikisi ile, interbacterial antagonizma aracılık rolleri nedeniyle çalışılmıştır. Bakteriyosinlerin ek olarak, indüklenen prophages da soyu önceden 7 kolonize olan bir niş işgal sağlayan anticompetitor maddeler olarak işlev görebilir. Pseudomonas syringae tek bir protein bakteriyosinlerin 8, bakteriyofaj kuyruk türetilmiş bakteriyosinlerin 9 (adlandırılır tailocins), hem de non-protein ikincil metabolitlerin 10 de dahil olmak üzere antimikrobiyal maddeler, bir dizi üretmek için bilinen bir bitki patojendir. Son zamanlarda bu antimikrobiyaller onlar bitki hastalığı 11 kontrol olmak üzere kullanılabilecek nasıl yanı sıra, bu organizmanın ekolojisini nasıl etkilediğini anlamada ilgi olmuştur. bakteriyosinler ve bakteriyofaj hem araştırılması için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, yumuşak agar katlamalı bir tekniktir. Bu yöntem ilk olarak bakteriyofaj 12,13 numaralandırma yardımına 1936 yılında Gratia tarafından tarif edilmiştir. Burada (üç farklı antimikrobiyal maddeler arasında bakteriyofaj ayırt, hedeflenen gen teknolojisi ve polietilen glikol (PEG) çöktürme ile kombinasyon halinde, yumuşak agar katlamalı yönteminin uygulanmasını tarif yüksek molekül ağırlıklı bir bactTek bir bakteri suşu tarafından üretilen eriocin ve düşük molekül ağırlıklı bir bakteriyosin). Bu yaklaşımın faydası o kesinlikle olmak &#39;düşük teknoloji&#39; rağmen, hala yaygın olarak kullanılmaktadır neden olan nispeten basit ve ucuz olmasıdır.

<table><tbody><tr><td>Mitomisin C</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-3514</td><td>Kanserojen. özellikle stok çözeltisini hazırlarken uygun KKD (yani eldiven, göz koruması ve yüz maskesi) kullanın.</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34854</td><td>Akut toksik, solunum tehlikesi. Uygun KKD (eldiven ve göz kalkanı) kullanın, açık kapları kimyasal davlumbaz içinde tutun.</td></tr><tr><td>Polietilen Glikol (PEG)</td><td>Amresco</td><td>0159</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyolojik sınıf agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-274</td><td></td></tr></tbody></table>

yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

yumuşak agar bindirme tekniği aslında 70 yıl önce geliştirilmiş ve yaygın olarak bakteriyofajların ve bakteriyosinlere, proteinli antibakteriyel ajanlar ile çalışmak da dahil olmak üzere mikrobiyolojik araştırmalar birkaç alanlarda kullanılmaktadır. Bu yaklaşım en az kaynak gereksinimleri ile, nispeten ucuzdur. Bu teknik, (toksik bir bileşik (ler) e potansiyel olarak hassas) bakteriyel test türünün tohumlanır katılaştırılmış yumuşak agar bindirme üzerinde (ve potansiyel olarak toksik bileşik (ler) barındıran) bir verici suşundan süpernatan tespit oluşur. Biz Pseudomonas syringae bir kütüphane intraspecific öldürülmesi için suşlarının taranması için bu tekniği kullanılmıştır. bir çökeltme aşaması ve hedeflenen gen delesyonlu bu yaklaşımı birleştirerek, aynı suşu tarafından üretilen çok sayıda toksik bileşikler ayrıştırılabilir. genellikle bu tekniği kullanarak kurtarılan iki karşıt ajanlar bakteriyofajlar ve bakteriyosinler vardır. Bu iki ajan kullanılarak ayırt edilebiliriki basit ek testler. bakteriyofaj içeren bir süpernatan bir seri seyreltme yapılarak, daha fazla seyreltme ile orantılı az hale tek tek plaklar neden olur, oysa daha yüksek seyreltme üniform daha bulanık olan bir temizleme bölgesine neden olur bakteriyosin ihtiva eden bir yüzer seri dilüsyon. bakteriyosin seyreltme sayesinde taze yumuşak agar çim transfer zaman bakteriyosin bir temizleme bölgesini üretmeyecektir ise, aynı suşu ile tohumlanır taze yumuşak agar bindirme üzerine noktalar Ayrıca, bir bakteriyofaj bir temizleme bölgesi üretir.

yumuşak agar kaplama ve PEG çökeltme kombinasyonu aynı suşu tarafından üretilen farklı antimikrobiyal maddelerin belirlenmesi ve karakterize etmek için kullanılabilir. Şekil 1, aynı türün, bir üçüncü türü tarafından inhibe edilir, P. syringae (A ve B) iki soy gösterir. iki suş, bununla birlikte farklı bakteriosin ile inhibe edilir. suşu A takas bölge gerilme B takas alanı daha büyüktür, keskin kenar sergileyen ve olmayan keskin sınır sergiler. Özellikle A ve B belirgin bakteriyosinlerin duyarlı suşları (bakteriyosin eksikliği) teyit bakteriyosin (eksikliği tailocin) tailocin veya düşük molekül ağırlığına ya da inaktive üreten suş olan genetik manipülasyonlar. Şekil 2, bakteriyofaj aracılı öldürmeyi bir seyreltme serisi karşılaştırarak diğer replikatif olmayan antimikrobiyal ayırt edilebilir olduğunu göstermektedir. Her iki bakteriyosinlere çünküprofajından mitomisin C işlenerek indüklenebilir, bu iki ajan faaliyetleri yakın (aktif faj bol özellikle) birbirine benzer olabilir. bakteriyosin aracılı temizleme gibi plaklar içine çözmek olmaz ise bakteriyofaj aracılı temizleme durumunda, süpernatanın seyreltme bireysel plakların (takas bölgeleri) içine çözecektir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> Şekil 1: Aynı suşu tarafından üretilen çoklu antimikrobiyal ajanların fenotipik ayrım. tailocin eksikliği suşunda temizleme eksikliği, ama bakteriyosin eksikliği suşu ile kanıtlandığı gibi, bu ortamda, alternatif bir düşük molekül ağırlıklı bakteriyosin yüksek moleküler ağırlıklı bir bakteriyosin (tailocin), ancak duyarlıdır. Bunun aksine, suş B tailocin hassas olmayan, ancak düşük molekül ağırlıklı bakteriyosin duyarlıdır. tailocin effic olandüşük molekül ağırlıklı bakteriyosinler değil ise iently PEG çökeltme gerilemiştir. WT vahşi tip =. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> Şekil 2: replikatif olmayan antimikrobiyal ve bakteriyofajlar arasında ayrım. Daha az sayıda olmak bireysel plaklarda bakteriyofaj sonuçları (yüksek titre üst, düşük titre alt) yüksek titre (A) Sulandırma. Bireysel plaklar içine gidermez eşit az açıklıkta bakteriyosinler sonuçları (B) Sulandırma. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Diğer bakterilere karşı inhibe edici bileşiklerin üretimi için bakteri kültürlerini taramak için basit bir yöntem açıklıyoruz.

Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Bu prosedürün genel amacı, bir bakteri suşu tarafından üretilen ve ikinci bir bakteri suşu üzerinde inhibitör etki gösteren ajanların taranmasıdır. Bu yöntem, birçok mikrobiyolojik alandaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; özellikle mikrobiyal ekolojide, antagonist bakteriyel etkileşimlerin anlaşılmasında oldukça faydalıdır. Bu tekniğin temel avantajı, düşük maliyetli olması, uygulanmasının ve sonuçlarının yorumlanmasının kolay olmasıdır.Prosedür, laboratuvarda görevli bir öğrenci olan Aretha tarafından gösterilecektir. Deneye başlamak için, tek bir P syringae kolonisini 3 milliliters King's Medium B broth veya KB besiyerine inoküle edin. Kültürü gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, broth kültürünü 3 milliliters taze KB broth içine 1'e 100 oranında dilüe edin.Kültürü oda sıcaklığında, çalkalayarak üç ila dört saat inkübe edin. Kültürde belirgin bir bulanıklık artışı olduğundan emin olun ve ardından Mitomycin C ekleyin. Sonrasında, kültürü oda sıcaklığında, çalkalayarak gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, Mitomycin C ile indüklenmiş kültürlerin bir ila iki mililitresini masaüstü mikro santrifüjde peletleyin.Kültür süpernatantlarını 0,22 mikrometre gözenek boyutuna sahip bir filtreden geçirerek uzaklaştırın ve sterilize edin. Steril süpernatanta, bir molar konsantrasyona ulaşana kadar sodyum klorür ve %10 final konsantrasyona ulaşana kadar polietilen glikol veya PEG 8000 ekleyin. Hem sodyum klorür hem de PEG tamamen çözünene kadar numuneleri tekrar tekrar altüst edin.Numuneleri bir saat boyunca buz banyosunda inkübe edin. Ardından, numuneleri santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı dökün ve peleti, tekrarlayan pipetleme yöntemiyle tampon çözeltide yeniden süspande edin.Eşit hacimde kloroform ile yapılan iki ardışık ekstraksiyonla kalıntı PEG'i uzaklaştırın. Kloroformu yeniden süspanse edilmiş peletle birleştirin ve karışımı 15 saniye boyunca vorteksleyin. Ardından karışımı beş dakika boyunca 20, 000 ×g'de santrifüjleyin.Üstteki sulu fazı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Sulu ve organik faz arasında beyaz bir ara yüz görünmeyene kadar bu ekstraksiyon işlemini iki kez tekrarlayın. Ekstrakt süpernatantlarındaki kalıntı kloroformun bir çeker ocak içerisinde buharlaşmasını bekleyin.Bir P syringae suşunun tek bir kolonisini üç mililitre KB içerisine ekleyin ve kültürü oda sıcaklığında çalkalamalı olarak gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, kültürü taze KB içerisinde 1'e 100 oranında seyreltin. Kültürü oda sıcaklığında çalkalamalı olarak üç ila dört saat inkübe edin. Ardından, ultra saf su içindeki agar süspansiyonunu otoklavlayarak steril su agarı hazırlayın.Eritilmiş yumuşak agarı kullanım öncesinde 60 derece Celsius'lik bir su banyosunda muhafaza edin. Steril bir serolojik pipet kullanarak, üç mililitre yumuşak agarı steril bir kültür tüpüne aktarın. Kültür tüpünü, eriyik halde kalmasını sağlamak için tekrar su banyosuna yerleştirin.Üst katmanı dökmeden önce, eritilmiş agarın soğumasını bekleyin ancak katılaşmasına izin vermeyin. İnokülasyon öncesinde agarın sıcak ve tamamen eritilmiş durumda tutulması kritiktir. Aksi takdirde, üst katman granüllü bir görünüme sahip olacak ve yorumlanması daha zor olacaktır.Steril bir çeker ocak içerisinde, test suş kültüründen 100 µL miktarında yumuşak agara inoküle edin ve karıştırmak için vorteksleyin. Kültürü elinizle 10 ila 15 saniye boyunca döndürün, ardından bir agar plakasının tabanına dökün. Yumuşak agarın alt agarı eşit şekilde kapladığından emin olmak için plakayı her yöne eğin.Plakayı kapatın ve katılaşması için 20 ila 30 dakika bekleyin. Katılaşma sırasında plağı sarsmamaya dikkat edin. Katılaştıktan sonra, overlay üzerine iki ila beş µL süpernatan damlatın.Plakları oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin. Sonuçları ertesi sabah gözlemleyin ve kaydedin. Bu yöntem kullanılarak, iki P syringae suşunun farklı bakteriyosinler tarafından inhibe edildiği görülmektedir.Suş A, yüksek moleküler ağırlıklı bir bakteriyosin olan Tailocin'e karşı duyarlıdır, ancak alternatif düşük moleküler ağırlıklı bir bakteriyosine karşı duyarlı değildir. Buna karşılık, Suş B Tailocin'e karşı duyarsızdır, fakat düşük moleküler ağırlıklı bakteriyosine karşı duyarlıdır. Tailocin, PEG çöktürmesi sonrası verimli bir şekilde geri kazanılırken, daha düşük moleküler ağırlıklı bakteriyosinler kazanılmaz.Bakteriyofaj aracılı öldürme, bir dilüsyon serisi karşılaştırılarak diğer replike olmayan antimikrobiyallerden ayırt edilir. Bakteriyofaj aracılı temizlenmede, süpernatantın dilüsyonu tekil plaklara veya temizlenme bölgelerine ayrışırken, bakteriyosin aracılı temizlenme bu tür plaklara ayrışmamıştır. Bu prosedür, inhibitör ajanları belirlemek için bir ön tarama olarak kullanılabilir ve bu aktivitenin kaynağını belirlemek veya doğrulamak için sonraki genetik manipülasyonlarla birleştirilebilir.

use-soft-agar-overlay-technique-to-screen-for-bacterially-produced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kültür mikroorganizmalar için kullanılan medya ve reaktifler ile çalışırken, aseptik tekniği kontaminasyonu minimize edilmiştir sağlamak için uygulanan olmalıdır. Kaplama yöntemleri çeşitli rutin bir şekilde, izole yaymak veya numaralandırma bakteri ve faj, deney malzemelerinin steriliteyi korumaya işlemleri dahil, her biri için kullanılır.

Aseptik Laboratuvar Teknikleri: Kaplama Yöntemleri

Kaynak: Rugjee, K. N., ve diğerleri. Pseudomonas aeruginosa'da c-di-GMP Sinyalini Modüle Eden Küçük Moleküllerin Taranması için Yüksek Verimli Bir Kurulumun Kurulması.  J. Vis. Uzm. (2016).Bu video, c-di-GMP'ye duyarlı bir promotörün kontrolü altında yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden genetiği değiştirilmiş bakteriler kullanılarak siklik di-GMP modülatörlerinin taranmasını göstermektedir. Floresan, farklı test bileşikleri içeren çok kuyulu bir plakada ölçülür. C-di-GMP üretimini...

Bir Floresan Raportör Proteini Eksprese Eden Bakteriler Kullanılarak Siklik di-GMP Modülatörlerinin Taranması 

Kaynak: Hockett, K. L. ve Baltrus, D. A. Bakteriyel üretilen inhibitör bileşikleri taramak için yumuşak agar kaplama tekniğinin kullanımı. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, antibiyotikle indüklenen donör suşundan süpernatantın test sürünü içeren yumuşak agar kaplamasına yerleştirilerek bakteriyosin kaynaklı öldürme yöntemini göstermektedir. Kuluçka sonrası oluşan net bölgeler bakteriyel inhibisyonu gösterir.

Pseudomonas şıringaelerinde bakteriyosin aracılı öldürmeyi tespit etmek için yumuşak agar örtü testi

Bu video, bir bakteri türü tarafından üretilen antimikrobiyal bileşiklerin başka bir rakip bakteri türünü nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılan ertelenmiş büyüme inhibisyonu testini göstermektedir.

Bakteri Kaynaklı Antimikrobiyal Bileşiklerin Etkisini Değerlendirmek için Ertelenmiş Bir Büyüme İnhibisyonu Testi

Streptococcus pneumoniae'deki rekabete, pnömokok ve diğer ilgili türlere karşı inhibe edici aktiviteye sahip bakteriyosinler, küçük antimikrobiyal peptitler aracılık eder. Burada, bakteriyosin aktivitesinin ve inhibitör spektrumun karakterizasyonuna, bakteriyosine özgü bağışıklığa ve salgılanan çekirdek algılama peptitlerinin saptanmasına izin veren optimize edilmiş bir bakteri kaplama testini açıklıyoruz.

Kaplama Testi kullanarak niteliksel Pnömokok Bakteriyosinlerin Bakteriyel Üretim ve Hassasiyet Tedbir

Bu makalede, başarılı antibakteriyel ilaç keşfi ve bileşik testi için yeni bir güçlü bir araç sağlayarak, Pseudomonas aeruginosa siklik di-GMP hücresel seviyelerini işlemek için potansiyel yeteneği küçük moleküllerin büyük kütüphanelerinin taranması amacıyla kurulmuştur yüksek verimli deneyi anlatır.

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Ertelenmiş büyüme inhibisyonu testi, bir bakteri izolatının diğeri üzerindeki rekabet etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. İnhibisyon, inhibitör üreten izolatın etrafındaki temizleme bölgesinin ölçülmesiyle ölçülür veya inhibisyonun görünür derecesinin belirlenmesiyle kalitatif olarak değerlendirilir.

Ertelenmiş Büyüme İnhibisyon Tahlili Rekabet Bakteri kaynaklı Antimikrobiyal Etkisi belirlememize

Bu çalışma, biyofilm inhibitörlerini ve bunların Bacillus subtilis çok hücrelilik üzerindeki etkilerini incelemek için tekrarlanabilir metodolojilerin geliştirilmesini sunmaktadır.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

Bu protokolde sunulan ortak kültür etkileşimi tahlilleri ucuz, yüksek iş ortası ve basittir. Bu tahliller, ortak kültürdeki mikrobiyal etkileşimleri gözlemlemek, etkileşim kalıplarını belirlemek ve insan ve çevresel patojenlere karşı mikrobiyal bir ilgi nin önleyici potansiyelini karakterize etmek için kullanılabilir.

Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

Bu yöntem makalesinde, bakteriyel kalıcılık üzerinde önemli bir etkisi olan ozmolitler gibi kimyasal bileşikleri tanımlamak için yüksek verimli bir tarama stratejisi sunuyoruz.

Bakteriyel Kalıcılık Üzerindeki Etkilerini Aydınlatacak Kimyasal Bileşiklerin Yüksek Verimli Taranmasını

Öğrenin bakteriyel inhibitörleri yumuşak agar üst tabaka tekniğiyle taramayı. P. syringae suşları kullanılarak mikrobiyal ekolojide antagonistik etkileşimleri incelemek için uygun maliyetli ve etkili bir yöntemdir.

Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

Daha fazla video keşfet