Name: Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Öğrenin DNA aptamer ve küçük molekül etkileşimlerini mikro termoforesis kullanarak karakterize etmeyi. Bu yöntem ATP bağlanma sitesi haritalama ve bağlanma parametrelerini hızla belirlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar hiçbir onayları var.

Aptamer Çalışma Stok 1. Hazırlık <ol><li> Üreticinin talimatlarını takip ve 100 uM nihai konsantrasyon ulaşan su (18 referans 5-Cy5 CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sıra) oligonükleotidi çözülür. </li><li> Bağlama tamponu ile 200 nM oligonükleotid stokları seyreltilerek aptamer çalışma çözeltisi hazırlayın (20 mM Tris, pH 7.6, 300 mM NaCI, 5 mM MgCl2,% 0.01 Tween 20). </li><li> 90 ° C&#39;de 2 dakika süreyle inkübe karışımı Numune hemen buz üzerinde soğuması ve oda sıcaklığında örneğini kullanır. </li></ol> Ligand seyreltme serisi 2. hazırlanması <ol><li> ) SAM (her ligandın (adenozin trifosfat (ATP), adenosin difosfat (ADP), adenosin monofosfat (AMP), adenin, guanosin trifosfat (GTP), sitosin trifosfat (CTP) deoksiadenosin trifosfat (dATP), ve S-adenosil metiyonin ; 10 mM stok her), bir 16 adım seri diluti hazırlamaküzerinde 200 ul mikro reaksiyon tüpleri. NOT: agrega kaldırmak için yardımcı olabilir 14.000 xg&#39;de 5 dakika boyunca ligand stoklarının Santrifüj. Düşük hacimli, düşük bağlanma reaksiyon tüpleri tüp duvarları moleküllerin adsorpsiyonu önlemek için tavsiye edilir. </li><li> Tahmini yakınlığından daha yüksek, en az 50 kez maksimum konsantrasyonu ile başlar ve her seyreltme basamağında% 50 lıgand konsantrasyonunu azaltır. NOT: Kontrol yazılım uygulanan konsantrasyon bulma aracı bağlama verileri taklit ve seyreltme serileri için doğru konsantrasyon aralığı bulma yardımcı olur. </li><li> 16 mikro tepkime tüpleri içine 2 aptamer bağlanma tamponu 10 ul ekle borunun 1 ligand stok (10 mM) 20 ul doldurun. </li><li> Transferi 10 tüp 2 tüp 1 ul ve yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı düzgün karıştırın. Bir sonraki tüp 10 uL aktarın ve kalan tüpler için bu seyreltme tekrarlayın. </li><li> Son tüpten 10 ul fazlalığı atın. Herhangi b önlemekUffer dilüsyon etkisi. tüp 1 ve tüpler 2-16 tampon aynı olmalıdır. </li></ol> Nihai reaksiyon karışımı 3. hazırlanması <ol><li> Pipetleme hatalarını en aza indirmek için, bireysel bağlama 20 | il hacminde reaksiyonları (aptamer hazır çözelti + ilgili ligand seyreltme 10 ul, 10 ul) hazırlayın. Sadece 4 ul bir hacim kılcal ll fi oluşturulmasına yeterli olduğunu. </li><li> Her bir bağ seyreltme 10 ul 200 nM aptamer çalışma çözeltisinin 10 ul ilave edin ve pipetleme ve birkaç kez aşağı doğru karıştırılır. </li><li> numune içine kılcal damarların batırarak standart kılcal damarların içine numunelerin ll oda sıcaklığında ve fi 5 dakika boyunca örnekleri inkübe. Daha uzun inkübasyon süreleri, bazı etkileşimler için gerekli olabilir; Bununla birlikte, 5 dakika için en uygundur. DEĞİL optik ölçüm alınacak orta kısmında, üzerinde, sadece tarafta kılcal dokunun. </li><li> th üzerine kılcal yerleştirine kılcal tepsisi ve MST cihazı başlatmak. </li></ol> 4. MST Cihazı Başlangıç NOT: Cihaz iki önceden yüklenmiş yazılım paketlerini, üretilen verilerin yorumlanması için yazılımın &#39; &quot;&#39; analiz kontrolü deneysel koşullar ve teknik kurulumu için yazılım &#39;&quot; sağlar. <ol><li> MST cihazın içine kılcal tepsisini yerleştirmeden önce, kontrol yazılımını başlatmak ve &#39;açılır menüden&#39; &quot; &#39;sıcaklık kontrolü de&quot; el sıcaklık kontrolü sağlamak&#39; seçerek genel istenilen sıcaklığa ayarlayın. Bu şekilde, 25 ° C&#39;ye kadar sıcaklık ayarlayın. Not: MST araçlar ısı kontrollü, 45 ° C 22 arasında olabilir. </li><li> Beklenen seviyeye ulaşmak için sıcaklık bekleyin ve ardından MST cihazın içine kılcal tepsiye yerleştirin. </li><li> Cy5 boyalar için &quot;kırmızı &#39;LED kanalı ayarlamak ve bir fl uorescenc kazanmak için LED güç ayarlamakStandart sensör MST cihaz 300 ila 1000 floresans birimleri e sinyali. % 25 LED güç bu çalışmada kullanılmıştır. NOT: 6,000 18,000 floresan üniteleri yüksek hassasiyetli sensörü ile MST için tavsiye edilir. </li></ol> 5. Kılcal Tarama <ol><li> &quot;Kontrol&quot; yazılım üzerinde kılcal konumunu seçme ve tıklayarak numunenin farklı kalite yönlerini kontrol etmek için bir kılcal taraması yürütmek &quot;kap tarama başlatmak&quot; MST ölçümü başlamadan önce. </li><li> floresan geliştirme / söndürme ve yazılım sokma etkileri (zirveleri U-şeklinde veya düzleştirilmiş) için kılcal taraması kontrol edin. Not: algılama ve floresan işlenmesi ve yapışma etkileri hakkında daha fazla ayrıntı tartışma bulunabilir. </li></ol> 6. MST Ölçümü NOT: MST ölçümü başlamadan önce, dışlamak emin olun yapışmasını etkileri, geliştirme / söndürme etkisi, ya dapipetleme hataları ve kılcal tarama fl uorescence sinyali oluşturulmasına yeterli olduğunu gösterir emin olun. Daha fazla bilgi için, tartışma bakın. <ol><li> . &#39;&#39; Kontrolü &quot;yazılım ilgili kılcal konumuna sulandırma dizileri &#39;nden ligand konsantrasyonları atama aptamer liganda karıştırma seyreltme adım olarak (1: 1). </li><li> Kılcal # 1 için ligand yüksek konsantrasyon (5 mM) doğru olarak girin seyreltme türünü seçin (burada, 1: 1), maksimum konsantrasyon tıklayın ve otomatik kılcal kalan konsantrasyonlarını # 2- atamak için sürükle işlevini kullanın 16. düşük konsantrasyon 152.6 nM&#39;dir. </li><li> kontrol yazılımı ilgili bölümündeki fl uorescent aptamer (burada, 100 nM) konsantrasyonunu girin. </li><li> 5 sn fl uorescence tespit varsayılan ayarları kullanın 30 sn MST kayıt ve lazer t inaktivasyonu sonra başka bir 5 saniye floresan kayıt<html> o moleküllerin geri emilimini izlemek. </li><li> kontrol yazılımı ilgili bölümündeki% 20 lazer gücünü ayarlayın. NOT: sipariş en iyi sinyal-gürültü oranını almak ve belirsiz etkileri önlemek için ise,% 20-40 bir lazer güç tavsiye edilir. Belirli durumlarda, daha yüksek bir lazer gücü bağlanmamış ve bağlanmış moleküller, iyi bir ayırma için gerekli olabilir. </li><li> Hedef klasörü seçtikten sonra deney kaydedin ve &#39;Başlat MST ölçümü &quot;düğmesine basarak MST ölçümü başlatmak. NOT: .ntp dosyası hedef klasörde oluşturulur. Bu kurulumu kullanarak, bir ölçüm 10-15 dakika sürer. </li><li> EC50 değeri daha doğru bir şekilde belirlenmesi için en az iki kez deney prosedürü tekrarlayın. Not: Teknik tekrarlanabilirliğini test etmek amacıyla, aynı kılcal taranabilir birkaç kez (Teknik tekrarlar). </li></ol> 7. MST Veri Analizi nt &quot;&gt; Not: analiz yazılımı ölçüm sırasında fl y ilişkin verilerin analizini sağlayan analiz yazılımı ligand konsantrasyonu 37 karşı MST zaman izleri ve normalize fl uorescence (F norm) değişiklikleri çizer.. <ol><li> MST analiz yazılımı (MO.Affinity Analizi) başlatın ve hedef klasörden .ntp dosyasını yüklemek. veri seçme menüsünde analiz türü olarak &quot;MST&quot; i seçin. Not: liganda bağımlı floresans etkileri durumunda, başlangıç ​​floresans analizi için seçilebilir. </li><li> sürükle-bırak yöntemiyle veya ilgili deneysel çalışma altındaki &quot;+&quot; düğmesine basarak yeni bir analize ilgili teknik veya biyolojik run (ler) ekleyin. </li><li> Deneyin, MST izleri, kılcal tarama, kılcal şekli, ilk floresan ve ağartma oranı özellikleri hakkında bilgi edinmek için ilgili deneysel çalışma Aşağıdaki bilgiler düğmesine basın. NOT: Bu ham veriler can albu yüzden analizin daha sonraki adımlarda kontrol edilmelidir. </li><li> Görme görünür darbelere ve ani olarak toplama ve yağış etkilerinden MST izleri, kontrol edin. NOT: algılama ve toplama etkilerinin aktarılması konusunda daha fazla bilgi için, tartışma okudum. </li><li> Görme düzleştirilmiş ya da U-şekilli zirveleri olarak görünür kılcal tarama ve adsorpsiyon etkileri kılcal şekil bindirme, kontrol edin. Görme kılcal tarama ve floresan efektleri için ilk floresan inceleyin. Görme etkileri photobleaching için ağartma oranını kontrol edin. </li><li> doz-yanıt moduna geçin ve ilgili düğmeye basarak kadar &quot;uzman&quot; mod analizi ayarını değiştirin. MST değerlendirme stratejisi olarak &quot;T-Jump&quot; seçeneğini seçin. </li><li> eğri fi tting için &quot;Tepe&quot; modelini seçin. bağlayıcı parametreleri otomatik olarak hesaplanacaktır. &quot;Sonuçları karşılaştırmak&quot; menüsünden normalleşme ilgili türünü seçerek veri normalleştirmek. ihracatBir .xls veya .pdf gibi ya veri. NOT: bağlayıcı grafiğin Aşağıdaki tabloda hesaplanan bağlanma parametreleri özetlemektedir. </li></ol>

<ol><li>Linke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Automated+Microscale+Thermophoresis+Screening+Approach+for+Fragment-Based+Lead+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">An Automated Microscale Thermophoresis Screening Approach for Fragment-Based Lead Discovery.</a> J Biomol Screen. 21 (4), 414-421 (2015).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroScale+Thermophoresis%3A+Interaction+analysis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Structure%22%5BJournal%5D)">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li>
<li>Zillner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein%3A+nucleic+acid+interactions+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol Biol. 815, 241-252 (2012).</li>
<li>Zhang, W., Duhr, S., Baaske, P., Laue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+for+the+assessment+of+nuclear+protein-binding+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis for the assessment of nuclear protein-binding affinities.</a> Methods Mol Biol. 1094, 269-276 (2014).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat Commun. 1, 100(2010).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+microscale+thermophoresis+discriminates+sites+and+affinity+of+protein-ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Label-free microscale thermophoresis discriminates sites and affinity of protein-ligand binding.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10656-10659 (2012).</li>
<li>Seidel, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+quantifies+biomolecular+interactions+under+previously+challenging+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions.</a> Methods. 59 (3), 301-315 (2013).</li>
<li>Schubert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Df31+protein+and+snoRNAs+maintain+accessible+higher-order+structures+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Df31 protein and snoRNAs maintain accessible higher-order structures of chromatin.</a> Mol Cell. 48 (3), 434-444 (2012).</li>
<li>McKeague, M., Derosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> J Nucleic Acids. 2012, 748913(2012).</li>
<li>Ruscito, A., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Molecule+Binding+Aptamers%3A+Selection+Strategies%2C+Characterization%2C+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-Molecule Binding Aptamers: Selection Strategies, Characterization, and Applications.</a> Front Chem. 4, 14(2016).</li>
<li>Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+and+equilibrium+binding+characterization+of+aptamers+to+small+molecules+using+a+label-free%2C+sensitive%2C+and+scalable+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform.</a> Anal Chem. 86 (7), 3273-3278 (2014).</li>
<li>Chang, A. L., McKeague, M., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+characterization+of+aptamer+kinetic+and+equilibrium+binding+properties+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Facile characterization of aptamer kinetic and equilibrium binding properties using surface plasmon resonance.</a> Methods Enzymol. 549, 451-466 (2014).</li>
<li>Jing, M., Bowser, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+aptamer-protein+equilibria%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review.</a> Anal Chim Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).</li>
<li>Sokoloski, J. E., Dombrowski, S. E., Bevilacqua, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+ligand+binding+to+a+heterogeneous+RNA+population+in+the+malachite+green+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of ligand binding to a heterogeneous RNA population in the malachite green aptamer.</a> Biochemistry. 51 (1), 565-572 (2012).</li>
<li>Burnouf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kinITC%3A+a+new+method+for+obtaining+joint+thermodynamic+and+kinetic+data+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">kinITC: a new method for obtaining joint thermodynamic and kinetic data by isothermal titration calorimetry.</a> J Am Chem Soc. 134 (1), 559-565 (2012).</li>
<li>Mannironi, C., Scerch, C., Fruscoloni, P., Tocchini-Valentini, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recognition+of+amino+acids+by+RNA+aptamers%3A+the+evolution+into+an+L-tyrosine+binder+of+a+dopamine-binding+RNA+motif%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Molecular recognition of amino acids by RNA aptamers: the evolution into an L-tyrosine binder of a dopamine-binding RNA motif.</a> RNA. 6 (4), 520-527 (2000).</li>
<li>Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+molecular+discrimination+by+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution molecular discrimination by RNA.</a> Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).</li>
<li>Huizenga, D. E., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+aptamer+that+binds+adenosine+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A DNA aptamer that binds adenosine and ATP.</a> Biochemistry. 34 (2), 656-665 (1995).</li>
<li>Lee, E. R., Baker, J. L., Weinberg, Z., Sudarsan, N., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+allosteric+self-splicing+ribozyme+triggered+by+a+bacterial+second+messenger%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger.</a> Science. 329 (5993), 845-848 (2010).</li>
<li>Wickiser, J. K., Cheah, M. T., Breaker, R. R., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+ligand+binding+by+an+adenine-sensing+riboswitch%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The kinetics of ligand binding by an adenine-sensing riboswitch.</a> Biochemistry. 44 (40), 13404-13414 (2005).</li>
<li>Jucker, F. M., Phillips, R. M., McCallum, S. A., Pardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+heterogeneous+free+state+in+the+formation+of+a+specific+RNA-theophylline+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Role of a heterogeneous free state in the formation of a specific RNA-theophylline complex.</a> Biochemistry. 42 (9), 2560-2567 (2003).</li>
<li>Zhao, Q., Lv, Q., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+fluorescence+anisotropy+sensors+for+adenosine+triphosphate+by+comprehensive+screening+tetramethylrhodamine+labeled+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Aptamer fluorescence anisotropy sensors for adenosine triphosphate by comprehensive screening tetramethylrhodamine labeled nucleotides.</a> Biosens Bioelectron. 70, 188-193 (2015).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+fluorescence+anisotropy+method+for+detection+of+lead+%28II%29+ion+by+a+G-quadruplex-inducible+DNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">A sensitive fluorescence anisotropy method for detection of lead (II) ion by a G-quadruplex-inducible DNA aptamer.</a> Anal Chim Acta. 812, 161-167 (2014).</li>
<li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+an+in+vitro-evolved+RNA+aptamer+reveals+homogeneous+ligand+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of an in vitro-evolved RNA aptamer reveals homogeneous ligand binding kinetics.</a> J Am Chem Soc. 131 (29), 9866-9867 (2009).</li>
<li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev Sci Instrum. 81 (8), 083705(2010).</li>
<li>Zichel, R., Chearwae, W., Pandey, G. S., Golding, B., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+as+a+sensitive+tool+to+detect+subtle+modifications+in+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aptamers as a sensitive tool to detect subtle modifications in therapeutic proteins.</a> PLoS One. 7 (2), 31948(2012).</li>
<li>Baaske, P., Wienken, C. J., Reineck, P., Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+thermophoresis+for+quantifying+the+buffer+dependence+of+aptamer+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Optical thermophoresis for quantifying the buffer dependence of aptamer binding.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (12), 2238-2241 (2010).</li>
<li>Entzian, C., Schubert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+small+molecule-aptamer+interactions+using+MicroScale+Thermophoresis+%28MST%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Studying small molecule-aptamer interactions using MicroScale Thermophoresis (MST).</a> Methods. 97, 27-34 (2016).</li>
<li>Valenzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+Identification+of+DNA+Aptamers+to+Tyramine+Using+in+Vitro+Selection+and+High-Throughput+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">Screening and Identification of DNA Aptamers to Tyramine Using in Vitro Selection and High-Throughput Sequencing.</a> ACS Comb Sci. 18 (6), 302-313 (2016).</li>
<li>Jauset Rubio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Conglutin+dual+aptamers+binding+distinct+aptatopes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">beta-Conglutin dual aptamers binding distinct aptatopes.</a> Anal Bioanal Chem. 408 (3), 875-884 (2016).</li>
<li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+Binding+Studies+Using+MicroScale+Thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis.</a> Methods Mol Biol. 1380, 99-111 (2016).</li>
<li>Stoltenburg, R., Schubert, T., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Selection+and+Interaction+Studies+of+a+DNA+Aptamer+Targeting+Protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro Selection and Interaction Studies of a DNA Aptamer Targeting Protein A.</a> PLoS One. 10 (7), 0134403(2015).</li>
<li>Kinghorn, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+Affinity+Maturation+by+Resampling+and+Microarray+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection.</a> Anal Chem. 88 (14), 6981-6985 (2016).</li>
<li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (52), 19678-19682 (2006).</li>
<li>Braun, D., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+DNA+by+thermophoretic+depletion+and+convection%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Trapping of DNA by thermophoretic depletion and convection.</a> Phys Rev Lett. 89 (18), 188103(2002).</li>
<li>Duhr, S., Arduini, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermophoresis+of+DNA+determined+by+microfluidic+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+E+Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 15 (3), 277-286 (2004).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., Wienken, C. J., Braun, D., Baaske, P., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interaction+studies+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Molecular interaction studies using microscale thermophoresis.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (4), 342-353 (2011).</li>
<li>He, K., Dragnea, V., Bauer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenylate+Charge+Regulates+Sensor+Kinase+CheS3+To+Control+Cyst+Formation+in+Rhodospirillum+centenum%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Adenylate Charge Regulates Sensor Kinase CheS3 To Control Cyst Formation in Rhodospirillum centenum.</a> MBio. 6 (3), 00546(2015).</li>
<li>Brvar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+discovery+of+substituted+4%2C5%27-bithiazoles+as+novel+DNA+gyrase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-based discovery of substituted 4,5'-bithiazoles as novel DNA gyrase inhibitors.</a> J Med Chem. 55 (14), 6413-6426 (2012).</li>
<li>Pogorelcnik, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4%2C6-Substituted-1%2C3%2C5-triazin-2%281H%29-ones+as+monocyclic+catalytic+inhibitors+of+human+DNA+topoisomerase+IIalpha+targeting+the+ATP+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">4,6-Substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as monocyclic catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIalpha targeting the ATP binding site.</a> Bioorg Med Chem. 23 (15), 4218-4229 (2015).</li>
<li>Jhaveri, S., Rajendran, M., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+signaling+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of signaling aptamers.</a> Nat Biotechnol. 18 (12), 1293-1297 (2000).</li>
<li>Khavrutskii, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification-free+method+of+binding+affinity+determination+by+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Ramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cocaine-antibody+interactions+in+buffer+and+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Probing cocaine-antibody interactions in buffer and human serum.</a> PLoS One. 7 (7), 40518(2012).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+activity+and+interaction+mechanisms+study+of+novel+glucopyranoside+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Antiviral activity and interaction mechanisms study of novel glucopyranoside derivatives.</a> Bioorg Med Chem Lett. 25 (18), 3840-3844 (2015).</li>
<li>Wan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+molecular+recognition+of+the+granuphilin+C2A+domain+with+PI%284%2C5%29P2%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lipids%22%5BJournal%5D)">Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2.</a> Chem Phys Lipids. 186 (4,5), 61-67 (2015).</li>
<li>Harazi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interaction+of+UDP-N-Acetylglucosamine+2-Epimerase%2FN-Acetylmannosamine+Kinase+%28GNE%29+and+Alpha-Actinin+2+Is+Altered+in+GNE+Myopathy+M743T+Mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The Interaction of UDP-N-Acetylglucosamine 2-Epimerase/N-Acetylmannosamine Kinase (GNE) and Alpha-Actinin 2 Is Altered in GNE Myopathy M743T Mutant.</a> Mol Neurobiol. , (2016).</li>
</ol>

CE ve TS biyofiziksel analitik hizmet vermektedir 2bind GmbH çalışanlarıdır. Bu video-makale için yayın ücreti 2bind GmbH tarafından karşılanır.

Kalite kontrolleri: Spesifik olmayan yapışma / yüzeylere örnek malzeme, hem de çekiş etkileri adsorpsiyon, afinite verinin kalitesi üzerinde önemli bir etkisi vardır. Ancak, sadece bir kaç state-of-the-art teknolojileri izlemek ve bu etkilerden kaçınmak için doğru ve hızlı seçenekler sunuyoruz. MST algılar ve teknik kurulum adım adım optimizasyonu sağlayan, bu sorunların üstesinden gelmek için yardımcı entegre kalite kontrolleri sunmaktadır. toplama / yağış etkileri (adım 7.7) hareket profiller...

moleküller arasındaki etkileşim doğasının temelidir. Bu nedenle, temel ve uygulamalı araştırma birçok alanda bilim farklı moleküler etkileşimlerin temel ilkelerini anlamaya çalışın. Mikro Termoforesis (MST) tamponların bir özgür seçim ile, çözelti içinde moleküler etkileşimlerin hızlı, hassas, düşük maliyetli ve kalite kontrollü karakterizasyonu gerçekleştirmek için bilim adamları sağlar. Birden fazla bağlanma ortakları 1-8 ile olay doğrulamaları, rekabet deneyleri ve deneyleri bağlayıcı, kütüphane taramaları da dahil olmak üzere analizler farklı türde anlatan, yalnız 2016 den, MST kullanarak 1000&#39;den fazla yayın zaten vardır. Genel olarak, MST, moleküler etkileşimin herhangi bir bağlanma afinitesi (mM&#39;ye pM), stokiyometri ve termodinamik, klasik bağlanma parametreleri, çalışmasına izin verir. MST büyük bir avantajı etkileşimi mümkün boyutundan bağımsız bağlayıcı olayları incelemek için yeteneğidir. hatta çal&#39;ıBu küçük moleküller, ilaçlar, antibiyotikler, veya metabolitler olarak zorlu bir yöntem, küçük nükleik asit aptamerler arasındaki etkileşimler (nt 15-30) ve hedefler belirlenebilir. Güncel state-of-the-art teknolojileri aptamer hedef etkileşimleri laboratuvar yoğun ve son derece karmaşık ya vardır karakterize ya da aptamer-küçük molekül 9,10 etkileşimleri ölçmek için başarısız. Plasmon Rezonans (SPR) deneyleri 11,12 ve İzotermal Titrasyon Kalorimetre (ITC) 13-15, izokratik elüsyon 16, denge fi ltration 17,18 olarak gerçekten etiket içermeyen Kalorimetre yaklaşımları, tabanlı Surface, in-line 19 Jel- sondalama deneyleri vardiya, Durduğunuz akış fl uorescence spektroskopisi 20,21, floresan anizotropi (FA) 22,23, tek-molekül fl uorescence görüntüleme 24,25 ve Bio-katmanlı enterforemetre (BLI) 26 de aptamer-küçük molekül ile kesin olmayan veya uyumsuz ya vardır etkileşimleri. diğer principaBu yöntemlerin l sorunları düşük duyarlılık, yüksek numune tüketimi, hareketsizlik, yüzeylerde toplu taşıma sınırlamalar ve / veya tampon kısıtlamaları vardır. Bu teknolojilerin sadece birkaç toplama ve adsorpsiyon efektleri için entegre kontroller sağlar. MST bilim adamları bu tür proteinlerin 30-33 olarak aptamers ve küçük moleküllerin 27-29 arasındaki etkileşimleri, yanı sıra diğer hedefleri incelemek için bu sınırlamayı aşmak için için güçlü bir araç temsil eder. Teknoloji sıcaklık değişimleri ile moleküllerin hareketine dayanır. Olarak adlandırılan bu yönlendirilmiş hareket, &quot;Termoforosis,&quot; molekülün 34,35 büyüklüğüne, ücret ve hidrasyon kabuğu bağlıdır. moleküle bir ligand bağlanmasının doğrudan değiştirildi thermophoretic hareket ile sonuçlanan, aşağıdaki parametrelerden en azından birinin değiştirecektir. Küçük boyutları ile ligandlar bağlı duruma bağlanmamış gelen boyut değişim açısından önemli bir etkiye sahip olmayabilir, ama onlar dr olabilir<html> hidrasyon kabuğu ve / veya şarj amatic etkiler. Bağlama ortağı ile etkileşim sonrası moleküllerin thermophoretic hareketinde değişiklik temel bağlanma parametreleri 2,7,34,36,37 ölçülmesini sağlar. Şekil 1A &#39;de gösterildiği gibi, MST cihazı flüoresan tespiti için aynı optik kullanılarak cam kılcal olan numune üzerine odaklanmış bir kızıl ötesi lazer oluşur. Lazer sıcaklık gradyanı (2-6 ° C DT) kurarken tryptophans 6 ya da flüoresan bir etkileşim, ortak olarak 3,8 arasında içsel fl uorescence ile proteinlerin thermophoretic hareketi izlenebilir. Boşluk, DT, içinde sıcaklık farkı Soret ile belirlenebilir yüksek bir sıcaklıkta alanında azalması veya molekül birikmesine yol açar, Katsayı (St): g &quot;/&gt; C sıcak ısıtılmış bölgede konsantrasyonunu temsil eder, ve C, soğuk ilk olarak soğuk bölge konsantrasyonudur. Şekil 1B, ilgili zaman dilimlerinde ayrılabilir farklı aşamalarında oluşan MST hareket profilinin (zaman iz), tipik bir MST deney sonuçları gösterildiği gibi. başlangıç ​​floresans kesin bir başlangıç ​​floresans tanımlamak ve ışıkla ağartma ya photoenhancement kontrol etmek için sıcaklık gradyanı yokluğunda yer alan birinci 5 saniye cinsinden ölçülür. Sıcaklık Jump (T-Jump) hangi floresan değişiklikleri thermophoretic hareketinden önce safhasını oluşturuyor. floresanstaki bu ilk azalma kuantum verimi uorophore fl ısıya bağlı değişikliklere bağlıdır. Termoforosis aşaması nedeniyle sabit durum dağılım kadar molekül thermophoretic hareketine flüoresans azalır (veya artar) ulaşıldığında edildiği izler.Lazer kapatıldıktan sonra Şekil 1B gösterildiği gibi ters TJump ve BM uorescent moleküllerin beraberinde geri difüzyon gözlenebilir. Temel bağlanma parametreleri erişmek için, etkileşim ortakları farklı molar oranları incelenmiş ve karşılaştırılmıştır. Optik görebilir molekülü sabit tutulur ve etiketlenmemiş ligandın artan bir miktarı ile temin edilir ise tipik olarak, 16 farklı oranlar bir MST deneyde incelenmiştir. İki bağlanma ortakları arasındaki etkileşim Termoforosis değişiklikleri uyarır ve bu nedenle normalize fl uorescence olarak aşağıdaki şekilde hesaplanır F norm: <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F sıcak ve F soğuk MST izleri de fi ned zaman noktalarında fl uorescence yoğunlukları ortalama temsil eder. Bağlanma ilgileri (Kd ve EC50 değerleri) Curv hesaplanabilire uydurma (Şekil 1C). Genel olarak, MST her türlü moleküler etkileşimleri çalışmak için güçlü bir araçtır. ve 25-nt kısa ssDNA aptamer DH25.42 (7.9 kDa); Bu yazının küçük molekül adenozin trifosfat (0.5 kDa ATP) arasındaki zorlu etkileşimi karakterize bir protokol sunar. Yazının boyunca ATP molekülü üzerindeki aptamer bağlanma yeri ATP adenin grubuna aşağı eşleştirilir.

<table><tbody><tr><td>Aptamer bağlayıcı tampon</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl<alt>2</alt>; %0.01 Ara-20</td></tr><tr><td>Floresan etiketli ATP aptamer</td><td>IDT, Leuven, Belçika</td><td></td><td>dizisi: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Almanya&nbsp;</td><td>A2383</td><td>10 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de depolanır; C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Almanya&nbsp;</td><td>A2754</td><td>10 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de depolanır; C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Almanya&nbsp;</td><td>A2252</td><td>10 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de depolanır; C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich, Almanya&nbsp;</td><td>A8626</td><td>10 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Almanya&nbsp;</td><td>A7007</td><td>10 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de depolanır; C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Almanya&nbsp;</td><td>11934511001</td><td>10 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de depolanır; C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Almanya&nbsp;</td><td>C1506</td><td>10 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de depolanır; C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Almanya&nbsp;</td><td>G8877</td><td>10 mM stok çözeltileri - 20 ° C'de depolanır; C</td></tr><tr><td>Monolit NT.115&nbsp;</td><td>NanoTemper Teknolojileri, Münih, Almanya</td><td>MO-G008</td><td>Mavi/Kırmızı Kanal Standart dedektörlü MST cihazı, Monolith NT115 pico, yüksek hassasiyetli dedektöre sahip MST cihazıdır</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 kılcal damarlar Standart</td><td>NanoTemper Teknolojileri, Münih, Almanya</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR tüpleri</td><td>Eppendorf, Almanya</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Monolith kontrol yazılımı. 2.1.33, önceden yüklenmiş cihaz</td><td>NanoTemper Teknolojileri, Münih, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.affinity analizi v2.1.1</td><td>NanoTemper Teknolojileri, Münih, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Sinerji Yazılımı</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikro termoforesis kullanarak atp bir aptamer bağlama sitesi haritalama

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Moleküler etkileşimlerin bağlanma afinitesi, stokiyometri ve termodinamik gibi temel bağlanma parametreleri açısından karakterizasyonu, temel ve uygulamalı bilimlerde önemli bir adımdır. Mikro Ölçekli Termoforez (MST), bu önemli bilgiyi elde etmek için hassas bir biyofiziksel yöntemdir. Moleküllerin sıcaklık gradyanları boyunca hareketini tanımlayan termoforez adı verilen fiziksel bir etkiye dayanan bu teknoloji, çözeltideki bağlanma parametrelerinin hızlı ve hassas bir şekilde belirlenmesine olanak tanır ve tampon koşullarının (tampondan lizatlara/serumlara kadar) serbest seçimine izin verir. MST, bağlanmamış bir molekülün, bir bağlanma partneri ile kompleks halinde olan bir molekülden farklı bir termoforetik hareket gösterdiği gerçeğini kullanır. Termoforetik hareket, boyut, yük ve hidrasyon kabuğundaki değişiklikler nedeniyle moleküler etkileşim anında değişir. İki bağlayıcı ortağın farklı moleküler oranlarının hareket profillerini karşılaştırarak, bağlanma afinitesi (pM ila mM) gibi nicel bilgiler belirlenebilir. Aptamerler ve küçük bileşikler gibi küçük boyutlu moleküller arasındaki zorlu etkileşimler bile MST tarafından incelenebilir. DH25.42 DNA aptamer ve ATP arasındaki iyi çalışılmış model etkileşimini kullanarak, bu el yazması aptamer-küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmek için bir protokol sağlar. Bu çalışma, MST'nin oldukça hassas olduğunu ve 7.9 kDa DNA aptamerinin bağlanma bölgesinin ATP'nin adenine haritalanmasına izin verdiğini göstermektedir.

Bu çalışmada, MST ATP DH25.42 DNA aptamer 18 bağlanma sitesi karakterize etmek için uygulanmıştır. ATP veya rasgele bir veya daha fazla fluorophores 38-40 ile etiketlenmiş proteinler ile küçük moleküller ATP&#39;ye taklit etkileşimlerini karakterize eden başka çalışmalardan farklı olarak, bu çalışma 5&#39;ucundaki bir Cy5 molekülü ile 7.9 kDa ssDNA aptamer etiketlenmiş bir versiyonunu içerir . Farklı ATP türevlerinin ve ilgili moleküllerin, çeşitli pozisyonlarda ATP...

MicroScale Thermophoresis (MST), aptamer-hedef etkileşimlerini karakterize etmek için hassas bir teknolojidir. Bu el yazması, aptamer-küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmek için bir MST protokolünü açıklamaktadır.

Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Bu deneyin genel amacı, mikroölçekli termoforesis kullanarak bağlanma bölgesi haritalama dahil olmak üzere DNA aptamer-küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmektir. Bu yöntem, moleküler etkileşimlerin temel bağlanma parametrelerine ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknolojinin temel avantajı, etkileşim ortağının boyutundan bağımsız olmasıdır; bu da aptamerler ve küçük moleküller arasındaki zorlu etkileşimlerin kalite kontrol verilerinin elde edilmesine olanak tanır.Bu yöntem aptamer küçük molekül etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilse de, ilaç-hedef veya antijen/antikor etkileşimleri gibi diğer moleküler etkileşimlere de uygulanabilir. Prosedüre başlamak için, distile su içerisinde Cy5 işaretli DNA DH25.42 aptamerinin 100 micromolar stok çözeltisini hazırlayın. Ardından, aptamer stok çözeltisini bağlanma tamponu ile 200 nanomolar düzeyine seyreltin.Aptamer çalışma çözeltisini 90 °C'de iki dakika boyunca inkübe edin. Çözeltiyi buz üzerinde oda sıcaklığına soğutun. Ardından, test edilecek ligandın 16 basamaklı seri dilüsyonu için düşük bağlanma özellikli 200 µL'lik mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve hazırlayın.1. tüpe 10 millimolar ligand stok çözeltisinden 20 µL ve bağlanma tamponu ekleyin. 2'den 16'ya kadar olan tüplere 10 µL bağlanma tamponu ekleyin. Ardından, 1. tüpteki ligand stokundan 10 µL'yi 2. tüpe aktarın ve pipetle iyice karıştırın.Seyreltilmiş karışımdan 10 µL'yi 3 numaralı tüpe aktarın ve iyice karıştırın. Seri seyreltme işlemini, gerekiyorsa tampon seyreltme etkilerini düzelterek bu şekilde sürdürün ve işlem bittiğinde 16 numaralı tüpteki fazla 10 µL'yi atın. Her bir seyreltme örneğine 10 µL aptamer çalışma çözeltisi ekleyin ve pipetle iyice karıştırın.Numuneleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Ardından, her bir karışımı temiz bir standart kılcal boruya çekin; bu işlem sırasında kılcal boruya yalnızca uç kısımlarından dokunduğunuzdan emin olun. Kılcal boruları, konsantrasyonlarının azalan sırasına göre tepsi tutucuya yerleştirin.MST cihazını başlatın ve cihaz kontrol yazılımını açın. Manuel sıcaklık kontrolünü etkinleştirin ve cihaz sıcaklığını 25 °C olarak ayarlayın. Cihaz doğru sıcaklığa ulaştığında, kapiler tepsiyi yerleştirin.Cy5 işaretli aptamer için LED kanalını kırmızıya ayarlayın. Floresan sinyalinin 500 birim olması için LED gücünü ayarlayın. Ardından, kapiler konumlarını belirlemek ve numune kalitesini kontrol etmek için bir kapiler taraması gerçekleştirin.Elde edilen pikler U şeklinde veya düzleşmişse, yapışma etkilerini en aza indirmek için kodlu kapilerlerde yeni numuneler hazırlayın. MST cihaz yazılımında, ilk kapiler için ligand konsantrasyonunu ve dilüsyon tipini girin. Kalan kapilerlerin konsantrasyonlarını ve dilüsyonlarını doldurmak için tıklayıp sürükleyin.Final karışımdaki aptamer konsantrasyonunu girin. Deney yönteminin, beş saniye boyunca floresans algılayacak, 30 saniye boyunca MST kaydedecek ve ardından lazer kapatıldıktan sonra beş saniye daha floresans kaydedecek şekilde ayarlandığından emin olun. Lazer gücünü %20 olarak ayarlayın. Dosya yolunu belirleyin ve deney dosyasını kaydedin.Ardından MST ölçümünü başlatın. Bu şekilde en az üç ölçüm elde edin. Veri analizine başlamak için MST analiz yazılımını açın ve deney dosyasını yükleyin.Analiz tipi için MST'yi seçin. Analiz yazılımı, tüm ölçümlerin aynı kılcal tüp setinden yapıldığı teknik tekrarların karşılaştırılmasına olanak tanır. Farklı bir kılcal tüp setinden gelen biyolojik tekrarlar da analize eklenebilir.İlk ölçümün altındaki bilgi butonuna tıklayın. Agregasyon veya çökelme etkilerini belirten tümsekler veya sıçramalar için MST izlerini inceleyin. Ardından, yapışma veya absorbsiyon etkilerini belirten düzleşmiş veya U şeklindeki pikler için kapiler taramasını ve kapiler şekil üst üste bindirmesini inceleyin.MST'de agregatlar ve absorpsiyon etkileri hızla tespit edilebildiği için bu yöntem, optimal veri kalitesini sağlamak amacıyla teknik kurulumun hızlı ve süratli bir şekilde optimize edilmesine olanak tanır. Kılcal tarama ve başlangıç floresansında ligand bağımlı floresans sönümlenmesi veya artış etkilerini kontrol edin. Fotobeyazlama veya foto-artış belirtileri için zamanla meydana gelen floresans değişimini inceleyin.Veri kalitesi doğrulandıktan sonra, doz yanıt moduna geçin. T Jump MST değerlendirme stratejisinde uzman analiz ayarını seçin. Ardından, bağlanma parametrelerini otomatik olarak hesaplamak için eğri uydurma kısmında hill modelini seçin.Sonuçları karşılaştır menüsünde, bir normalizasyon türü seçin. Normalize edilmiş verileri bir hesap tablosu veya PDF dosyası olarak dışa aktarın. Bu prosedürde, tek zincirli bir DNA aptamerinin seçilmiş küçük moleküllü ligandlarla olan bağlanma etkileşimlerini incelemek için MST kullanılmıştır.MST eğrileri Hill denklemi ile uydurulmuş ve yarı maksimum etkili konsantrasyon değerleri belirlenmiştir. Aptamerin ATP ile yaptığı beş bağımsız biyolojik tekrarlı ölçümde, ATP-aptamer etkileşimi 6 ila 13 birimlik negatif bir bağlanma genliği ve yaklaşık 52.3 micromolar ortalama EC50 değeri göstermiştir. Her bir ligand için elde edilen veriler, bağlı molekül fraksiyonuna göre normalize edilmiş ve ardından karşılaştırılmıştır.ADP, AMP ve SAM için belirlenen EC50 değerlerinin ATP ile karşılaştırılması, fosfat grubu sayısının aptamer bağlanma davranışı üzerinde en fazla küçük bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Robo C2 hidroksil grubunun kaldırılmasının da aptamer bağlanma afinitesi üzerinde yalnızca küçük bir etki gösterdiği görülmüştür. Bir eşleşme grubu olmadığında veya eşleşme grubu guanin ile değiştirildiğinde aptamer bağlanma göstermemiştir.Aptamer tek başına adenine bağlanmıştır, bu da adenin grubunun aptamer için ana bağlanma bölgesi olduğunu daha net bir şekilde göstermektedir. Bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde temel bağlanma parametreleri hakkında kritik bilgileri dakikalar veya saatler içinde sağlayabilir.

mapping-binding-site-an-aptamer-on-atp-using-microscale

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

SELEX protokolleri da rasgele kütüphane bölgeleri kuşatan sabit primer dizilerinden gerektiren bağlı ligandlar, yenilenme gerektiren her hangi seçimin birden fazla mermi, oluşmaktadır. Bu sabit astar dizileri seçim süreci (yanlış pozitif ve negatif) ile karışabilir. Burada bir astar ücretsiz protokol sunuyoruz.

Rastgele bir DNA Kütüphane Kullanımı Primer-Aptamer Seçimi

Bu video, protein-lipid etkileşimini incelemek için mikro ölçekli termoforezi göstermektedir. Tahlil, bir sıcaklık gradyanına yanıt olarak floresan etiketli proteinlerin termoforetik hareketini ölçerek moleküller arasındaki etkileşimi tespit eder. Floresan molekülü, floresan olmayan lipid moleküllerinin farklı konsantrasyonları ile karıştırılır ve çözeltideki moleküllerin karışımı kılcal damarlara yüklenir. Kılcal damarlardaki numunelere bir sıcaklık gradyanı uygulanır ve floresan molekülünün...

Çözeltideki protein-lipid etkileşimlerini incelemek için mikro ölçekli termoforez

Mikro Termoforosis (MST) yaygın olarak hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan bağlanma afinitesinin belirlenmesinde kullanılabilir. Protokol, GFP-kaynaşık proteini, denatüre edici olmayan koşullar hücre parçalama ve ligand arasında değişen konsantrasyonlarda varlığında MST sinyalinin tespiti arasında aşırı içerir.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Ayarlanabilir sıkılık manyetik boncuk seçim yöntemine dayalı olarak küçük moleküllü hedefler için yapı anahtarlamalı aptamerleri seçmek için bir protokol sağlanır. Yapı değiştirme özelliklerine sahip olarak seçilen aptamerler, tarif edilen altın nanopartikül tahlili gibi bir hedefin varlığını işaret etmek için konformasyonel bir değişiklik gerektiren tahliller için faydalıdır.

Bir Kolorimetrik Altın Nanopartikül Testi Uygulanan Yapı-anahtarlama aptamers seçilmesi için bir yöntem

Vitro seçimi ve gruba özgü maddedir asit ester-bağlama DNA aptamers karakterizasyonu için bir protokol sunulmuştur. Bir elektrokimyasal aptasensor içinde seçilen aptamer uygulanması da dahil edilir.

Maddedir asit Ester-bağlama DNA Aptamer seçimi, karakterizasyonu ve elektrokimyasal bir Aptasensor uygulamaya

Mikro ölçekli termoforez, düşük malzeme maliyetiyle bağlanma sabitlerini hızlı bir şekilde elde eder. Etiketli veya etiketsiz mikro ölçekli termoforez ticari olarak temin edilebilir; Bununla birlikte, etiketsiz termoforez, floresan etiketler kullanılarak gerçekleştirilebilecek etkileşim ölçümlerinin çeşitliliğini sağlayamaz. Etiketli termoforez ölçümleri için bir protokol sağlıyoruz.

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

Bu protokol, numune hazırlama, çalışma standartları ve numuneler dahil olmak üzere bir DNA aptamer ve tetrasiklin arasındaki bağlanmanın ilişkisini ve ayrışma kinetiğini analiz etmek için İzotermal Titrasyon Kalorimetrisinin (ITC) kullanımını açıklamaktadır.

İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi Kullanılarak DNA Aptamer ve Tetrasiklinin Termodinamik ve Kinetik İlişkisinin Belirlenmesi

Antikanser aptamer gelişiminde gerekli bir adım, hedefe bağlanmasını test etmektir. Bu bağlanmayı incelemek için akış sitometrik tabanlı bir tahlil gösteriyoruz ve negatif bir kontrol aptamer ve bu belirli protein için pozitif veya negatif olan kanser hücrelerinin dahil edilmesinin önemini vurguluyoruz.

Bir Antikanser Aptamerinin Seçiciliğini ve Özgüllüğünü Değerlendirmek için Akış Sitometrisine Dayalı Hücre Yüzeyi Protein Bağlama Testi

Mevcut protokol, hedefleri tespit etmek için hızlı, 3 aşamalı, aptamer tabanlı üstel amplifikasyon testinin kullanımını göstermektedir. Numune hazırlama, sinyal amplifikasyonu ve renk gelişimi, kafein üzerinde teofilin varlığını tanımak için bu sistemi uygulamak için ele alınmıştır.

Aptamer tabanlı hedef tespiti, 3 aşamalı G-dörtlü izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonu ile kolaylaştırılmıştır

Bu protokol, bir sinyal raportörü olarak floresan ışıklı aptamer DAP-10-42 kullanan bölünmüş hibridizasyon problarının tasarımını ve bunların nükleik asit tespiti ve tek nükleotid ikameleri ile hedefler arasında farklılaşma için uygulamalarını ana hatlarıyla belirtir.

Diziye Özgü Nükleik Asit Analizi için Sinyal Raportörü Olarak DNA Floresan Işıklı Aptamer Kullanan Bölünmüş Hibridizasyon Probu

Öğrenin DNA aptamer ve küçük molekül etkileşimlerini mikro termoforesis kullanarak karakterize etmeyi. Bu yöntem ATP bağlanma sitesi haritalama ve bağlanma parametrelerini hızla belirlemenizi sağlar.

Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

Daha fazla video keşfet