Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama

Bu deneyin genel amacı, mikro ölçekli termoforez kullanarak, bağlanma yeri haritalaması da dahil olmak üzere DNA aptamer küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmektir. Bu yöntem, moleküler etkileşimlerin temel bağlanma parametreleri ile ilgili temel soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Bu teknolojinin temel avantajı, etkileşim ortağı boyutundan bağımsız olması ve aptamerler ile küçük moleküller arasındaki zorlu etkileşimlerin kalite kontrol verilerinin elde edilmesine izin vermesidir.

Bu yöntem, aptamer küçük molekül etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilse de, ilaç-hedef veya antijen / antikor etkileşimleri gibi diğer moleküler etkileşimlere de uygulanabilir. Prosedüre başlamak için, damıtılmış suda Cy5 etiketli DNA DH25.42 aptamerinin 100 mikromolar stok çözeltisini hazırlayın. Daha sonra, aptamer stok çözeltisini bağlayıcı tampon ile 200 nanomolar'a seyreltin.

Aptamer çalışma solüsyonunu 90 santigrat derecede iki dakika inkübe edin. Çözeltiyi buz üzerinde oda sıcaklığına soğutun. Daha sonra, test edilecek ligandın 16 aşamalı seri seyreltilmesi için düşük bağlayıcı 200 mikrolitrelik mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve yerleştirin.

10 milimolar stok ligand çözeltisinden 20 mikrolitre pipetleyin ve bağlayıcı tamponu tüp 1'e yerleştirin. 10 mikrolitre bağlayıcı tamponu 2 ila 16 arasındaki tüplere pipetleyin. Daha sonra 10 mikrolitre ligand stoğunu tüp 1'den tüp 2'ye aktarın ve pipetle iyice karıştırın.

Seyreltilmiş karışımın 10 mikrolitresini tüp 3'e aktarın ve iyice karıştırın. Seri seyreltmeye bu şekilde devam edin, gerekirse tampon seyreltme etkilerini düzeltin ve bittiğinde fazla 10 mikrolitreyi tüp 16'dan atın. Her seyreltmeye 10 mikrolitre aptamer çalışma solüsyonu ekleyin ve pipetle iyice karıştırın.

Numuneleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra her karışımı temiz bir standart kılcal damara çekin ve kılcal damara yalnızca uçlarından dokunduğunuzdan emin olun. Kılcal damarları azalan konsantrasyon sırasına göre tepsi tutucusuna yerleştirin.

MST cihazını başlatın ve cihaz kontrol yazılımını açın. Manuel sıcaklık kontrolünü etkinleştirin ve cihaz sıcaklığını 25 santigrat dereceye ayarlayın. Cihaz doğru sıcaklığa geldiğinde, kılcal tepsiyi yerleştirin.

Cy5 etiketli aptamer için LED kanalını kırmızıya ayarlayın. LED gücünü 500 birimlik bir floresan sinyali elde edecek şekilde ayarlayın. Ardından kılcal pozisyonları elde etmek için bir kılcal tarama yapın ve numune kalitesini kontrol edin.

Elde edilen tepeler U şeklinde veya düzleştirilmişse, yapışma etkilerini en aza indirmek için kodlanmış kılcal damarlarda yeni numuneler hazırlayın. MST cihaz yazılımında, ilk kılcal damar için ligand konsantrasyonunu ve seyreltme tipini doldurun. Kalan kılcal damarlar için konsantrasyonları ve seyreltmeleri doldurmak için tıklayın ve sürükleyin.

Son karışıma aptamer konsantrasyonunu girin. Deney yönteminin floresansı beş saniye boyunca algılayacak şekilde ayarlandığından emin olun, MST'yi 30 saniye boyunca kaydedin ve ardından lazeri kapattıktan sonra floresansı beş saniye boyunca kaydedin. Lazer gücünü %20'ye ayarlayın Dosya yolunu ayarlayın ve deney dosyasını kaydedin.

Ardından MST ölçümünü başlatın. Bu şekilde en az üç ölçüm elde edin. Veri analizine başlamak için MST analiz yazılımını açın ve deney dosyasını yükleyin.

Analiz türü için MST'yi seçin. Analiz yazılımı, tüm ölçümlerin aynı kılcal damar setinden olduğu teknik tekrarları karşılaştırmaya izin verir. Farklı bir kılcal damar setinden elde edilen biyolojik tekrarlar da analize eklenebilir.

İlk ölçümün altındaki bilgi düğmesine tıklayın. MST izlerinde, toplama veya yağış etkilerini gösteren tümsekler veya ani yükselmeler olup olmadığını inceleyin. Ardından, yapışma veya absorpsiyon etkilerini gösteren düzleştirilmiş veya U şeklindeki tepeler için kılcal tarama ve kılcal şekil kaplamasını inceleyin.

Agregalar ve absorpsiyon etkileri MST'de hızlı bir şekilde tespit edilebildiğinden, yöntem, optimum veri kalitesini sağlamak için teknik kurulumun hızlı ve hızlı bir şekilde optimize edilmesine olanak tanır. Kılcal taramada ve ilk floresanda ligand'a bağlı floresan söndürme veya geliştirme etkilerini kontrol edin. Fotoğraf ağartma veya fotoğraf geliştirme belirtileri için zaman içindeki floresan değişimini inceleyin.

Veri kalitesi doğrulandıktan sonra doz yanıt moduna geçin. T Jump MST değerlendirme stratejisinde uzman analizi ayarını seçin. Ardından, bağlama parametrelerini otomatik olarak hesaplamak için eğri uydurma için tepe modelini seçin.

Sonuçları karşılaştır menüsünde bir normalleştirme türü seçin. Normalleştirilmiş verileri bir elektronik tablo veya PDF dosyası olarak dışa aktarın. Bu prosedürde, tek iplikli bir DNA aptamerinin bir dizi küçük moleküllü ligand ile bağlanma etkileşimlerini araştırmak için MST kullanıldı.

MST eğrileri hill denklemi ile uyumlu hale getirildi ve yarı maksimal efektif konsantrasyon değerleri belirlendi. ATP ile aptamerin beş bağımsız biyolojik tekrar ölçümünde, ATP aptamer etkileşimi 6 ila 13 birimlik bir negatif bağlanma genliği ve yaklaşık 52.3 mikromolar ortalama EC50 değeri gösterdi. Her ligand için veriler, bağlı moleküllerin fraksiyonuna normalize edildi ve daha sonra karşılaştırıldı.

ATP ile karşılaştırıldığında ADP, AMP ve SAM için EC50 değerleri, fosfat gruplarının sayısının aptamer bağlanma davranışı üzerinde en fazla küçük bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Robo C2 hidroksil grubunun çıkarılması da aptamer bağlanma afinitesi üzerinde sadece küçük bir etki gösterdi. Aptamer, bir eşleştirme grubunun yokluğunda veya eşleşme grubu guanin olarak değiştirildiğinde bağlanmadı.

Aptamer tek başına adenine bağlandı, bu da adenin grubunun aptamer için ana bağlanma bölgesi olduğunu gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse dakikalar ila saatler içinde temel bağlama parametreleri hakkında temel bilgiler sağlayabilir.