Mikro Termoforesis kullanarak ATP bir aptamer Bağlama Sitesi Haritalama
January 7th, 2017
MicroScale Thermophoresis (MST), aptamer-hedef etkileşimlerini karakterize etmek için hassas bir teknolojidir. Bu el yazması, aptamer-küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmek için bir MST protokolünü açıklamaktadır.
Bu deneyin genel amacı, mikro ölçekli termoforez kullanarak, bağlanma yeri haritalaması da dahil olmak üzere DNA aptamer küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmektir. Bu yöntem, moleküler etkileşimlerin temel bağlanma parametreleri ile ilgili temel soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Bu teknolojinin temel avantajı, etkileşim ortağı boyutundan bağımsız olması ve aptamerler ile küçük moleküller arasındaki zorlu etkileşimlerin kalite kontrol verilerinin elde edilmesine izin vermesidir.
Bu yöntem, aptamer küçük molekül etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilse de, ilaç-hedef veya antijen / antikor etkileşimleri gibi diğer moleküler etkileşimlere de uygulanabilir. Prosedüre başlamak için, damıtılmış suda Cy5 etiketli DNA DH25.42 aptamerinin 100 mikromolar stok çözeltisini hazırlayın. Daha sonra, aptamer stok çözeltisini bağlayıcı tampon ile 200 nanomolar'a seyreltin.
Aptamer çalışma solüsyonunu 90 santigrat derecede iki dakika inkübe edin. Çözeltiyi buz üzerinde oda sıcaklığına soğutun. Daha sonra, test edilecek ligandın 16 aşamalı seri seyreltilmesi için düşük bağlayıcı 200 mikrolitrelik mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve yerleştirin.
10 milimolar stok ligand çözeltisinden 20 mikrolitre pipetleyin ve bağlayıcı tamponu tüp 1'e yerleştirin. 10 mikrolitre bağlayıcı tamponu 2 ila 16 arasındaki tüplere pipetleyin. Daha sonra 10 mikrolitre ligand stoğunu tüp 1'den tüp 2'ye aktarın ve pipetle iyice karıştırın.
Seyreltilmiş karışımın 10 mikrolitresini tüp 3'e aktarın ve iyice karıştırın. Seri seyreltmeye bu şekilde devam edin, gerekirse tampon seyreltme etkilerini düzeltin ve bittiğinde fazla 10 mikrolitreyi tüp 16'dan atın. Her seyreltmeye 10 mikrolitre aptamer çalışma solüsyonu ekleyin ve pipetle iyice karıştırın.
Numuneleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra her karışımı temiz bir standart kılcal damara çekin ve kılcal damara yalnızca uçlarından dokunduğunuzdan emin olun. Kılcal damarları azalan konsantrasyon sırasına göre tepsi tutucusuna yerleştirin.
MST cihazını başlatın ve cihaz kontrol yazılımını açın. Manuel sıcaklık kontrolünü etkinleştirin ve cihaz sıcaklığını 25 santigrat dereceye ayarlayın. Cihaz doğru sıcaklığa geldiğinde, kılcal tepsiyi yerleştirin.
Cy5 etiketli aptamer için LED kanalını kırmızıya ayarlayın. LED gücünü 500 birimlik bir floresan sinyali elde edecek şekilde ayarlayın. Ardından kılcal pozisyonları elde etmek için bir kılcal tarama yapın ve numune kalitesini kontrol edin.
Elde edilen tepeler U şeklinde veya düzleştirilmişse, yapışma etkilerini en aza indirmek için kodlanmış kılcal damarlarda yeni numuneler hazırlayın. MST cihaz yazılımında, ilk kılcal damar için ligand konsantrasyonunu ve seyreltme tipini doldurun. Kalan kılcal damarlar için konsantrasyonları ve seyreltmeleri doldurmak için tıklayın ve sürükleyin.
Son karışıma aptamer konsantrasyonunu girin. Deney yönteminin floresansı beş saniye boyunca algılayacak şekilde ayarlandığından emin olun, MST'yi 30 saniye boyunca kaydedin ve ardından lazeri kapattıktan sonra floresansı beş saniye boyunca kaydedin. Lazer gücünü %20'ye ayarlayın Dosya yolunu ayarlayın ve deney dosyasını kaydedin.
Ardından MST ölçümünü başlatın. Bu şekilde en az üç ölçüm elde edin. Veri analizine başlamak için MST analiz yazılımını açın ve deney dosyasını yükleyin.
Analiz türü için MST'yi seçin. Analiz yazılımı, tüm ölçümlerin aynı kılcal damar setinden olduğu teknik tekrarları karşılaştırmaya izin verir. Farklı bir kılcal damar setinden elde edilen biyolojik tekrarlar da analize eklenebilir.
İlk ölçümün altındaki bilgi düğmesine tıklayın. MST izlerinde, toplama veya yağış etkilerini gösteren tümsekler veya ani yükselmeler olup olmadığını inceleyin. Ardından, yapışma veya absorpsiyon etkilerini gösteren düzleştirilmiş veya U şeklindeki tepeler için kılcal tarama ve kılcal şekil kaplamasını inceleyin.
Agregalar ve absorpsiyon etkileri MST'de hızlı bir şekilde tespit edilebildiğinden, yöntem, optimum veri kalitesini sağlamak için teknik kurulumun hızlı ve hızlı bir şekilde optimize edilmesine olanak tanır. Kılcal taramada ve ilk floresanda ligand'a bağlı floresan söndürme veya geliştirme etkilerini kontrol edin. Fotoğraf ağartma veya fotoğraf geliştirme belirtileri için zaman içindeki floresan değişimini inceleyin.
Veri kalitesi doğrulandıktan sonra doz yanıt moduna geçin. T Jump MST değerlendirme stratejisinde uzman analizi ayarını seçin. Ardından, bağlama parametrelerini otomatik olarak hesaplamak için eğri uydurma için tepe modelini seçin.
Sonuçları karşılaştır menüsünde bir normalleştirme türü seçin. Normalleştirilmiş verileri bir elektronik tablo veya PDF dosyası olarak dışa aktarın. Bu prosedürde, tek iplikli bir DNA aptamerinin bir dizi küçük moleküllü ligand ile bağlanma etkileşimlerini araştırmak için MST kullanıldı.
MST eğrileri hill denklemi ile uyumlu hale getirildi ve yarı maksimal efektif konsantrasyon değerleri belirlendi. ATP ile aptamerin beş bağımsız biyolojik tekrar ölçümünde, ATP aptamer etkileşimi 6 ila 13 birimlik bir negatif bağlanma genliği ve yaklaşık 52.3 mikromolar ortalama EC50 değeri gösterdi. Her ligand için veriler, bağlı moleküllerin fraksiyonuna normalize edildi ve daha sonra karşılaştırıldı.
ATP ile karşılaştırıldığında ADP, AMP ve SAM için EC50 değerleri, fosfat gruplarının sayısının aptamer bağlanma davranışı üzerinde en fazla küçük bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Robo C2 hidroksil grubunun çıkarılması da aptamer bağlanma afinitesi üzerinde sadece küçük bir etki gösterdi. Aptamer, bir eşleştirme grubunun yokluğunda veya eşleşme grubu guanin olarak değiştirildiğinde bağlanmadı.
Aptamer tek başına adenine bağlandı, bu da adenin grubunun aptamer için ana bağlanma bölgesi olduğunu gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse dakikalar ila saatler içinde temel bağlama parametreleri hakkında temel bilgiler sağlayabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, mikroölçekli termoforez (MST) kullanarak DNA aptamer-küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmek için bir protokol sunmaktadır. MST, moleküler etkileşimlerde bağlanma parametrelerinin analizini sağlayan hassas bir tekniktir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Moleküler Biyoloji
- Analitik Kimya
Arka Plan
- MikroÖlçekli Termoforez (MST), moleküler etkileşimleri incelemek için kullanılır.
- Yöntem, etkileşim ortaklarının boyutuna bağımlı değildir.
- MST, zorlu aptamer-küçük molekül etkileşimleri için kalite kontrol verileri sağlayabilir.
- İlaç-hedef veya antijen/antikor gibi diğer etkileşimlere de uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- DNA aptamer-küçük molekül etkileşimlerini karakterize etmek.
- Aptamerizin bağlanma bölgelerini haritalandırmak.
- Moleküler etkileşimlerin anahtar bağlanma parametrelerini belirlemek.
Kullanılan Yöntemler
- Cy5 etiketli DNA DH25.42 aptamerin 100 mikromolar stok çözeltisinin hazırlanması.
- Aptamerizin stok çözeltisinin bağlanma tamponu ile 200 nanomolar'a seyreltilmesi.
- Etkileşimleri analiz etmek için mikroölçekli termoforez uygulaması.
- Bağlanma parametrelerini değerlendirmek için veri toplama ve analizi.
Ana Sonuçlar
- Aptamerizin küçük molekül etkileşimlerinin başarılı bir şekilde karakterize edilmesi.
- Bağlanma bölgelerinin ve parametrelerinin tanımlanması.
- Çeşitli moleküler etkileşimlere MST'nin uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
- Zorlu etkileşimler için kalite kontrol verilerinin sağlanması.
Sonuçlar
- MST, aptamer-küçük molekül etkileşimlerini incelemek için değerli bir araçtır.
- Yöntem, bağlanma dinamiklerinin anlaşılmasını artırır.
- Diğer moleküler etkileşim türlerine uzanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative mapping of aptamer-small molecule binding sites using MicroScale Thermophoresis (MST) addresses a critical need for precise target validation and mechanistic de-risking in early discovery. MST's sensitivity and independence from molecular size enable robust characterization of challenging interactions, supporting predictive confidence at key portfolio inflection points. This capability enhances the reliability of molecular interaction data for downstream screening and lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of binding affinity and specificity for aptamer-target interactions.
- Supports mechanistic de-risking by mapping precise binding sites, clarifying molecular recognition.
- Facilitates functional target validation for novel or challenging molecular entities.
- Provides rapid feedback on binding parameters to inform portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated quantitative outputs for assay standardization and reproducibility.
- Prepares robust biological systems for reliable compound screening workflows.
- Enables scalability and platform reuse by supporting diverse buffer and sample conditions.
- Ensures high-quality data for compound evaluation through rapid detection of aggregation or absorption artifacts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular interaction data with disease-relevant systems when aptamers are used as translational tools.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by providing consistent binding metrics.
- Supports risk-adjusted advancement decisions with quantitative, reproducible interaction data.
Pipeline & Workflow Integration
MST-based binding site mapping integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, enabling seamless data flow and decision-making.
- Discovery Biology: Provides hypothesis testing and pathway clarification by quantifying aptamer-ligand interactions.
- Screening: Offers reproducible, quantitative assay outputs for downstream screening readiness.
- Analytics: Generates EC50 and binding amplitude measurements to compare molecular conditions and optimize protocols.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when aptamers are leveraged in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes MST as a reusable platform for diverse molecular interaction studies beyond a single project.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for molecular interaction analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-quality binding data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on robust interaction metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biophysical assay setup and data interpretation.
- Needs access to MST instrumentation and compatible analytical software.
- Demands rigorous cross-team standardization for sample preparation and data quality control.
- May require adaptation of protocols for different aptamer or ligand systems.
- Sample aggregation or absorption artifacts must be rapidly identified and mitigated for optimal results.
