Nötr Kılcal kullanılarak monoklonal antikor izoformlannın Kapiler Elektroforez Ayırma

Günümüzde, kapiler hücre elektroforezi tekniği, monoklonal antikorlar gibi biyomoleküllerin analizi için en çözünürlüklü ve hassas yöntemlerden birini oluşturmaktadır. Ancak, bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması, numune ve sistem hazırlama aşamalarındaki kritik adımlarda analistin bilgi ve becerilerine bağlıdır. Bu eğitim; başarılı bir analizin nasıl yürütüleceğine, çözelti ve numunelerin hazırlanmasının ayrıntılı açıklamasına, kapiler elektroforez sisteminin hazırlanmasına, cihaz yöntem kurulumuna, veri değerlendirme ve işleme süreçlerine odaklanmaktadır.

Genel olarak bu protokol, analitik kimya laboratuvarlarının hazırlanmasında görev alan personelin becerilerinin geliştirilmesi ve iyileştirilmesi için kullanılabilir. 100 mililitrede 0,05 yüzde nihai konsantrasyon elde etmek için gerekli miktarda HPMC tartın. HPMC temel bir elastik polimer olduğundan, ilk adım olarak tozu bir cam behere dökün ve tozu ayrıştırmak için 80 mililitre suyu yavaşça ekleyin.

Ardından, toz kalıntılarını gidermek için ıslatma tepsisini suyla durulayın. Geri kalan reaktifleri her zamanki gibi ekleyin ve çözeltiyi karıştırın. pH değerini %50'lik asetik asit ile 4.8'e ayarlayın.

Ve çözeltinin beş dakika boyunca stabilize olmasına izin verin. Bundan sonra, gerekirse pH değerini ayarlayın. Final hacmi 100 mililitre olacak şekilde su ekleyin.

Hazırlanan BG çözeltisini nötrofilik bir membrandan süzün ve cam bir şişeye boşaltın. Son olarak, cam şişeyi uygun şekilde etiketleyin ve soğutma altında saklayın. Örneği hazırlamak için, ilk adım olarak 1,5 mililitrelik bir tüpe 162 µL iz element tampon çözeltisi ekleyin.

Ardından, 10 mg/mL konsantrasyonda önceden hazırlanmış 18 µL map örneği ekleyin. Üçüncü adım olarak, final örnek hacmi 200 µL olacak şekilde, önceden hazırlanmış %1'lik histamin çözeltisinden 20 µL ekleyin. Bir sonraki adımda, örneği beş saniye boyunca hazırlayın.

Ve beş saniye boyunca santrifüjleyin. Örnek hacminin tamamını aspire edin. Kabarcık oluşumunu önlemek için mikro-viyale yukarı doğru aktarın.

Son olarak, şişenin kapağını kapatın ve soğutucuda muhafaza edin. Güç düğmesine basarak CE cihazını kapatın. Ve ön kapağı açın.

Arayüz bloğunun altına yeni bir hareketli temizleme bezi yerleştirin. Bir yıkama şişesi kullanarak elektrotları arayüz bloğu üzerinden suyla durulayın. Suyun deliklerden süzülmesine izin verin ve arayüz bloğunu iyice kurulayın.

Elektrotlar üzerindeki fazla suyu silme beziyle dikkatlice alın. Bu işlem sırasında elektrotların içinde olmamaya dikkat edin. Silme bezini numune tutma sisteminden çıkarın.

Numune tepsilerinin yüzeyini, suyla nemlendirilmiş yeni bir tüy bırakmayan bezle temizleyin. Tampon tepsilerinin yüzeyini de aynı şekilde temizleyin. Tampon tepsilerini yukarı doğru kaydırın, numune tutma sistemini kaldırın ve yüzeylerini bezle temizleyin.

Tampon tepsilerini tekrar konumuna yerleştirin. Bunlardan sonra, arayüz bloğunu iyice temizleyin. Sıkıştırma çubuğunu ve UV lamba yuvasını temizleyin.

Son olarak, kullanmadan önce sistemi denediğinizden emin olun. Açma kollarını bir yıkama şişesi kullanarak suyla durulayın. Tozları ve birikmiş tuzları uzaklaştırmak için yüzeylerini yeni ve tüy bırakmayan bir bezle iyice temizleyin.

Son olarak, kurulumdan önce denediğinizden emin olun. Fiber optik kablonun iki ucunu suyla nemlendirilmiş mikrofiber bir bezle temizleyin ve uçlar arasındaki ışık podunu onaylayın. Yeni bir nötr kapiler tüpü paketinden çıkarın.

Kılcal borunun koruyucu borusunun bir ucunu çalışma tezgahına götürün. Plastik boruyu çözüp düzleştirin ve kılcal boruyu borunun içinden dikkatlice çekip çıkarın. Aşağıdaki ölçüm işaretlerinin bulunduğu bir kağıt parçasını çalışma tezgahına sabitleyin.

Kılcal tüp penceresini aşağıdaki şekilde santimetre ölçüm işaretlerinin sıfır noktasına hizalayın: Bundan sonra, kılcal tüp uçlarını bantla çalışma tezgahına sabitleyin. Kılcal tüp uçlarını, ölçüm işaretlerinin iki milimetre dışından işaretleyin. Pencereden en uzak olan kılcal tüp ucundaki koruyucu kapağı kesin.

Kılcal borunun iç kaplamasının kalıcı olarak hasar görmesini önlemek için kılcal ucu su dolu bir CE şişesine daldırın. Kılcal boruyu şişeden çıkarın ve bu ucu dikkatlice kartuşun çıkış tarafına yerleştirin. Kılcal boru diğer tarafta göründüğünde, kılcal boru penceresi aşağıdaki şekilde kartuş penceresine ortalanana kadar gerekli miktarda çekin.

Bundan sonra, kartuşu çevirin ve açıklık tapasını kartuş penceresine, yerine oturtana kadar bastırarak yerleştirin. Bu işlem sırasında kılcal pencerenin kırılmamasına dikkat edin. Geniş bir ışık kaynağına maruz kaldığında ışığın pencereden geçtiğini doğrulayın.

Kılcal boruyu, önceden monte edilmiş boru rakoru ve o-ringi bulunan önceden oluşturulmuş soğutucu borusunun içine yerleştirin. Kılcal boru diğer tarafta görünene kadar boru boyunca itin. Ardından, borunun ucunu kartuşun çıkış tarafına yerleştirin ve boru somunlarını sıkın.

Kılcal borunun giriş ucunu kartuşun giriş tarafına yerleştirin. Kılcal boru diğer taraftan göründüğünde, gerektiği kadar çekin. Ardından, boru ucunu kartuşun giriş tarafına yerleştirin ve boru somunlarını sıkın.

Kılcal tüp ucundaki koruyucu kapağı pencereye en yakın olan kısımdan kesin. Ardından hücre tutucu klipsleri, şu şekilde yerine oturana kadar bastırarak kılcal tüp uçlarının üzerine takın. Kılcal tüp uçlarını, kılcal tüp uzatma plakaları üzerindeki referans çizgilerinin altından kesin.

Kılcal boru uçlarını bir büyüteçle kontrol ettiğinizden emin olun. Kılcal boru uçları pürüzsüz değilse, cleven taşı kullanarak onları parlatın. Apertür o-ringini, apertür mavi deliğine yerleştirin.

Ve o-ring yerleştirme aracını kullanarak dikkatlice yerleştirin. Son olarak, suyla doldurulmuş CE viallerini kartuş kasasına yerleştirin, ardından kılcal uçları viallerin içine girecek şekilde kartuşu hemen kasanın içine yerleştirin ve soğutmalı ortamda saklayın. Pipet hacmini ayarlayın.

A1, B1 ve F6 tepsi koordinatlarındaki tampon girişine uygun hacimde su ekleyin. Ayrıca A1, B1, C1, E6 ve F6 tampon çıkış tepsi koordinatlarına da su ekleyin. C1 ve E6 tampon giriş tepsi koordinatlarına 0.1 normal HCl ekleyin. D1 ve E6 tampon giriş tepsi koordinatlarına ve D1 tampon çıkış tepsi koordinatına BGE ekleyin. Son olarak, tampon giriş ve çıkış tepsilerindeki tüm CE viallerinin kapaklarını kapatın. İşlem sırasında, karbon sızıntısını önlemek için vial kapaklarının ıslanmamasına dikkat edin. CE cihazının ön kapağını açın.

Öncelikle, UV dedektörünü takın ve vidayı saat yönünde çevirerek sabitleyin. İç kapağı kaldırın ve açma kollarını arayüz bloğuna yukarı doğru bastırarak yerleştirin. Fiber optik kabloyu sıkıştırıcıya yerleştirin ve saat yönünde çevirin.

Diğer ucu detektöre bağlayın. Bükülme kırılmaya neden olabileceği için fiber optik kabloyu dikkatli bir şekilde tutun. Numune tepsisini numune tutma sistemine yerleştirin ve yerine oturtun.

Aynı prosedür takip edilerek, tampon tepsileri numune tutma sistemine yerleştirin. Sıkıştırma çubuğunu kaldırın ve kapiler kartuşu arayüz bloğuna yerleştirin. Sıkıştırma çubuğuna her iki uçtan bastırın ve düğmeleri saat yönünde çevirerek sıkın.

İç kapıyı ve ardından ön kapıyı kapatın. Son olarak, güç düğmesine basarak CE cihazını açın. Kondisyon cihaz yöntemini oluşturun.

Voltaj, kartuş, numune saklama sıcaklığı ve tetikleme ayarları dahil olmak üzere başlangıç koşulları panelindeki parametreleri yapılandırın. Akvizisyon dalga boyu olarak iki bin on dördü seçin. Parametreleri zaman programlı hücrelere yapılandırarak cihaz tarafından gerçekleştirilecek işlemleri tanımlayın.

Her bir durulama, enjeksiyon ve ayırma adımı için spesifik ayarlar dahil edilmelidir. Kondisyonlama, çalıştırma ve cihazı kapatma yöntemlerini oluşturmak için bu prosedürü uygulayın. Bir sonraki adım yeni bir sekans oluşturmaktır.

Kondisyonlama yöntemini kullanarak kapiler için kondisyonlama programını oluşturun. Kapiler ilk kez kullanılıyorsa dört tekrarlama programlayın. Aksi takdirde, iki tekrarlama programlayın.

Ardından, analiz edilecek örnekleri çalışma yöntemini kullanarak programlayın. Son olarak, kılcal boruyu kapatma yöntemini kullanarak saklama için programlayın. Kılcal hücre elektroforezi analizi 30 dakika içinde tamamlanır.

İlk sonuç, sistem performansının yeterliliğinin bir ölçüsü olarak histamin iç standardına karşılık gelmektedir. Bunu, değerlendirilen monoklonal antikorun belirgin bazik, ana ve asidik izoformları takip etmektedir. Tüm ayırma işlemi yaklaşık 30 µA sabit akım altında gerçekleştirilir.

Deney tamamlandıktan sonra, ham verileri grab yazılımından dışa aktarın ve işleme tabi tutmak için empower yazılımı aracılığıyla içe aktarın. Her bir buz formunun yüzde içeriği, elektroferogram profilinin dikey hat entegrasyonu sonrasında elde edilir. Burada, kapiler hücre elektroforezi ile üretilen monoklonal aktivitelerin analizini gerçekleştirmek için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sunduk.

Potansiyel sorunları azaltmaya yönelik çeşitli önerilerin yanı sıra, mevcut protokol, iletkenlik ve pH parametrelerinde yapılacak kısa modifikasyonlarla diğer proteinlerin analizi için kolayca özelleştirilebilme avantajını sunmaktadır.