Name: 3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Keşfedin akciğer ekstraselüler matrisinden özelleştirilebilir hidrojeller üreterek 3D hücre kültürü yapmayı. Bu yöntem, sağlıklı ve patolojik koşullarda akciğer hücre-ECM etkileşimlerini incelemek için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz sağlam domuz akciğer dokusu bağış için Smithfield çiftlikleri teşekkür etmek istiyorum. Biz de bize kendi ekipman kullanmak için izin Dr. Hu Yang, Dr. Christina Tang ve VCU Plastik Cerrahi Bölümü&#39;ne teşekkür etmek istiyorum. Hidrojel ve doku örnekleri finansman formu NIH-NCI Kanser Merkezi Destek Grant, kısmen, NIH-NINDS Merkezi Çekirdek Grant 5 P30 NS047463 dan fon tarafından, kısmen desteklenen Anatomi ve Nörobiyoloji Mikroskopi Tesisi VCU Bölümü&#39;nde SEM için hazırlandı P30 CA016059. VCU Nanoteknoloji Çekirdek Karakterizasyonu Tesisi (KKK) numunelerin SEM görüntüleme. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı, CMMI 1351162 tarafından finanse edildi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Çözüm </td><td> Steril Filtresi </td><td> Yol </td></tr><tr><td> Dihidro 2 O </td><td> Evet </td><td> Dihidro 2 O; Steril süzüldü </td></tr><tr><td> % 0.1 Triton X-100 Çözüm </td><td> Evet </td><td> Davlumbaz altında dihidroksi 2 O 100 ml, 100 ul, Triton-X 100 çözüm ekleyin ve çözülene kadar ajite; steril filtre. </td></tr><tr><td> % 2 Deoksikolat Çözelti </td><td> Evet </td><td> davlumbaz altında 2 gr Sodyum Deoksikolat çözüm ekleyin 100 mi dihidro 2 O ve eriyinceye kadar ajitasyon başı; steril filtre </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> Evet </td><td> Dihidro 2 O 1 L 58.44 g NaCI ekleyin; çözülene kadar ajite; steril filtre </td></tr><tr><td> DNaz çözümü </td><td> Evet </td><td> 12,000 eklebirimleri DNaz 1 L DIH 2 O; 0.156 gr MgSO 4 ekleme (Susuz) ve 0.222 g CaCl2; çözülene kadar ajite; steril filtre </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Evet </td><td> , 27.2 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (dibazik heptahidrat) birleştirin 80 g NaCI ve 10 L dihidroksi 2 O 2 g KCI; çözülene kadar ajite; 7.4 pH ayarlamak; steril filtre </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Doku Decellularization için gerekli çözümler. decellularization işlemi için yukarıdaki çözümler olun. 4 ° C&#39;de saklayın. Yaklaşık 2.5 L bir domuz akciğer için gerekli olacaktır. 1. Hidrojel Oluşumu <ol><li> (Referanslar 9,10 uyarlanmıştır) Domuz Akciğer Decellularization <ol><li> Kalp ve Vasc ile, bir mezbahadan, bir bloğun en normal bir domuz akciğer eldeulature bozulmamış. </li><li> kalp mümkün olduğunca yakın damarsal kesim, kalbi uzak incelemek için doku makas veya neşter kullanın, kalan damar perfüzyon için daha sonraki adımlarda kullanılacaktır. </li><li> Dikkatli bir neşter veya makas kullanarak trakea, bronşlar ve damarsal çevreleyen bağ dokusu uzak teşrih. NOT: decellularization sürecinin etkinliğini engelleyebilir büyük kesikler veya delikler plevra yoluyla ve atelektazi veya damar tıkanıklığına büyük miktarlarda olmadan bir akciğer seçerek prosedürün geri kalanı için kullanılacak en iyi akciğer belirleyin. </li><li> (Atılabilir kalp, bağ dokusu ve kaldırılan akciğer lobları) mümkün olduğunca trakea bağlı olduğu kadar bronşu bırakarak bırakıyorsa akciğer kesip. tek akciğer trakea ve damarsal bağlı kalan olmalıdır. NOT: İsterseniz histoloji için bölümleri saklayın. 9 </li><li> p kelepçeler veya sütür ile bağlantısız bronşlar kapatınRevent fazla geri tepme. </li></ol><ol start="6"><li> (Tablo 1), gerekli olana kadar, 4 ° C de decellularization çözümleri ve buzdolabında hazırlayın. </li><li> , Pulmoner arter uyum pulmoner arter ve trakea hem aracılığıyla akciğer dokusunda DI suyla 3 kez serpmek için kanüle bir el pompası kullanılarak. ilk her seferinde damarsal serpmek. damar sistemine yaklaşık 1 L ve her perfüzyon için trakea içine 1.5 L ile başlayın, ama hücresel enkaz kaldırıldıktan olarak daha likit sistemi ile perfüze edilebilir. </li><li> Triton X-100 çözeltisi, her iki damar ve trakea serpmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 24 saat boyunca, Triton X-100 çözeltisi akciğer dokusu daldırın. </li><li> DI su ile perfuse damarsal ve trakea 3 kez durulayın. </li><li> deoksikolat çözeltisi ile iki damar ve trakea serpmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 24 saat boyunca deoksikolat doku bölümleri daldırın. </li><li> DI su ile perfuse damarsal ve trakea 3 kez durulayın. </li><li>NaCl çözeltisi ile iki damar ve trakea serpmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca, filtre NaCI çözeltisi doku daldırın. </li><li> DI su ile perfuse damarsal ve trakea 3 kez durulayın. </li><li> DNaz çözeltisi ile iki damar ve trakea serpmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca, filtre DNase solüsyon içerisinde dokuyu daldırın. </li><li> damar ve trakea 5 kez PBS ile iki serpmek. </li><li> fark kıkırdaklı dokuyu, trakea ve sadece solunum bölgeleri (öncelikle periferal alanlar) bırakarak, solunum yollarını yapmasına (öncelikle hilusun ve akciğerlerin medial kısımları çevresinde bulunan) çapında tüm tübüller 2 mm veya daha büyük parçalara ayır. </li><li> 1 inç bölümleri veya daha küçük içine doku teşrih. doku Oryantasyon Bu aşama için önemli değil. </li><li> 50 ml konik tüpler aşırı sıvı ve yer dokusu dökün. -80 ° C&#39;de doku dondurun. Not: histolojik hücre ve hücre debri çıkarılmasını sağlamak için bölümler saklayıns, arzu edildiği takdirde. Biz H &amp; E kullanımı, α-galaktosidaz, Picogreen, hidroksiprolin, ninhidrin, alcian blue, SDS-PAGE ve kütle spektrometresi karakterize etmek. 9 </li></ol></li><li> akciğer İşleme <ol><li> Decellularized akciğer dokusu içeren dondurulmuş tüplerin kapaklarını çıkarın. </li><li> Tüp deliğinin üzerine filtre kağıdı yerleştirin ve lastik bant ile sabitleyin. NOT: Tüp ve içeriği hala donmuş kadar aksi -80 ° C yerleştirmek dondurulmuş olmalıdır. </li><li> Tüm aşırı sıvı üretici talimatlarına göre bir dondurma kurutma kullanılarak, bitene kadar doku liyofilize. değirmen hazır olana kadar -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> çalışma koşullarına yalıtımı ve iç bileşenlerin soğutulması için dondurucu değirmene sıvı azot eklemek başlamadan önce. </li><li> değirmen tüpten manyetik değirmen çubuğunu çıkarın ve alt kapak doku ekleyin. </li><li> değirmen çubuğunu değiştirin ve gevşek paketlenmiş doku ekleyin. değirmen bar hala serbestçe hareket etmelidir. </li><li> değirmen tüpü ve pla kapatındondurucu değirmende ce. </li><li> maksimum doldurma çizgisine kadar sıvı azot doldurun. </li><li> Dondurucu değirmen ince toz haline tüm doku (yaklaşık 5 dakika, ~ 600 dakika çarpma hızı -1) bir paslanmaz çelik bir çarpma polikarbonat silindir hem de üretici talimatlarına göre dondurucu değirmen kullanılarak, paslanmaz çelik uç fişler. Kullanıma hazır olana kadar -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Mikro-gözenekli bir jel formasyonu (8 mg / ml) (referans uyarlanmıştır 9,11) <ol><li> % 1 ekleyin (a / h) hücresizleştirilmiş tozu ve% 0.1 (ağırlık / hacim), 0.01 M HCI pepsin sürekli ajitasyon altında, oda sıcaklığında, (sıvı üst düzeyde akış görmek gerekir) 48 saat. NOT: Toz statik toz tüp duvarlardan aşırı yıkamak için fırsat tanıyor sonra çok HCl ekleyerek tahsil edilir. </li><li> 48 saat boyunca sindirimden sonra, 5 dakika boyunca buz üzerinde solüsyonu ve reaktifleri. </li><li> Sıcaklık 10 olarak% (h / h), 0.1 M NaOH, birD 11.11% (h / h) 10 x PBS, 7.4 fizyolojik pH sindirilmiş protein çözeltisi getirmek (konsantrasyon 1x tüm çözüm getirmek için). NOT: Çözelti hemen bir haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. Istenirse reometre 9 kullanarak jelleşme kinetik gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> 2. Mekanik Gücü Artırmak İçin hidrojellerin Çapraz bağlama <ol><li> 1,% 0.1 ve% v genipin çapraz bağlama çözeltisi w /% 0.01 solüsyonları,% 10 DMSO içinde genipin tozun gerekli miktarda çözülmesiyle hazırlanmıştır. </li><li> 1 saat çözüme her 15 dakika karıştırın. </li><li> Daha önce kısmen 1.3.4 monte edilmiştir ECM hidrojeller (96 çukurlu bir levhanın her bölmesine 100 ul) kapsayacak şekilde genipin solüsyonu ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca çapraz bağlanması için her ECM hidrojel bırakın. </li><li> yıkama solüsyonu artık mavi olana kadar ECM hidrojel PBS ile 3 kez durulayın. çapraz hidrojeller daha sonra karakterizasyon ve ce için hazır olacakll kültürü çalışmaları. </li></ol> Mikro Jel ile 3. Hücre Kültürü <ol><li> İki boyutlu kaplama <ol><li> 1.3.3 solüsyonun kullanılarak, 96 çukurlu bir muamele edilmemiş doku kültür plakasının her bir oyuğuna PREGEL çözeltisinin 20 ul ekle. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece buzdolabında protein adsorpsiyon plaka izin vermek. </li><li> Aspire Pregel çözümü ve PBS ile durulayın. </li><li> Geçiş hücre, 9. </li><li> Kuyulara 10.000 hücre / cm 2 ekleyin. </li><li> oyuk başına 100 ul ortam artırmak ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Üç boyutlu hücre kültürü 9 <ol><li> 1.3.3 solüsyonun kullanarak, PREGEL çözeltisi 1.000.000 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar pelet hücreleri yeniden süspanse edin. </li><li> Hızlı 3D hücre kültürü için ~ 500 um kalınlığında bir hidrojel oluşturmak üzere, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna PREGEL hücre süspansiyonu 16 ul dağıtmak. </li><li> 30 dakika süre ile 37 ° C&#39;de inkübe edinjel dakika oluşturulması için. </li><li> oluşturulan hidroj en medya 100 ul ilave edin ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Değişken sertlik jeller Üç boyutlu hücre kültürü <ol><li> 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna pipetle, 1.3.3 gelen PREGEL çözeltisi 100 ul çözelti kullanılması. </li><li> Jel oluşturmak için 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Not: Burada kullanılan kısmı 2 adım Çapraz bağlama. </li><li> Geçiş hücre, 9. </li><li> Kuyulara 10.000 hücre / cm 2 ekleyin. </li><li> oyuk başına 100 ul ortam artırmak ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+J+%22Three-Dimensional+Cell+Culture+Matrices%3A+State+of+the+Art%22">Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art</a>. 14, (2008).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaycock%2C+JW+%223D+Cell+Culture%22">3D Cell Culture</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Walker, J. M., Ed, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22Epithelial+cell+culture+protocols%22">Epithelial cell culture protocols</a>. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).</li>
<li>Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+as+a+biological+scaffold+material%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function.</a> Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+evaluation+of+gardenia+extract%2C+geniposide+and+genipin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin.</a> J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).</li>
<li>Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+Material+Properties+of+Cardiac+Matrix+Hydrogels+to+Induce+Endothelial+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).</li>
<li>Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+bone+regeneration+using+porcine+small+intestinal+submucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa.</a> J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).</li>
<li>Brown, B. N., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+functional+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Res.+J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction.</a> Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).</li>
<li>Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPouliot%2C+RA+%22J.Biomed.Mater.Res.A%22">J.Biomed.Mater.Res.A</a>. , (2016).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).</li>
<li>Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+rheological+characterization+of+a+gel+form+of+the+porcine+urinary+bladder+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix.</a> Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).</li>
<li>Tilghman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+rigidity+regulates+cancer+cell+growth+and+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype.</a> PloS One. 5 (9), e12905(2010).</li>
<li>Ratner, B. D., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials%3A+where+we+have+been+and+where+we+are+going%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomaterials: where we have been and where we are going.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).</li>
<li>Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+initiation+and+growth+of+tumor+cell+lines%2C+cancer+stem+cells+and+biopsy+material+in+mice+using+basement+membrane+matrix+protein+%28Cultrex+or+Matrigel%29+co-injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).</li>
<li>Zhang, W. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstruction+of+lung+alveolus-like+structure+in+collagen-matrigel%2Fmicrocapsules+scaffolds+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+Normal+and+Fibrotic+Human+Lung+Matrices+as+a+Culture+System+for+In+Vitro+Investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).</li>
<li>Matsuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+human+lung+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for human lung stem cells.</a> N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).</li>
<li>Zuo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63%2BKrt5%2B+distal+airway+stem+cells+are+essential+for+lung+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration.</a> Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).</li>
<li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li>
<li>Neill, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

biyoloji ayrılmaz yönlerinden biri belirli bir görevi gerçekleştirmek hiyerarşik yapıların içine moleküllerin öz-örgütlenme olduğunu. Laboratuarda 13, kendinden montaj gibi tuz konsantrasyonu, pH ve sindirim süresi gibi pek çok faktöre bağlıdır. Gösterildiği gibi, bir kendi kendini düzenleyen hidrojel çözünür proteinler fizyolojik sıcaklığında tekrar. Oluşan hidrojel in vitro hücresel yapışma ve canlılık geliştirme kapasitesine sahiptir. ECM&#39;den biyofiziksel sinyaller...

in vitro sonuçların kliniğe çevrilmesi, biyomedikal araştırmacıların karşılaştığı en zorlu konulardan biridir. Doku kültürü plastiği üzerine in vitro araştırmalar daha kolay, daha kullanışlıdır ve yüksek hücre canlılığını korur. 1 Bu yaklaşım makul bir başlangıç noktasıdır, ancak sonuçlar sınırlı klinik çeviriye sahiptir. Giderek artan bir şekilde, laboratuvarlar geleneksel iki boyutlu yöntemlerin yerini almak için üç boyutlu yapıları birleştiriyor. Biyolojik iskelelerden polimerik iskelelere kadar birçok üç boyutlu ortam için incelemeler mevcuttur. 2,3
Biyolojik çerçeveler, doğal matrisin birçok protein ve glikozaminoglikan bileşenini içerdikleri ve hücrelerin bağlanması ve tanıması için tanıdık bağlanma bölgeleri sağladıkları için in vivo ortamların özelliklerini taklit edebilir. Hücre dışı matriks (ECM) türevi materyallerin, hücre bağlanması ve çoğalması için yetenekli iskeleler olduğu gösterilmiştir. 4 ECM hidrojel platformlarının uygulanmasını sınırlayan bir zorluk, jelleşmeyi takiben doğası gereği zayıf mekanik özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Doğal doku genellikle hidrojellerden daha yüksek büyüklükte mekanik özelliklere sahiptir. Toksik olmayan çapraz bağlama maddeleri, doğal doku ortamını daha iyi taklit etmek için hidrojellerin mekanik özelliklerini artırabilir. Genipin, Gardenya bitkilerinden elde edilen, ECM'nin mekanik özelliklerini genipin konsantrasyonundaki değişikliklerle yakından uyarlama yeteneğine sahip, toksik olmayan, doğal bir çapraz bağlayıcıdır5,6. 
Vücuttaki hemen hemen tüm hücreler, ürettikleri ya da sürdürdükleri ECM'de bulunur ve bu ECM üzerinde organize olurlar. ECM'nin her organ veya sistemdeki organizasyon, durum ve işlevdeki evrensel önemine yeni odaklanma, in vitro araştırma için matris tabanlı platformların üretimini ateşledi. Domuz ince bağırsak submukozası, en kapsamlı olarak çalışılan doğal olarak türetilmiş iskeledir ve tendonları, bağları, iskelet kasını4 ve hatta kemik7'yi yenilemek için kullanılmıştır. Diğer organlardan ve donör türlerden elde edilen matrisler de iyi doku rejenerasyon potansiyeli göstermiştir. Yabancı ECM bileşenlerinin kullanımı, immünomodülasyon ile ilgili minimum sorunlara neden olur. Konak hücresel maddenin eliminasyonundan sonra, kalan ECM, amino asit içeriği ve organizasyonu açısından diğer tüm memeli türlerinebenzer olacaktır 8. Hücre-ECM etkileşimlerini in vitro olarak incelemenin en iyi yolunun organa özgü ECM iskelelerini kullanmak olduğuna dair artan bir düşünce çizgisi var. Her organ, hücresel nişler oluşturmak için benzersiz bir protein ve proteoglikan bileşimi sağlar. Nişler, biyofiziksel sinyalleşmeye katkıda bulunan hücre dışı matrisin yapısal, işlevsel ve hatta enzimatik parçalanmasını sağlar. İn vivo mikroçevreye en çok benzeyen bir in vitro mikroçevre elde etmek için, dokuya özgü ECM'nin kullanılması, araştırma için hücresel nişleri optimize edecektir. 
Bu protokolün amacı, akciğer ECM'sine özgü bir hidrojel iskelesi kurmak için bir yöntem sağlamaktır. Bu yöntem, akciğer hücresi-ECM etkileşimleri üzerine in vitro araştırmalar için bir platform sağlar.

<table><tbody><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Çeker ocakta göz koruması ve eldiven ile kullanın.</td></tr><tr><td>Sodyum Deoksikolat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100g</td><td>Göz koruması ve eldiven ile kapüşonda kullanın.</td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506-500g</td><td>Yok</td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-500g</td><td>Yok</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td>Yok</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td>Göz koruması ve eldivenle kullanın.</td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td>Çeker ocakta göz koruması ve eldivenle kullanın.</td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td>Göz koruması ve eldivenlerle kullanın.</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Wako Chemicals</td><td>078-03021</td><td>Çeker ocakta göz koruması ve eldivenle kullanın.</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>119-069-151</td><td>Yok</td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-448</td><td>Yok</td></tr><tr><td>Filtre Kağıdı</td><td>Whatman</td><td>8519</td><td>N/A</td></tr><tr><td>El pompası</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-239-1</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mezun Beher</td><td>VitLab</td><td>445941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cryomill</td><td>SPEX</td><td>6700</td><td>Kriyoeldiven ve göz kullanın koruma.</td></tr><tr><td>Liyofilizatör</td><td>FTS FlexiDry</td><td></td><td>Eldiven kullanın.</td></tr><tr><td>Reometre</td><td>Keşfi</td><td>HR-2</td><td>Eldiven ve göz koruması kullanın.</td></tr></tbody></table>

3d hücre kültürü için pulmoner ekstrasellüler matrix ayarlanabilir hidrojellerinin

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Burada, in vitro akciğer hücre kültürü için çok bileşenli hücre kültürü hidrojeller oluşturulması için bir yöntem sunulmaktadır. Domuz, sıçan veya fare bloğun akciğer dokusunda en sağlıklı ile başlayarak, doku perfüze selüler artığın ayrılması için, daha sonraki kimyasal deterjanlar içinde kalmasını sağlar. işlem öncesi ve sonrası dokunun histolojik karşılaştırma çift sarmallı DNA ve alfa galaktosidaz boyama% 95&#39;in üzerinde kaldırılmasını teyit hücresel enkaz çoğunluğu kaldırılır göstermektedir. Decellularization sonra, doku liyofılize edildi ve sonra toz haline cryomilled olup. Matris toz, bir asidik pepsin sindirim çözeltisi içinde 48 saat boyunca sindirilir ve daha sonra PREGEL çözelti oluşturmak için nötralize edilir. PREGEL çözeltisinin jelasyon, 37 ° C&#39;de inkübe edilerek uyarılabilir ve hemen ardından nötralizasyon kullanılabilir veya iki haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. Kaplama C için muamele edilmemiş plaka PREGEL çözeltisi kullanılarak oluşturulabilirarşın eki. Hücreler, hücreleri iskele boyunca göç veya kaplamalar üzerinde kaplama sağlayan bir oluşturulmuş jelin yüzeyi üzerine kaplanmış, bir 3D kültür elde etmek için kendiliğinden montaj öncesinde PREGEL, içinde süspanse edilebilir. stratejiye değişiklikler jelasyon sıcaklığının, kuvvet ya da protein parçası boyutları etkileyebilir sunulmaktadır. hidrojel oluşumu ötesinde, hidrojel sertlik genipin kullanılarak arttırılabilir.

Bu yöntem kullanılarak, normal domuz, sıçan ve fare akciğer (Şekil 1) gelen hidrojeller üretmişlerdir. İşlenmiş akciğerler bir sırası ile, 5 mg, 40 mg ve ECM tozun 10 g tahmin sağlar. Işlemin bir genel görünüşü Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. sürecinde kilit görselleştirme şunlardır: deoksikolat durulama sonra akciğerlerin beyaz bir görünüm; PREGEL oluşumundan sonra, çözelti, opak olmalı ve 4 ° C&#39;de muhafaza edildiğinde çözelti ay homojen görünmelidi...

Bu akciğer hücre dışı matristen 3 boyutlu hücre kültürü iskele oluşturmak için bir yöntemdir. Bozulmamış akciğer üç boyutlu hücrelerin büyümesini destekleyen hidrojeller olarak işlenir.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Özelleştirilmiş hidrojeller oluşturmaya yönelik bu yöntemin genel amacı, akciğer hücre dışı matrisinin karmaşıklığını taklit eden hücreleri ve kültür koşullarını incelemektir. Bu yöntem, akciğer hücrelerinin sağlıklı ve patolojik koşullar altında ECM ile nasıl etkileşime girdiği gibi pulmoner alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, akciğer ECM hidrojellerinin 2D veya 3D kültürdeki uygulamanıza göre ayarlanabilir olmasıdır.Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler, deselülarizasyon tekniklerinin karmaşıklığı nedeniyle zorluk yaşayacaklardır; canlı doku miktarını optimize etmek için bazen birden fazla kişi ve ayrıntılara dikkat edilmesi gerekebilir. Bu protokol için, deselülarizasyona hazır bir porcine akciğer bulundurun. Hazırlanışına ilişkin detaylar metin protokolünde yer almaktadır.Akciğer hazırlandıktan sonra, pulmoner artere uygun kanüle edilmiş bir el pompası kullanın. Öncelikle, damar sistemine yaklaşık bir litre sule perfüzyon uygulayın ve ardından trakeaya 1,5 litre su verin. Hücresel döküntüler temizlendikçe, perfüze edilen su hacmini artırarak bu işlemi üç kez tekrarlayın.Ardından, yine el pompası kullanarak dokuyu Triton X-100 ile perfüze edin. Daha sonra dokuyu, 4 °C'deki Triton X-100 çözeltisi içeren bir banyoya 24 saat boyunca daldırın. 24 saat sonra, vaskülatürü ve trakeyi distile su ile üç kez durulayın.Durulama işlemlerinden sonra, dokuyu deoksikolat ile perfüze etmek için el pompasını kullanın. Ardından dokuyu, 4 °C'de 24 saat boyunca deoksikolat içerisinde bekletin. Ertesi gün, dokuyu daha önce yaptığınız gibi üç kez distile su ile durulayın.Durulama işlemlerinden sonra, dokuyu filtrelenmiş sodyum klorür ile perfüze etmek için el pompasını kullanın. Ardından dokuyu, dört santigrat derecede bir saat boyunca filtrelenmiş sodyum klorür içinde bekletin. Banyo işleminden sonra, durulamak için damar sistemini ve trakeayı üç kez distile su ile perfüze edin.Durulama işlemlerinden sonra, dokuyu DNase çözeltisi ile perfüze edin ve ardından dört derece santigrat sıcaklıkta bir saat boyunca DNase çözeltisi içinde bekletin. Bir saat sonra, su yerine PBS kullanarak damar sistemini ve trakeayı beş kez perfüze edin. Şimdi, yalnızca opak beyaz dokuyu kullanarak, çapı iki milimetre veya daha büyük olan tüm tübülleri diseke ederek uzaklaştırın.Bunlar öncelikle hilum ve akciğerlerin medial kısımlarında bulunurlar. Çoğunlukla periferide yer alan solunum bölgelerini bozulmadan bırakın. Tübülleri çıkardıktan sonra, dokuyu bir inçlik veya daha küçük bölümlere ayırarak disseke edin.Bu blokların yönelimi önemli değildir. Doku blokları süzüldükten sonra, bunları 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 80 °C'de dondurun. Hücrelerin ve kalıntıların uzaklaştırıldığını doğrulamak amacıyla birkaç blok histoloji için ayrılabilir.Akciğer dokusunu deselülerize toz haline getirmek için, dondurulmuş doku tüpünün kapağını bir filtre kağıdı ile değiştirin ve bunu bir lastik bantla sabitleyin. Ardından, üretici talimatlarına uygun olarak bir liyofilizatör kullanarak tüm fazla sıvı gidene kadar dokuyu liyofilize edin. Daha sonra dokuyu, öğütülene kadar -80 °C'de saklayın.Değirmeni hazırlamak için, önce değirmen tüpü için yer bırakarak cihazı sıvı azot ile doldurun. Ardından, değirmen tüpünden manyetik değirmen çubuğunu çıkarın ve tüpün tabanını doku ile kaplayın. Daha sonra, değirmen çubuğunu tekrar yerleştirin ve tüpü doldurmak için üzerine daha fazla dokuyu gevşekçe ekleyin.Ardından, öğütme tüpünü kapatın, dondurucuya/öğütücüye yerleştirin ve öğütücüyü maksimum kapasiteye kadar sıvı azot ile doldurun. Şimdi, öğütme işlemini yaklaşık 600/dakika darbe hızında yaklaşık beş dakika boyunca gerçekleştirin. Daha sonra, hücresizleştirilmiş tozu ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın.Pre-jel materyalini hazırlamak için, konik bir tüpe deselülarize doku tozu ve pepsin ekleyin. Ardından, nihai konsantrasyonu %1 deselülarize doku tozu ve %0,01 pepsin olacak şekilde tüpe 0,01 molar hidroklorik asit ekleyin. Dokuların sindirilmesi için bu çözeltiyi oda sıcaklığında 48 saat boyunca sürekli karıştırmaya bırakın.48 saat sonra, solüsyonu beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Ardından, soğuk 0,1 molar sodyum hidroksit kullanarak solüsyonun pH değerini 7,4'e ayarlayın ve 10X PBS ekleyerek solüsyonun PBS konsantrasyonunu 1X'e getirin. Pre-jel sürelerini ve pH değerini değiştirme konusunda deneyimimiz bulunmaktadır.Kullanılabilecek aralıkta bir miktar esneklik olsa da, prosedürde yapılacak küçük değişiklikler özelliklerin önemli ölçüde değişmesine neden olabilir. Çözelti ön-jel olarak kabul edilmez ve hücrelerin üzerinde büyüyeceği hidrojeller oluşturmak için işlem görmemiş plakaları kaplamak amacıyla, hücrelerin içinde büyüyeceği hidrojeller oluşturmak için veya hidrojellerin sertliğini artırmak amacıyla hidrojel oluşumundan önce modifiye edilmek üzere kullanılabilir. Hücreleri iki boyutlu mikro gözenekli jel kaplama üzerinde kültüre etmek için, işlem görmemiş 96 kuyucuklu bir doku kültürü plağının kuyucuklarına 20 µL ön-jel çözeltisi ekleyin.Ardından, proteinlerin plakaya absorbe olması için plakayı dört derece Celsius'ta gece boyunca soğutun. Ertesi gün, pre-jel solüsyonunu aspire edin ve kuyucukları PBS ile durulayın. Daha sonra, her kuyucuğa 3.200 hücre ekleyin ve her kuyucuktaki medya hacmini 100 microliter'e tamamlayın.Plakalar daha sonra inkübe edilebilir. Mikro gözenekli jel içerisinde hücrelerin bulunduğu üç boyutlu bir hücre kültürü için, ilgili hücreleri ön-jel solüsyonunda mililitre başına bir milyon olacak şekilde yeniden süspanse edin. Ardından, yaklaşık 500 mikron kalınlığında bir 3D hücre kültürü oluşturmak için, hücre süspansiyonundan 16 mikrolitreyi 96 kuyucuklu bir plağın her bir kuyucuğuna hızlıca dağıtın.37 °C'de inkübe edildikten sonra jel 30 dakika içinde oluşacaktır. Jeller oluştuktan sonra, kuyucuklara 100 µL işaretine kadar ortam ekleyin. Mikro gözenekli jel üzerinde hücrelerin bulunduğu üç boyutlu bir hücre kültürü için, ön-jel çözeltisinden 100 µL'yi işlem görmemiş bir 96 kuyucuklu plakanın kuyucuklarına ekleyin.Ardından, jelleşme için plakayı 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Jeller oluştuktan sonra, hidrojellerin üzerine 100 µL ortamda 3.200 hücre ekleyin ve plağı inkübe etmeye devam edin. Hidrojeller, tanımlanan yöntem kullanılarak normal domuz, sıçan ve fare akciğerlerinden üretilmiştir.Reolojik testler, jelleşmenin %90'ından fazlasının 37 °C'ye ulaşıldıktan sonraki ilk dakikalarda gerçekleştiğini doğrulamıştır. Oluşan hidrojeller PBS içinde uzun süreler boyunca stabildir, ancak hücre yapışması ve proliferasyonu zamanla değişebilir. Hücre yapışmasını artırmak için ön-jel solüsyonu bir kaplama olarak test edilmiştir.İnsan göbek kordonu ven endotel hücresi tutunması ve proliferasyonu bir MTTSA kullanılarak ölçülmüştür. Kuyucukların ECM ile kaplanmasıyla iyileşmeler gözlemlenmiştir. 3D jellerin hazırlanmasında, Genipin eklenmesi hidrojel çapraz bağlanmasını artırmıştır.Bir reometrede frekans taramaları kullanılarak, hidrojel sertliğinin Genipin konsantrasyonu ile doğrudan korele olduğu belirlenmiş olup, medyan ve en ilgili konsantrasyon %0,01 olarak saptanmıştır. Daha sert jeller test edildiğinde, artmış çapraz bağlanmaya sahip jellerde hücre proliferasyonunun MTTSA ile daha yüksek olduğu ölçülmüştür. Yöntem optimize edildiğinde, deselülerizasyon dört gün boyunca günde sekiz saatte gerçekleştirilebilir. Pre-jel çözeltisi iki gün boyunca günde bir saatte hazırlanabilir ve jel oluşumu iki gün boyunca günde iki saatte tamamlanabilir.Bu prosedürün ardından, elastik modül, protein kompozisyonu ve materyale verilen hücresel yanıt gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla AFM, western blot, boyama ve immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

tunable-hydrogels-from-pulmonary-extracellular-matrix-for-3d-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hızlı, düzenli hücre kültürü yüzeylerde dinamik maske projeksiyon litografi için bir dijital micromirror cihaz kullanarak microfabricated sinir kültür sistemleri üretimi için basit teknikleri açıklanmıştır. Bu kültür sistemleri doğal biyolojik mimarisi daha iyi temsil olabilir, ve açıklanan teknikleri çok çeşitli uygulamalar için adapte olabilir.

Dinamik Maske Projeksiyon Fotolitografi kullanarak Sinir Kültür Sistemleri Micropatterned Hidrojeller Fabrikasyon

Mikro desenli hidrojel levhaların üretimini, bağımsız bir biçimde monte edilebilen ve manipüle edilebilen basit bir işlem kullanarak açıklıyoruz. Bu modüler hidrojel tabakalar kullanılarak, kontrollü bir hücresel mikro çevre ile basit bir makro ölçekli 3D hücre kültürü sistemi oluşturulabilir.

Micropatterned Makro ölçekli 3D Hücresel Mimarlık Modüler Hidrojel Levhaların İnşaatı

Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme gerçek zamanlı hücre biyolojisi çalışmaları için güçlü bir araçtır. Burada alışılmış epifloresans mikroskopi kullanılarak fizyolojik üç boyutlu (3D) bir hidrojel mikro çevrelerinde FRET görüntüleme hücreleri için bir yöntem sunulmaktadır. Aktivasyon aralığında doğrusal oranlarını verir oranlı metrik FRET probları için bir analiz anlatılmıştır.

Üç boyutlu Hidrojeller içinde Görüntüleme FRET

Protein bazlı hydrogels üç boyutlu mimarisinde işlemek için farklı yöntemler burada malzeme özellikleri ile ilgili olarak değerlendirilir. Macroporous ağlar ile bir hücre yapışkanlı peptid functionalized ve onların fizibilite hücre kültüründe iki farklı model hücre hatları kullanılarak hesaplandı.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Bu iletişim kuralı elastik 3D macroporous microcryogels imalatı microfabrication cryogelation teknolojisi ile entegre ederek açıklar. Hücrelerle yükleme üzerine, 3D microtissues, hangi rejeneratif terapi kolaylaştırmak için kolayca enjekte içinde vivo olabilir veya diziler vitro yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için içine monte oluşturulur.

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

Geçerli bilayer kültür modelleri içinde vivo microenvironments taklit fonksiyonel vitro çalışmalar için izin vermez. Polietilen glikol ve çinko oksit şablon oluşturma yöntemi kullanarak, bu iletişim kuralını geliştirme, bir ultrathin biomimetic membran tunable sertlik, porozite ve yakından vivo içinde taklit eden biyokimyasal kompozisyonu ile açıklanır hücre dışı matrisler.

Kültür Ultrathin Porated elastik Hydrogels bir Biomimetic membran için çift olarak hücre

Polimer omurga ve bu nedenle, hücre microenvironment tam ayar için izin olarak Rekombinant protein mühendislik hydrogels 3D hücre kültürü için avantajlı olan. Burada, rekombinant elastin benzeri protein arıtma süreci ve kendi uygulamasında 3D hidrojel hücre kapsülleme açıklanmaktadır.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Biz bir bioprintable aljinat/jelatin bioink gömülü ölümsüzleştirdi tümör ve fibroblast hücreleri içeren türdeş olmayan meme kanseri modeli geliştirilmiştir. Model vivo içinde tümör microenvironment recapitulates ve çok hücreli tümör pulcuklarının, kavrama tumorigenesis sürüş mekanizmaları içine verimli oluşumunu kolaylaştırır.

Bioprintable aljinat/jelatin hidrojel 3D Vitro Model sistemleri hücre küresel oluşumu teşvik

Sunulan yöntem, canlı konfokal mikroskopiye izin verirken silikon kauçuğun içine gömülü 3D yumuşak hidrojellerin tek eksenli gerilmesini içerir. Dış ve iç hidrojel suşlarının karakterizasyonu ve fiber hizalaması gösterilmiştir. Geliştirilen cihaz ve protokol, hücrelerin çeşitli gerinim rejimlerine tepkisini değerlendirebilir.

Canlı Mikroskopi Görüntüleme Altında 3D Hidrojellerin Kontrollü Suşu

Bu protokol, mekanik ve biyokimyasal ipuçlarının, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip hidrojellerin yüksek verimli fotoçapraz bağlanmasını kolaylaştıran özel yapım bir UV aydınlatma cihazı kullanarak, 3D matris-mimetik kültürlerde hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerinin kemoterapötik yanıtları üzerindeki etkilerini değerlendirmek için deneysel bir platform tanımlamaktadır.

Hidrojel dizileri, 3D Tümör Modellerinde Matris Bileşenlerinin ve Terapötiklerin Tarama Etkileri için Artan Verim Sağlar

Bu makale, hücre dışı matris sertleşmesini ve fibroblast aktivasyonunu incelemek için fototize edilebilir hidrojellerin 3D biyo-baskısının nasıl yapılacağını açıklamaktadır.

Fibroblast Aktivasyonunu İncelemek için 3D Biyobaskı Fototable Hidrojeller

Keşfedin akciğer ekstraselüler matrisinden özelleştirilebilir hidrojeller üreterek 3D hücre kültürü yapmayı. Bu yöntem, sağlıklı ve patolojik koşullarda akciğer hücre-ECM etkileşimlerini incelemek için değerli bir araç sunar.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Daha fazla video keşfet