3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Özelleştirilmiş hidrojeller yapmak için bu yöntemin genel amacı, akciğer hücre dışı matrisin karmaşıklığını kopyalayan hücreleri ve kültür koşullarını incelemektir. Bu yöntem, akciğer hücrelerinin sağlıklı ve patolojik koşullar altında ECM ile nasıl etkileşime girdiği gibi pulmenary alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, akciğer ECM hidrojellerinin 2D veya 3D kültürdeki uygulamanıza göre uyarlanabilir olmasıdır.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, hücreden arındırma tekniklerinin karmaşıklığı nedeniyle mücadele edecek, bazen canlı doku miktarını optimize etmek için birden fazla kişi ve ayrıntılara dikkat gerektirecektir. Bu protokol için, hücrelerden arındırma için hazır bir domuz akciğeri bulundurun. Hazırlanması ile ilgili detaylar metin protokolünde bulunabilir.

Akciğer hazırlandıktan sonra, pulmoner artere uyacak şekilde kanüle edilmiş bir el pompası kullanın. İlk olarak, damar sistemine yaklaşık bir litre su verin ve ardından trakeaya 1,5 litre su verin. Bunu üç kez yapın, hücresel kalıntılar uzaklaştırılırken perfüze edilen su hacmini artırın.

Daha sonra, dokuyu Triton X-100 ile perfüze edin, ayrıca el pompasını kullanarak. Daha sonra, dokuyu 24 saat boyunca dört santigrat derecede bir Triton X-100 çözeltisi banyosuna batırın. 24 saat sonra, damar sistemini ve trakeayı damıtılmış su ile üç kez durulayın.

Durulamalardan sonra, dokuyu deoksikolat ile perfüze etmek için el pompasını kullanın. Ve sonra dokuyu dört santigrat derecede 24 saat boyunca deoksikolat içine daldırın. Ertesi gün, dokuyu daha önce olduğu gibi damıtılmış suyla üç kez durulayın.

Durulamalardan sonra, dokuyu filtrelenmiş sodyum klorür ile perfüze etmek için el pompasını kullanın. Daha sonra dokuyu dört santigrat derecede bir saat boyunca filtrelenmiş sodyum klorüre batırın. Banyodan sonra, durulamak için damar sistemini ve trakeayı damıtılmış su ile üç kez perfüze edin.

Durulamalardan sonra, dokuyu DNaz çözeltisi ile perfüze edin ve ardından dört santigrat derecede bir saat boyunca DNaz çözeltisine batırın. Bir saat sonra, damar sistemini ve trakeayı su değil PBS kullanarak beş kez perfüze edin. Şimdi, sadece opak beyaz doku kullanarak, çapı iki milimetre veya daha büyük olan tüm tübülleri inceleyin.

Öncelikle hilum ve akciğerlerin medial kısımlarında bulunurlar. Çoğunlukla periferde bulunan solunum bölgelerini sağlam bırakın. Tübülleri çıkardıktan sonra, dokuyu bir inçlik veya daha küçük bölümlere ayırın.

Bu blokların yönü önemli değildir. Doku bloklarını boşalttıktan sonra, 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 80 santigrat derecede dondurun. Hücrelerin ve döküntülerin uzaklaştırılmasını doğrulamak için histoloji için birkaç blok ayrılabilir.

Akciğer dokusunu hücreden arındırılmış toz haline getirmek için, donmuş doku tüpünün kapağını bir filtre kağıdı ile değiştirin ve bunu elastik bir bantla sabitleyin. Ardından, üreticinin talimatlarına göre bir dondurarak kurutucu kullanarak tüm fazla sıvı bitene kadar dokuyu liyofilize edin. Ardından, dokuyu öğütülene kadar 80 santigrat derecede saklayın.

Değirmeni hazırlamak için önce sıvı nitrojen ile doldurun ve değirmen borusu için yer bırakın. Ardından, değirmen borusundan manyetik değirmen çubuğunu çıkarın ve tüpün altını doku ile kaplayın. Ardından, değirmen çubuğunu değiştirin ve tüpü doldurmak için gevşek bir şekilde daha fazla doku ekleyin.

Ardından, değirmen borusunu kapatın, dondurucuya/değirmene yerleştirin ve değirmeni maksimum kapasitesine kadar sıvı nitrojen ile doldurun. Şimdi, değirmeni dakikada yaklaşık 600'lük bir çarpma hızıyla yaklaşık beş dakika çalıştırın. Ardından, hücreden arındırılmış tozu ihtiyaç duyulana kadar 80 santigrat derecede saklayın.

Ön jel malzemesini yapmak için, konik bir tüpe hücreden arındırılmış doku tozu ve pepsin ekleyin. Daha sonra, %1 hücreden arındırılmış doku tozu ve %0.01 pepsin nihai konsantrasyonu için tüpe 0.01 molar hidroklorik asit ekleyin. Dokuları sindirmek için bu çözeltiyi oda sıcaklığında 48 saat boyunca sürekli çalkalama altında tutun.

48 saat sonra, çözeltiyi beş dakika boyunca buza koyun. Şimdi soğuk 0.1 molar sodyum hidroksit kullanarak çözeltinin pH'ını 7.4'e ayarlayın ve ardından 10X PBS ekleyerek çözeltinin PBS konsantrasyonunu 1X'e getirin. Değiştirme süreleri ve ön jelin pH'ı konusunda biraz deneyimimiz var.

Kullanılabilecek aralıkta bir miktar esneklik vardır, ancak prosedür küçük şekillerde değiştirilirse özellikler önemli ölçüde değişebilir. Çözelti ön jel olarak kabul edilmez ve hücreler oluşturmak için hidrojeller oluşturmak, hücreler oluşturmak için hidrojeller oluşturmak üzere işlenmemiş plakaları kaplamak için kullanılabilir veya hidrojellerin sertliğini artırmak için hidrojeller oluşturmadan önce daha fazla modifiye edilebilir. Hücreleri iki boyutlu mikro gözenekli jel kaplama üzerinde kültürlemek için, 96 oyuklu işlem görmemiş bir doku kültürü plakasının kuyucuklarına 20 mikrolitre ön jel çözeltisi ekleyin.

Ardından, plakayı gece boyunca dört santigrat derecede soğutun, böylece proteinler plakaya emilir. Ertesi gün, ön jel çözeltisini aspire edin ve kuyuları PBS ile durulayın. Ardından, her bir oyuğa 3.200 hücre ekleyin ve her bir oyuktaki ortam hacmini 100 mikrolitreye yükseltin.

Plakalar daha sonra inkübe edilebilir. Mikro gözenekli jel içindeki hücrelere sahip üç boyutlu bir hücre kültürü için, ilgilenilen hücreleri ön jel çözeltisinde mililitrede bir milyon olarak yeniden süspanse edin. Daha sonra, yaklaşık 500 mikron kalınlığında bir 3D hücre kültürü oluşturmak için 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 16 mikrolitre hücre süspansiyonunu hızlı bir şekilde dağıtın.

Jel, 37 santigrat derecede inkübe edildikten sonra 30 dakika içinde oluşacaktır. Jeller oluştuktan sonra, 100 mikrolitre işaretlerine kadar kuyucuklara ortam ekleyin. Mikro gözenekli jelin üstünde hücreler bulunan üç boyutlu bir hücre kültürü için, 100 mikrolitre ön jel çözeltisini, işlenmemiş 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına ekleyin.

Ardından, jelleşme için plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Jeller oluştuktan sonra, hidrojellerin üzerine 100 mikrolitrelik ortamda 3.200 hücre ekleyin ve plakayı inkübe etmeye devam edin. Hidrojeller, tarif edilen yöntem kullanılarak normal domuz, sıçan ve fare akciğerlerinden üretildi.

Reolojik testler, jelleşmenin %90'ından fazlasının 37 santigrat dereceye ulaştıktan sonraki ilk dakikalarda meydana geldiğini doğruladı. Oluşan hidrojeller PBS'de uzun süreler boyunca stabildi, ancak hücre bağlanması ve çoğalması zamanla değişebilir. Ön jel çözeltisi, hücre bağlanmasını iyileştirmek için bir kodlama olarak test edildi.

İnsan umbilikal ven endotel hücresi bağlanması ve proliferasyonu MTTSA kullanılarak ölçüldü. Kuyuların ECM ile kaplanmasıyla iyileşmeler gözlemlendi. 3D jeller yaparken, Genipin eklemek hidrojel çapraz bağlanmasını arttırdı.

Bir reometre üzerinde frekans taramaları kullanılarak, hidrojel sertliği doğrudan Genipin konsantrasyonu ile ilişkilendirildi, medyan ve en ilgili konsantrasyon %0.01 idi. Daha sert jeller test edildiğinde, hücre proliferasyonunun, artan çapraz bağlanmaya sahip jeller üzerinde bir MTTSA ile daha yüksek olduğu ölçüldü. Bir kez ustalaştıktan sonra, hücreden arındırma dört gün boyunca sekiz saat içinde gerçekleştirilebilir. Ön jel çözeltisi iki gün boyunca bir saat içinde yapılabilir ve jel oluşumu iki gün içinde iki saat içinde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü takiben, elastik modül, protein bileşimi ve malzemeye hücresel yanıt gibi ek soruları yanıtlamak için AFM, western lekeleri, boyama ve immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir.