Deneysel Kolit sırasında Bağırsak epitel Bariyer Fonksiyonları Üzerine Ek Beslenme Faydalı Etkileri Analizi

Bu protokolün genel amacı, dekstran sülfat sodyumun neden olduğu bir fare kolit modelinde ek besinlerin etkilerini değerlendirmektir. Bu yöntem, bağırsak immünolojisi alanında, kolit modeli deneyinin yönü boyunca klinik bilimin gelişimi hakkında temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, düşük maliyetli olması, karmaşık ekipman gerektirmemesi ve tüm kolonun morfolojisinin net bir analizini sağlamasıdır.

Bu yöntem, aşırı nötrofil alımının bir sonucu olarak kolondaki oksidatif stresi değerlendirmek için kullanılabilir. Gavaj yoluyla besin takviyesi uygulaması için, önce fareyi tırnağından manuel olarak kısıtlayın, kuyruğu üçüncü parmak ile başparmağın tabanı arasına yerleştirin. Daha sonra, fareyi dik konumda tutarak, gavaj iğnesini hayvanın ağzının sol tarafına yerleştirin ve yemek borusunu bulmak için ağzın çatısını dikkatlice takip edin.

Herhangi bir dirençle karşılaşılmazsa, iğneyi mideye doğru ilerletin. Tüm takviye hacmini yavaşça verin, ardından şırıngayı dikkatlice çıkarın ve hayvanın vücut ağırlığını ölçün. Kilo kaybı yüzdesine göre sıfırdan dörde kadar bir puan atayın, ardından taze bir dışkı örneği alın ve sağlanan aplikatörleri kullanarak bir guaiac dışkıda gizli kan testi kitinden bir slayta ince bir örnek lekesi uygulayın.

Kitin ön tarafındaki kapağı kapatın ve numune konumunun arkasına iki damla geliştirici solüsyonu uygulamak için arka pencereyi açın. Sonuçları 30 saniye sonra okuyun ve sinyal gücüne bağlı olarak sıfırdan dörde kadar bir puan atayın. Ardından, dışkı kıvamını değerlendirmek için ikinci bir taze dışkı örneğini gözlemleyin ve uygun şekilde sıfır ila dört arasında bir puan atayın.

Bağırsak epitel geçirgenliğini in vivo olarak belirlemek için, anestezi uygulanmış bir hayvanı sırtüstü pozisyona getirin ve bağırsakları açığa çıkarmak için orta hat insizyonu yapın. Çekumu bulun ve kolon yükselenlerinin proksimal segmentinde küçük bir kesi yapın. Ardından 22 gauge bir besleme iğnesi yerleştirin ve iğneyi ortak bir ipek iplik ligatürü ile sabitleyin.

Kolondaki tüm dışkıyı durulamak için bol miktarda PBS'yi iğneden dikkatlice yıkayın, ardından boya anüse ulaşana kadar Evans mavisi çözeltisinin yerleştirilmesini izleyin. 15 dakika sonra, perianal yıkama temizlenene kadar tüpü fazla miktarda PBS ile yıkayın. Daha sonra kolonu eksize edin ve dokuyu daha fazla PBS ile durulayın, ardından kolon mukusuna yapışan herhangi bir boyayı ortadan kaldırmak için bir mililitre altı milimolar N-asetilsistein uygulayın.

Şimdi kolonu uzunlamasına kesin ve dokuyu PBS ve N-asetilsistein ile bir kez daha durulayın, ardından kolonun ağırlığını ve uzunluğunu kaydedin ve dokuyu oda sıcaklığında iki mililitre N, N-dimetilformamid içine yerleştirin ve kalan boyayı çıkarmak için hafif çalkalayın, boya konsantrasyonlarını ertesi sabah 610 nanometrede spektrofotometrik olarak ölçün. Yedi günlük dekstran sülfat sodyum veya DSS'nin neden olduğu kolitten sonra, tüm kolonu inceleyin ve uzunluğunu kaydedin. İsviçre ruloları için, kolonu uzunlamasına açın, dışkı maddesini dikkatlice çıkarın ve dokuyu mukoza içe bakacak şekilde yuvarlamak için ince, yuvarlak, tahta bir çubuk veya ince uçlu forseps kullanın.

Daha sonra dokuyu dikkatlice bir gömme kasetinin içine yerleştirin, ardından oda sıcaklığında beş mililitre% 10 formaldehit ile sabitleyin. Doku kesiti sırasında sorunları önlemek için kolonu katlanmadan sıkıca sarmak çok önemlidir, bu da klinik doku hasarına ve kolit ile ilişkili hasar olarak yanlış bir yorumlamaya neden olabilir. 48 saat sonra, numuneyi 18 saat boyunca musluk suyuyla yıkayın, ardından bir etanol serisi ile dehidrasyon yapın.

Son mutlak etanol daldırmasından sonra, dokuyu ksilen içinde dört adet bir saatlik inkübasyon ile tedavi edin. Son ksilen daldırmasından sonra, numuneyi bir 17 saatlik ve bir üç saatlik inkübasyon için 50 mililitre sıvı parafine yerleştirin. Üç saatlik inkübasyonun sonunda, numuneyi 24 saat boyunca sekiz ila 10 mililitre taze sıvı parafin içinde 22 milimetre küp kare plastik kalıba daldırın.

Parafin katılaştığında, beş mikron kalınlığında doku kesitleri elde etmek için bir mikrotom kullanın, daha sonra kesitleri kısaca %0.3 jelatin içeren bir litrelik su banyosuna daldırın ve numuneleri hemen H & E boyama için polilisin ile muamele edilmiş cam slaytlara monte edin. Oksidatif stres analizi için önce hidrofobik bir kalem kullanarak doku etrafında bir bariyer oluşturun. Daha sonra, karanlıkta 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca suda çözülmüş beş mikromolar DHE'de sekiz mikron doku kriyo kesitini inkübe edin.

İnkübasyonu takiben, oda sıcaklığında hafif çalkalama ile PBS'de 15 dakikalık üç yıkama yapılır. Numuneleri havayla kurutun ve floresansı korumak için bir damla montaj ortamı ekleyin. Ardından, 40x büyütmede bir lazer taramalı konfokal mikroskopta oksitlenmiş etidyum floresansını gözlemleyin.

DSS tedavisi, beklendiği gibi sürekli artan bir hastalık aktivite indeksine yol açar ve indüksiyondan sonraki yedinci günde maksimum puana ulaşır. Anti-enflamatuar diyet takviyesi, kolitin erken başlangıcını geciktirirken, koruyucu etkiler daha sonraki zaman noktalarında sadece marjinaldir. Diyet müdahalesi ayrıca bağırsak epitel geçirgenliğinde DSS'nin neden olduğu artışları ve ayrıca kolon uzunluğunun kısalmasını önleyebilir.

Parafine gömülü distal kolon dokularının hematoksilen ve eozin boyamaları, kontrol örneklerinin normal bir morfoloji gösterdiğini, DSS ile tedavi edilen hayvanların ise tipik kolit belirtileri gösterdiğini ortaya koymaktadır. Dikkat çekici bir şekilde, diyet takviyesi ile paralel tedavi, kontrol grubununkine benzer bir genel morfoloji ile kolitin neden olduğu morfolojik değişiklikleri açıkça hafifletir. Distal kolon dokusunun immünofloresan boyanması, DSS'nin neden olduğu kolit sırasında sıkı inadherens bağlantı moleküllerinin içselleştirildiğini ve bu proteinlerin ko-lokalizasyonunun kript epitel hücre temaslarında kısmen kaybolduğunu gösterir.

Daha da önemlisi, DSS ile tedavi edilen fareler anti-enflamatuar ve anti-oksidatif diyet takviyesi aldığında bu içselleştirme azalır. Ayrıca, DSS'nin neden olduğu kolite yanıt olarak kolona sağlam nötrofil alımı, diyet takviyesi ile önlenir, bu da nötrofil kaynaklı oksidatif stresin eşzamanlı olarak iyileştirilmesine ve inflamatuar sitokin üretiminde hafif bir azalmaya neden olur. Bu prosedürü takiben, kolondaki epitel bariyerinin elektriksel direncini analiz etmek için sızma odası ölçümleri gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, tekrarlanabilir bir fare modelinde ülseratif kolit patogenezinin moleküler mekanizmasını araştırmak ve kolit araştırmaları alanındaki araştırmacıların yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, kolit gelişiminin nasıl analiz edileceğini ve besin takviyelerinin bağırsak epitel bariyeri fonksiyonları üzerindeki yararlı etkilerini iyi bir şekilde anlamış olmalısınız. Canlı hayvanlarla çalışmanın, gereksiz acı çekmekten kaçınmak için yüksek etik standartlara bağlı kalmayı gerektirdiğini unutmayın.