Farelerde Aerobik Egzersiz ile Autophagy etkinleştirme

Bu deneyin genel amacı, zorunlu veya gönüllü koşu yoluyla farelerde otofajiyi fizyolojik olarak aktive etmek ve ardından belirli dokulardaki otofaji seviyelerini ölçmektir. Bu yöntem, otofaji hakkındaki temel soruların, özellikle de otofajinin ve hareketin aerobik egzersizin sağladığı faydalı etkilere nasıl katkıda olduğunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fiziksel egzersizin farelerde in vivo otofaji arasındaki hızlı bir aerobik geçiş olmasıdır.

Bu deney için, in vivo egzersizle tetiklenen otofajiyi tespit etmek amacıyla GFP-LC3 olarak bilinen bir transgen taşıyan, sekiz ila on iki haftalık C57 black six fareleri ile başlayın. Fare koşu bantlarının kullanımıyla ilgili ayrıntılar için şu JoVE yayınını inceleyin. Koşu bandının elektriksel uyarımını düşük yoğunluğa ayarlayın.

İlk iki oturumlarında, fareleri on derecelik eğimli açık bir koşu bandına alıştırın. Birinci günde, koşu bandını dakikada sekiz metre hızda çalıştırarak fareleri beş dakika boyunca egzersiz yaptırın. İkinci günde, fareleri başlangıçta dakikada sekiz metre hızla on dakika boyunca koşturun ve beş dakika sonra hızı dakikada on metreye çıkarın.

Üçüncü günde, fareleri tam 90 dakika boyunca koşturun. Koşu bandını dakikada on metre hızla başlatın ve tekrarlanan ayak şoklarını önlemek için fareleri nazikçe dürtükleyerek koşmaya teşvik edin. 90 dakikalık koşu sırasında farelerin çok fazla elektrik şoku almamaları için onları gözlemlemek ve yönlendirmek kritik önem taşır.

Çalışma boyunca, farelerin koşu bandı üzerinde kalmalarını sağlamak için parmaklarınızı kullanın. 40 dakika sonra hızı bir metre/dakika artırın. 50 dakika sonra hızı tekrar bir metre/dakika artırın.

60 dakika sonra, hızı bir metre/dakika daha artırın. 70 dakika sonra, 90 dakikalık koşunun son beş dakikasında hız 17 metre/dakika olacak şekilde hızı her beş dakikada bir artırmaya başlayın. Deneyin sonunda, istenirse doku toplamak için fareleri derhal ötanize edin.

Bu test için fareleri tek tek barındırın. Daha önce açıklananla aynı suşu kullanın. Bir bisiklet kilometre sayacı eklenmiş, 11.4 santimetre çapında bir fare koşu tekerleği hazırlayın.

Her bir dönüş 358 milimetrelik bir mesafeye karşılık gelmelidir. Fareyi, içerisinde tekerlek bulunan kafese yerleştirin ve farenin tekerleği iki hafta boyunca serbestçe kullanmasına izin verin. Her 24 saatte bir, farenin koştuğu mesafeyi odometreden kaydedin.

İki hafta sonunda, gerektiği şekilde analiz için dokuları toplayın. Otofajik akışı ölçmek için fareleri üç gün boyunca otofaji inhibitörü olan klorokin ile tedavi edin. Klorokini PBS içinde beş miligram/mililitre konsantrasyonda çözün ve farelere 50 mikrogram/gram dozunda intraperitonal olarak enjekte edin.

Farelere üç ardışık gün boyunca günde bir enjeksiyon yapın ve dokuları son enjeksiyondan üç saat sonra toplayın. Koşu bandında egzersiz yapan fareler için, üçüncü gündeki enjeksiyondan 90 dakika sonra 90 dakikalık koşuyu başlatın; böylece koşu, enjeksiyondan üç saat sonra sona ersin. Ardından fareleri ötanize edin ve dokularını hemen toplayın.

Fiksatif hazılayarak, hayvanı egzersiz sonrası 90 dakika içinde perfüze etmeye hazırlayın. 30 mililitrelik bir şırıngaya 15 ila 20 mililitre taze hazırlanmış yüzde dört paraformaldehit doldurun ve şırıngayı 20 gauge bir kateter iğne ile bağlayın. Doldurulmuş şırıngayı pompa sistemine takın ve sürekli akış hızını saatte 90 mililitreye ayarlayın.

Hayvan temiz bir çalışma yüzeyinde sırtüstü pozisyondayken, kalbi açığa çıkarmak için diyafram üzerinden göğüs boşluğunu kesin. Şimdi, kateter iğnesini sağ ventriküle yerleştirin. Ardından, kanı boşaltmak için karaciğer üzerinde küçük bir insizyon yapın ve pompayı çalıştırın.

Akciğer ve karaciğer tamamen soluklaşana kadar fiksatörü enjekte edin. Genellikle 15 mililitre fiksatör yeterli olacaktır. Perfüzyondan sonra iğneyi çıkarın ve ilgili dokuları toplayın.

İskelet kasını toplamak için vastus lateralis kasını disseke edin. Kasları açığa çıkarmak ve quadriceps femoris kasını belirlemek için bacak derisini hafifçe geriye doğru çekin. Ardından, femoral kemiğin üst kısmına yapışık olan dış kas olan vastus lateralis kasını disseke ederek çıkarın.

Daha ileri fiksasyon ve deplasman için, hasat edilen dokuları dört derece santigrat sıcaklıkta 24 saat boyunca yüzde dört paraformaldehide yerleştirin. Ertesi gün dokuları yüzde 15 sakroz PBS'ye aktarın ve dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca veya çözelti içinde çökelene kadar bekletin. Ardından dokuları, dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca veya daha uzun süre kalacak şekilde yüzde 30 sakroz PBS'ye aktarın.

Bu banyolar sırasında dokuları mümkün olduğunca karanlıkta tutun. Ardından, dokuları OCT gibi bir gömme ortamına yerleştirin ve gerekirse daha küçük parçalar halinde kesin. Sonra, küçük bir petri kabında birkaç dakika boyunca uyum sağlamalarına izin verin.

Ardından, örnekleri üzerini örtecek kadar OCT içeren kriyokalıplara aktarın. Kalıpların içinde, kesit alma yüzeylerini alta gelecek şekilde konumlandırın ve hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Daha sonra, OCT beyazlaşana kadar örnekleri kuru buzla doldurulmuş, kapalı bir köpük soğutucuda dondurun.

Şimdi, münferit örnekleri etiketli folyolara sarın, plastik bir poşet içinde mühürleyin ve işlenene kadar -80 °C'de saklayın. GFP etiketli LC3 bir raporlayıcı sistem olarak kullanılarak, belirtilen şekilde egzersiz yaptıran farelerde otofaji indüksiyonu gözlemlenmiştir. Otofaji stimülasyonunun ardından LC3,lezyon şeklinde yapılara bölünerekle sitozolden otofagozoma transloke olmuştur.

Egzersiz yapan farelerde, dinlenme durumundaki farelere kıyasla hem iskelet kasında hem de serebral kortekste çok daha fazla GFP-LC3 punkta gözlemlenmiştir. LC3 antikoru kullanılarak yapılan Western blot analizi, egzersizin lipid konjugatif LC3-II oluşumunu önemli ölçüde indüklediğini göstermiş ve bu durum,le sitozolik LC3-I'in LC3-II'ye dönüşümünün arttığını ortaya koymuştur. Ardından, otofajik kargo reseptörü p62'nin degradasyonu ölçülmüştür.

90 dakikalık koşu bandı aktivitesi, iskelet kasında dinlenme durumuna kıyasla daha yüksek bir p62 yıkımına neden olmuştur. Bu etki, egzersiz öncesi klorokin enjeksiyonu ile ortadan kaldırılmıştır. Klorokin bir lizozomal yıkım inhibitörü olduğundan, bu veriler gözlemlenen fenomenin otofagozom yıkımındaki bir bloktan ziyade, artmış bir otofajik akıştan kaynaklandığını göstermektedir.

Geliştirilmesinin ardından, bu tekniğin otofaji alanında, egzersizin metabolizma yıkımı ve hayvan davranışları mekanizmaları üzerindeki etkilerini araştıran öncülleri olmuştur. Bu prosedür uygulanırken, farelerin koşmaları sırasında izlenmeleri önemlidir. Bu prosedürü, elektron mikroskopisi gibi yöntemler takip eder.

Mitofaji ve lipofaji gibi seçici otofaji yolaklarında egzersizle ilgili ek soruları yanıtlamak için hayvan mikroskopisi gerçekleştirilebilir.