Name: Farelerde Aerobik Egzersiz ile Autophagy etkinleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Öğrenin, farelerde aerobik egzersizle otofaji aktivasyonunu nasıl tetikleyeceğinizi. Bu yöntem, GFP-LC3 transgeni kullanarak kas ve beyin dokularında otofaji seviyelerini ölçer. Egzersizin hücresel sağlık üzerindeki faydalarını anlamak için değerli bir yaklaşımdır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik destek ve yardım için Northwestern Üniversitesi Fare Histolojisi ve Fenotipleme Laboratuvarı'na ve GFP-LC3 transgenik fareler sağladığı için Noboru Mizushima'ya (Tokyo Üniversitesi) teşekkür ederiz. A. R. ve C. H., Northwestern Üniversitesi'nden başlangıç fonları ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (DK094980) hibe ile desteklendi.

hayvanları da içeren tüm işlemleri Northwestern University Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan kurallara göre gerçekleştirilmiştir. 1. Fare Modelleri <ol><li> egzersiz 8-12 haftalık fareler kullanın. In vivo olarak, egzersiz kaynaklı Otofaji tespit etmek için, görüntüleme çalışmaları ve biyokimyasal analizler için C57BL / 6 fareleri için GFP LC3 transgenik fareler (C57BL / 6 plan) kullanın. </li></ol> 2. Egzersiz kaynaklı Otofaji <ol><li> Koşu bandı kurulumu - zorla egzersiz <ol><li> ACCLIMATE ve 2 gün boyunca 10 ° yokuş yukarı açık koşu bandı üzerinde fareler eğitmek. 1. günde, 5 dakika boyunca fareler egzersiz 8 m / dakika ve 2 gün, 10 m başka bir 5 dakika, ardından 8 m / dakika, 5 dakika boyunca fareler egzersiz / 10 dak. hafif el dürtmek tarafından işletilen fareler teşvik edin. </li><li> 3. günde, fareler 10 ° yokuş yukarı bandı, starti 90 dakika boyunca çalışan tek bir nöbeti maruz izin10 m / dak hızında ng. 40 dakika sonra, 30 dakikalık bir toplam 1 m / dakika, her 10 dk bir oranda bandı hızını artırmak, ve bundan sonra da bir oranda hızını artırmak, 1 m / varıncaya kadar her 5 dakikada en az 17 m / dak, egzersiz süresi 90 dakika ve mesafe çalışan 1.070 metre olmak üzere toplam. </li><li> düşük yoğunluklu aralığında (1.2 Hz) elektrik uyaran ayarlayın ve tekrarlanan ayak çarpmasını önlemek için çalıştırmak için fareler ediyoruz. </li><li> Doku toplanması için, egzersizden hemen sonra servikal dislokasyon tarafından takip izofluran inhalasyon yoluyla fareler, euthanize. Diğer kabul ötenazi yöntemleri aynı zamanda, CO2 ve diğer anestetikler IP enjeksiyon kullanılabilir. otofaji düzeyi ötanazi yöntemleri etkilenecek görünmüyor. </li></ol></li><li> Koşu tekerlek ayarı - istemli egzersiz <ol><li> tek ev sahipliği fare ile bir kafes içinde bir fare çalışan tekerleğini (11,4 cm çap) yerleştirin. </li><li> Bir bisiklet kilometre sayacı kullanarak çalışan kapasitesini doğrulayın.358 de [tekerleğin tam dönme başına (mm) mesafesini] tekerlekli parametresini ayarlayın (11,4 * π). 24 saat sonra koşu mesafeyi ölçün. </li><li> Fare koşu tekerleği ile 2 hafta boyunca gönüllü çalıştıralım. Doku toplanması için, çalışma sonrası sabah fare kurban. </li></ol></li></ol> 3. Otofaji Akı Değerlendirilmesi <ol><li> istirahat ve egzersiz koşulları altında otofajik akının ölçülmesi için, üç gün boyunca Otofaji önleyicisi klorokin ile fareler tedavi etmek ve PBS ile tedavi edilen farelere karşılaştırın. <ol><li> PBS (5 mg / ml) içinde çözülür klorokin ve karın içinden arka arkaya üç gün boyunca 50 mg / kg / gün dozunda farelere chloroquine enjekte edilir. fareler Kurban ve son enjeksiyondan sonra dokular 3 saat toplamak. </li><li> icra fareler için, 50 mg / kg / gün arasında bir dozda birbirini takip eden iki gün klorokin ile ön muamele. Üçüncü gün, sonra, klorokin aynı konsantrasyonda farelere enjekte ve90 dakika onları başka bir 90 dakika koşu bandı üzerinde çalışmasına izin verin. </li><li> servikal dislokasyon tarafından takip izofluran inhalasyon yoluyla fareler, Euthanize. klorokin toplam inkübasyon süresi kontrolü (dinlenme) farelerde (3 saat) aynı şekilde, hemen çalıştırdıktan sonra dokuların toplayın. NOT: Alternatif olarak, fare dokularda otofaji akı belirlemek için klorokin tek bir enjeksiyon kullanın. </li></ol></li></ol> 4. Doku Hasat ve Fiksasyon <ol><li> 7.4 bir son pH PBS: doku hasat öncesi fosfat tamponlu salin (PBS) ve taze% 4 paraformaldehid (gerekli kişisel koruma araçları PFA, DİKKAT) hazırlanması. 4 ° C &#39;de, her iki çözüm saklayın. </li><li> (GFP LC3 fareler için)% 4 PFA, 20 ml - 15 30 ml şırınga doldurun. 20 G kateter iğne ile şırınga bağlayın. </li><li> Egzersiz sonrasında servikal dislokasyon ardından izofluran inhalasyon yoluyla fareler euthanize. </li><li> kendi ba temiz bir çalışma yüzeyine hayvan yerleştirinck. Kesme ve kalp maruz diyaframın keserek göğüs boşluğu açın. </li><li> Akciğer ve karaciğer tamamen soluk açana kadar, kan çıkıp izin karaciğer üzerinde küçük bir kesi yapmak ve kateter yoluyla kalbin sağ ventrikül içine yavaş yavaş 15 ml% 4 PFA toplam enjekte edilir. / Saat 90 ml sabit bir akış oranı ile bir şırınga pompası kullanılarak, idman oturumu hemen sonra fare serpmek. </li><li> Perfüzyon sonra, iğne kaldırmak ve ilgi dokular (örneğin beyin 11 ve iskelet kası) toplamak. iskelet kası için, vastus lateralis teşrih. Kısaca, kuadriseps lokalize, kasları ortaya çıkarmak için geriye doğru bacağın cilt çekin 12 femoris ve femur kemiğinin üst kısmına takılan harici kas Vastus lateralis, teşrih. </li><li> Daha fazla tespit ve dehidrasyon için, 4 ° C&#39;de 24 saat süreyle% 4 PFA GFP LC3 farelerin dokuları yerleştirin ve sonra% 15 aktarmak4 ° C &#39;de sükroz PBS gece boyunca veya dokuları çökene kadar, ve daha sonra gece boyunca 4 ° C&#39;de% 30 sukroz-PBS ya da daha uzun süre depolama için. onlar güçlü ışığa duyarlı olabileceği gibi mümkün olduğunca karanlık örnekleri tutun. </li><li> Western blot analizi için sıvı azot içinde doğrudan C57BL / 6 farelerinden alınan doku dondurma, ve -80 ° C&#39;de saklayın oturur. </li></ol> GFP-LC3 puncta 5. Görüntü Analizi <ol><li> doku süreci <ol><li> Bu etiketlenmiş bir küçük bir petri birkaç dakika &quot;optimal kesme ısısı bileşiği&quot; (OCT) halinde gömme orta dokular (daha önce PFA sabit ve% 30 sukroz içinde saklanan) ön-muamele. </li><li> doku karşılamak için yeterli taze OCT içeren etiketli cryomold doku aktarın. Orient cryomold altına doğru kesit yüzeyi (vastus için kesitte hemi-beyin için kas ve sagital bölümü lateralis). kabarcıkların oluşumunu önlemek. </li><li> freEkim beyaza dönene kadar, kuru buz dolu bir kapalı köpük soğutucu bir kaç dakika cryomold koyarak örnekleri Eze. Etiketli folyo bireysel örnekleri sarın bir plastik torba içinde üzerleri mühürlenir, -80 ° C gecede veya daha uzun saklayın. </li><li> slaytlar üzerinde bölümleri, 10 um kadar bir kalınlıkta Örnek bölümleri kesilmiş ve monte etmek için bir kriyostat kullanarak. -20 ° C&#39;de slaytlar Mağaza ve her zaman mümkün olduğunca ışıktan uzak slaytlar tutun. </li></ol></li><li> slayt hazırlama <ol><li> dondurucu slaytları çıkarın ve oda sıcaklığında onları Çözülme. DAPI ile medya montaj bir damla doku bölümü kapsamaktadır. en uygun büyüklükte bir lamel yerleştirin ve kabarcık oluşumunu önlemek. </li><li> , Lameller kenarları mühür oje, oda sıcaklığında karanlıkta kurumasını bekleyin ve sonra 4 ° C&#39;de bir ışık geçirmez bir kapta slaytlar saklamak veya GFP-LC3 puncta görüntüleme yakalama devam etmek oje kullanın. </li></ol></li><li> &lt;GFP strong&gt; miktar tayini - floresan mikroskop ile LC3 puncta <ol><li> Bütün numuneler için aynı durumda resim (pozlama ve ayarları) yakalayan Epifloresans mikroskopi gerçekleştirin. GFP için, 525 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyu kullanımı; DAPI için, 490 nm kullanımı. vastus lateralis bir 60x objektif ve beynin ön korteks bölgesini kullanarak örnek başına en az on görüntüler elde. </li><li> Deney grupları için kör istatistiksel analiz için her görüntüde 2.500 mikron 2 bir doku alanı, GFP-LC3 puncta sayısını ölçmek. &quot;Nesne Sayma&quot; otomatik ölçüm fonksiyonunu kullanarak, her numunenin 10 görüntüleri ortalama sayısını hesaplayın. vastus için Ayarlar kas vardır lateralis: Eşik L = 10, H = 200; 2X pürüzsüz; 1X, temiz ve beyin frontal korteks için ayarları şunlardır: Eşik L = 11, H = 200; 2X pürüzsüz; 1X temiz. </li></ol></li></ol> Otofaji Belirteçleri 6. Western Blot Analizi <ol><li> &lt;strong&gt; Doku süreci <ol><li> liziz tamponu: 50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCI; 1 mM EDTA; % 1 Triton X-100; Proteaz inhibitörü ve fosfataz inhibitörleri (taze ilave edildi). </li><li> C Depolama -80 ° den C57BL / 6 farelerinin doku çıkarın. aşağıdaki işlem öncesinde bir jilet ile küçük parçalar halinde kas dokusu kesilir. (Hemi-beyin için) 800 ul veya numune soğuk lizis tamponu (vastus lateralis için) 500 ul ekleyin. Orta hızda bir homojenizatör ile 4 ° C sıcaklıkta örnek homojenize edilir. </li><li> Tam rotasyon ile 4 ° C &#39;de 1 saat kadar 30 dakika daha homojenleştirilir karışımı lize. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 12,000 xg&#39;de Homojenat Spin pelet atın ve yeni bir tüp içinde supernatant toplamak. </li></ol></li><li> otofaji analizi <ol><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak BCA protein tahlil kiti kullanılarak doku lysate&#39;lerin protein konsantrasyonu belirlenir. Her bir örnek normalizeAynı konsantrasyona seyreltildi. </li><li> Bir 1 2x Laemmli numune tampon maddesi ile örnek birleştirin: 1 oranında, 5 95 ° C &#39;de kaynatın - 10 dakika, ve P62 (anti-P62 antikoru gibi, Otofaji Batı benek analizi 14, 13 işaretleri ile devam edin 1: 500 seyreltme) ve LC3 (anti-LC3 antikoru, 1: 500 seyreltme). Buz üzerinde daha uzun kuluçka LC3 birden fazla bozulmuş bantları oluşturur edilebilir hemen örnek tamponu ilave edildikten sonra numune kaynatılır. </li><li> ImageJ kullanarak dansitometre analizi yolu ile P62 ve LC3 bantları sayısal olarak ve ilgili aktin bandının değer normalize. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).</li>
<li>Tracy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BNIP3+is+an+RB%2FE2F+target+gene+required+for+hypoxia-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy.</a> Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).</li>
<li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+renovation+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li>
<li>Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+physiology+and+pathology+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system.</a> Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).</li>
<li>Rocchi, A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+autophagy+in+metabolism+and+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+biology%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders.</a> Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).</li>
<li>Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cancer.</a> Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).</li>
<li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+BCL2-regulated+autophagy+is+required+for+muscle+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis.</a> Nature. 481, 511-515 (2012).</li>
<li>He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+induces+autophagy+in+peripheral+tissues+and+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain.</a> Autophagy. 8, 4(2012).</li>
<li>Kuramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+by+novel+inducers+prevents+BECN2-mediated+drug+tolerance+to+cannabinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids.</a> Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).</li>
<li>Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Treadmill+Fatigue+Test%3A+A+Simple%2C+High-throughput+Assay+of+Fatigue-like+Behavior+for+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse.</a> JoVE. , (2016).</li>
<li>Navone, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+and+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells.</a> Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li>
<li>Bjørkøy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687908036124">Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1.</a> Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12, 1-222 (2016).</li>
<li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+Pathogenesis+of+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the Pathogenesis of Disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+rapamycin+treatment+has+differential+effects+on+metabolism+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice.</a> Cell Metab. 17, 456-462 (2013).</li>
<li>Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+functions+of+mTOR+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory functions of mTOR inhibition.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).</li>
<li>Miller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin-mediated+lifespan+increase+in+mice+is+dose+and+sex+dependent+and+metabolically+distinct+from+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction.</a> Aging Cell. 13, 10(2014).</li>
<li>Grumati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+exercise+stimulates+autophagy+in+normal+skeletal+muscles+but+is+detrimental+for+collagen+VI-deficient+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles.</a> Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).</li>
<li>Lira, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+exercise+training-induced+skeletal+muscle+adaptation+and+improvement+of+physical+performance%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).</li>
<li>Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25483961">Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity.</a> Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).</li>
<li>Kregel, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.the-aps.org/mm/SciencePolicy/AnimalResearch/Publications/Animal-Exercise-Protocols">Resource book for the design of animal exercise protocols.</a> American Physiological Society. , 152(2006).</li>
<li>Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11740298">Interstrain variation in murine aerobic capacity.</a> Med Sci Sports Exerc. 33, 5(2001).</li>
<li>Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximal+metabolic+rates+during+voluntary+exercise%2C+forced+exercise%2C+and+cold+exposure+in+house+mice+selectively+bred+for+high+wheel-running%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+biology%22%5BJournal%5D)">Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running.</a> The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).</li>
<li>Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sprint+exercise+on+oxidative+stress+in+skeletal+muscle+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver.</a> European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).</li>
<li>Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high-intensity+intermittent+swimming+on+glucose+transport+in+rat+epitrochlearis+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle.</a> J Appl Physiol. 84, 4(1998).</li>
<li>Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+submaximal+oxygen+consumption+during+treadmill+running+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice.</a> Can J Physiol Pharmacol. 71, 4(1993).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Otofaji enerji sağlar ve sitoplazma bileşenleri veya zarar görmüş organellerin lizozomal degradasyonu ile sitotoksisitesini azaltır katabolik işlemdir. Otofaji incelenmesi hücresel homeostazının düzenlenmesi ve stres yanıtı mekanizmalarını anlamak için önemlidir. Yeni modeller ve yöntemler çok sayıda patolojik süreçler 16, 17 nasıl katkı bozulmuş otofaji incelemek için, araştırma alanında 15 ortaya çıkıyor. Be...

Otofaji örneğin açlık ve hipoksi, 1, 2 gibi çeşitli stres koşullarına karşılık olarak indüklenir evrimsel olarak korunmuş bir parçalanma yolu vardır. Otofaji sırasında, çift zar kabarcıklar, gereksiz veya hasarlı hücre içi bileşenleri birleştirmek ve bozulması 3 lizozomlar içine taşımak, autophagosomes çağırdı. Bazal Otofaji nörodejenerasyon, tümör oluşumu ve tip 2 diyabet 4, 5, 6 dahil olmak üzere birçok hastalıkta implike olduğu hücresel fonksiyon ve organizmanın gelişimi, ve bozulmuş bazal Otofaji için gereklidir. En iyi bilinen fizyolojik otofaji indükleyici açlık olduğunu. Bununla birlikte, iki önemli kısıtlamalara sahiptir. İlk olarak, açlık, örneğin, etkili hayvanlarda Otofaji uyarılması için farelerde besin yasaklaması 48 saat uzun sürdüğüEn organlarda. İkincisi, açlık zorlukla nedeniyle beyinde göreli olarak istikrarlı bir besin kaynağı, beyin Otofaji neden olur. Aslında, birçok ilaç, kan beyin bariyerini geçemez olarak, küçük moleküllü indüklecilerle otofaji indüksiyon tespit etmek de zordur. Bu nedenle, daha iyi bir hastalığın patogenezinde Otofaji aktivasyon fonksiyonunu analiz etmek için, en son egzersiz süresi 7, 8, 9, kısa bir süre içinde Otofaji uyarılması için daha güçlü bir fizyolojik bir yöntem olduğu keşfedilmiştir. açlık ile karşılaştırıldığında, otofaji etkili bir koşu bandı hızlı 30 olarak dakika çalıştırarak indüklenir. Böylece, egzersiz sağlık yararları aracılık ve hastalıkların önlenmesinde otofaji mekanizmasını incelemek için kullanışlı ve güçlü fizyolojik bir yaklaşımdır. LC3 ve P62 dahil olmak üzere, Otofaji aktivitesinin tespit edilmesi için, bir çok protein işaretleri vardır. LC3 (mikrotübül ilişkili protein 1A / 1B-ışık cHain 3) Bir hücre sıvısı protein (IS LC3 I Otofaji indüksiyondan sonra PE (fosfatidiletanolamin) konjüge edilmiş olduğu) oluşturur. PE-lipide LC3 (LC3 II formu) autophagosomal zarları üzerine işe ve GFP ile işaretlenerek autophagosomes görselleştirmek için kullanılabilmektedir. mikroskopta autophagosomes yapılarını noktalı yanına sitosolden translokasyonu Otofaji indüksiyon gösterir. P62 (örneğin, ubikitinasyon proteinleri gibi) Otofaji yüzeyler için bir kargo reseptördür ve de autophagosomes dahil edilir. Protein autophagosomes birlikte lizozomların parçalanır yana, seviyeleri otofaji akının ölçülmesi için kullanılabilir. Burada zorunlu egzersiz (koşu bandı) ve gönüllü egzersiz (tekerlekler çalıştıran) de dahil olmak üzere aerobik egzersiz, tarafından uyarılan farklı fare dokularda Otofaji ölçmek için bu işaretçileri nasıl kullanılacağını gösterir. Aynı prosedürler, diğer indükleyicilerin tedaviden sonra Otofaji in vivo ölçümü uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Koşu Bandı</td><td>Columbus Instruments</td><td>150-RM Exer 3/6</td><td></td></tr><tr><td>Fare koşu tekerleği</td><td>Süper Pet</td><td>100079365</td><td>çapı 11,4 cm</td></tr><tr><td>Kilometre</td><td>sayacı zili</td><td>DASHBOARD 100</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Nikon</td><td>Model: ters mikroskop ECLIPSE</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850UV</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör</td><td>IKA</td><td>003737001 / Model: T10 Temel S1</td><td></td></tr><tr><td>Klorokin</td><td>CAYMAN KİMYA ŞİRKETİ</td><td>14194</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmaldehye</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P6148</td><td>Kişisel koruma ekipmanı gereklidir. Bu ürün, kansere neden olduğu bilinen bir kimyasal olan formaldehit gazını açığa çıkarabilir.</td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>p62 antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>610833</td><td></td></tr><tr><td>LC3 antikoru</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Numune Tamponu</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

farelerde aerobik egzersiz ile autophagy etkinleştirme

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Otofaji, hücre homeostazı, işlevi ve farklılaşması için gerekli olan bir lizozomal bozunma yoludur. Stres koşulları altında, otofaji indüklenir ve lizozomlarda bozunma için toplu sitozol, hasarlı organeller ve yanlış katlanmış proteinler gibi çeşitli kargoları hedefler. Elde edilen besin molekülleri, yeni protein sentezi ve ATP üretimi için sitozole geri dönüştürülür. Otofajinin upregülasyonunun birçok hastalığın patogenezine karşı yararlı etkileri vardır ve otofajiyi aktive etmek için farmakolojik ve fizyolojik stratejiler bildirilmiştir. Aerobik egzersiz son zamanlarda farelerde kas, karaciğer, kalp ve beyin dahil olmak üzere birçok organda etkili bir otofaji indükleyicisi olarak tanımlanmıştır. Burada, zorunlu koşu bandı egzersizi veya gönüllü tekerlek koşusu ile in vivo otofajiyi indüklemek için prosedürleri gösteriyoruz. Ayrıca, otofagozomlarla birlikte lizozomlara taşınan ve parçalanan işaretleyici proteinler LC3 ve p62'yi kullanarak, fare dokularındaki otofaji seviyelerini kantitatif olarak analiz etmek için mikroskobik ve biyokimyasal yöntemler gösteriyoruz.

Bu protokol aerobik egzersiz fare dokularda Otofaji ikna etmek için iki farklı yöntem açıklanır: aklimasyonundan iki gün ilerledi çok şeritli koşu bandı üzerinde zorunlu egzersiz 90 dakika olmak üzere toplam; veya tek ev sahipliği fareler tarafından kullanılan bir koşu tekerlek üzerinde gönüllü egzersiz iki hafta. Her seri protokol, çeşitli organlarda, flüoresans mikroskopisi ve Western blot analizi ile Otofaji akı ölçebilir. ...

Otofaji aktivasyonu çeşitli hastalıkların önlenmesinde yararlıdır. Fizyolojik yaklaşımlardan biri in vivo otofaji fiziksel egzersiz teşvik etmek. Burada aerobik egzersiz ile Otofaji etkinleştirmek ve farelerde otofaji düzeylerini ölçmek için nasıl gösterir.

Farelerde Aerobik Egzersiz ile Autophagy etkinleştirme

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Bu deneyin genel amacı, zorunlu veya gönüllü koşu yoluyla farelerde otofajiyi fizyolojik olarak aktive etmek ve ardından belirli dokulardaki otofaji seviyelerini ölçmektir. Bu yöntem, otofaji hakkındaki temel soruların, özellikle de otofajinin ve hareketin aerobik egzersizin sağladığı faydalı etkilere nasıl katkıda olduğunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fiziksel egzersizin farelerde in vivo otofaji arasındaki hızlı bir aerobik geçiş olmasıdır.Bu deney için, in vivo egzersizle tetiklenen otofajiyi tespit etmek amacıyla GFP-LC3 olarak bilinen bir transgen taşıyan, sekiz ila on iki haftalık C57 black six fareleri ile başlayın. Fare koşu bantlarının kullanımıyla ilgili ayrıntılar için şu JoVE yayınını inceleyin. Koşu bandının elektriksel uyarımını düşük yoğunluğa ayarlayın.İlk iki oturumlarında, fareleri on derecelik eğimli açık bir koşu bandına alıştırın. Birinci günde, koşu bandını dakikada sekiz metre hızda çalıştırarak fareleri beş dakika boyunca egzersiz yaptırın. İkinci günde, fareleri başlangıçta dakikada sekiz metre hızla on dakika boyunca koşturun ve beş dakika sonra hızı dakikada on metreye çıkarın.Üçüncü günde, fareleri tam 90 dakika boyunca koşturun. Koşu bandını dakikada on metre hızla başlatın ve tekrarlanan ayak şoklarını önlemek için fareleri nazikçe dürtükleyerek koşmaya teşvik edin. 90 dakikalık koşu sırasında farelerin çok fazla elektrik şoku almamaları için onları gözlemlemek ve yönlendirmek kritik önem taşır.Çalışma boyunca, farelerin koşu bandı üzerinde kalmalarını sağlamak için parmaklarınızı kullanın. 40 dakika sonra hızı bir metre/dakika artırın. 50 dakika sonra hızı tekrar bir metre/dakika artırın.60 dakika sonra, hızı bir metre/dakika daha artırın. 70 dakika sonra, 90 dakikalık koşunun son beş dakikasında hız 17 metre/dakika olacak şekilde hızı her beş dakikada bir artırmaya başlayın. Deneyin sonunda, istenirse doku toplamak için fareleri derhal ötanize edin.Bu test için fareleri tek tek barındırın. Daha önce açıklananla aynı suşu kullanın. Bir bisiklet kilometre sayacı eklenmiş, 11.4 santimetre çapında bir fare koşu tekerleği hazırlayın.Her bir dönüş 358 milimetrelik bir mesafeye karşılık gelmelidir. Fareyi, içerisinde tekerlek bulunan kafese yerleştirin ve farenin tekerleği iki hafta boyunca serbestçe kullanmasına izin verin. Her 24 saatte bir, farenin koştuğu mesafeyi odometreden kaydedin.İki hafta sonunda, gerektiği şekilde analiz için dokuları toplayın. Otofajik akışı ölçmek için fareleri üç gün boyunca otofaji inhibitörü olan klorokin ile tedavi edin. Klorokini PBS içinde beş miligram/mililitre konsantrasyonda çözün ve farelere 50 mikrogram/gram dozunda intraperitonal olarak enjekte edin.Farelere üç ardışık gün boyunca günde bir enjeksiyon yapın ve dokuları son enjeksiyondan üç saat sonra toplayın. Koşu bandında egzersiz yapan fareler için, üçüncü gündeki enjeksiyondan 90 dakika sonra 90 dakikalık koşuyu başlatın; böylece koşu, enjeksiyondan üç saat sonra sona ersin. Ardından fareleri ötanize edin ve dokularını hemen toplayın.Fiksatif hazılayarak, hayvanı egzersiz sonrası 90 dakika içinde perfüze etmeye hazırlayın. 30 mililitrelik bir şırıngaya 15 ila 20 mililitre taze hazırlanmış yüzde dört paraformaldehit doldurun ve şırıngayı 20 gauge bir kateter iğne ile bağlayın. Doldurulmuş şırıngayı pompa sistemine takın ve sürekli akış hızını saatte 90 mililitreye ayarlayın.Hayvan temiz bir çalışma yüzeyinde sırtüstü pozisyondayken, kalbi açığa çıkarmak için diyafram üzerinden göğüs boşluğunu kesin. Şimdi, kateter iğnesini sağ ventriküle yerleştirin. Ardından, kanı boşaltmak için karaciğer üzerinde küçük bir insizyon yapın ve pompayı çalıştırın.Akciğer ve karaciğer tamamen soluklaşana kadar fiksatörü enjekte edin. Genellikle 15 mililitre fiksatör yeterli olacaktır. Perfüzyondan sonra iğneyi çıkarın ve ilgili dokuları toplayın.İskelet kasını toplamak için vastus lateralis kasını disseke edin. Kasları açığa çıkarmak ve quadriceps femoris kasını belirlemek için bacak derisini hafifçe geriye doğru çekin. Ardından, femoral kemiğin üst kısmına yapışık olan dış kas olan vastus lateralis kasını disseke ederek çıkarın.Daha ileri fiksasyon ve deplasman için, hasat edilen dokuları dört derece santigrat sıcaklıkta 24 saat boyunca yüzde dört paraformaldehide yerleştirin. Ertesi gün dokuları yüzde 15 sakroz PBS'ye aktarın ve dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca veya çözelti içinde çökelene kadar bekletin. Ardından dokuları, dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca veya daha uzun süre kalacak şekilde yüzde 30 sakroz PBS'ye aktarın.Bu banyolar sırasında dokuları mümkün olduğunca karanlıkta tutun. Ardından, dokuları OCT gibi bir gömme ortamına yerleştirin ve gerekirse daha küçük parçalar halinde kesin. Sonra, küçük bir petri kabında birkaç dakika boyunca uyum sağlamalarına izin verin.Ardından, örnekleri üzerini örtecek kadar OCT içeren kriyokalıplara aktarın. Kalıpların içinde, kesit alma yüzeylerini alta gelecek şekilde konumlandırın ve hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Daha sonra, OCT beyazlaşana kadar örnekleri kuru buzla doldurulmuş, kapalı bir köpük soğutucuda dondurun.Şimdi, münferit örnekleri etiketli folyolara sarın, plastik bir poşet içinde mühürleyin ve işlenene kadar -80 °C'de saklayın. GFP etiketli LC3 bir raporlayıcı sistem olarak kullanılarak, belirtilen şekilde egzersiz yaptıran farelerde otofaji indüksiyonu gözlemlenmiştir. Otofaji stimülasyonunun ardından LC3,lezyon şeklinde yapılara bölünerekle sitozolden otofagozoma transloke olmuştur.Egzersiz yapan farelerde, dinlenme durumundaki farelere kıyasla hem iskelet kasında hem de serebral kortekste çok daha fazla GFP-LC3 punkta gözlemlenmiştir. LC3 antikoru kullanılarak yapılan Western blot analizi, egzersizin lipid konjugatif LC3-II oluşumunu önemli ölçüde indüklediğini göstermiş ve bu durum,le sitozolik LC3-I'in LC3-II'ye dönüşümünün arttığını ortaya koymuştur. Ardından, otofajik kargo reseptörü p62'nin degradasyonu ölçülmüştür.90 dakikalık koşu bandı aktivitesi, iskelet kasında dinlenme durumuna kıyasla daha yüksek bir p62 yıkımına neden olmuştur. Bu etki, egzersiz öncesi klorokin enjeksiyonu ile ortadan kaldırılmıştır. Klorokin bir lizozomal yıkım inhibitörü olduğundan, bu veriler gözlemlenen fenomenin otofagozom yıkımındaki bir bloktan ziyade, artmış bir otofajik akıştan kaynaklandığını göstermektedir.Geliştirilmesinin ardından, bu tekniğin otofaji alanında, egzersizin metabolizma yıkımı ve hayvan davranışları mekanizmaları üzerindeki etkilerini araştıran öncülleri olmuştur. Bu prosedür uygulanırken, farelerin koşmaları sırasında izlenmeleri önemlidir. Bu prosedürü, elektron mikroskopisi gibi yöntemler takip eder.Mitofaji ve lipofaji gibi seçici otofaji yolaklarında egzersizle ilgili ek soruları yanıtlamak için hayvan mikroskopisi gerçekleştirilebilir.

activating-autophagy-by-aerobic-exercise-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Laboratuvar farelerinde şok ızgarası kullanılmadan egzersiz dayanıklılığını değerlendirmek için bir yöntem gösterilmiştir. Bu yöntem, stresin deneysel parametreler üzerindeki kafa karıştırıcı etkilerini azaltabilen insancıl bir iyileştirmedir.

Bir Şok Grid Kullanımı olmadan Kemirgen Egzersiz Endurance Değerlendirilmesi: Zorla Egzersiz Alternatif Bir

Aktif otofaji, Kas Kök Hücresi (MuSC) aktivasyonu için gerekli olan üretken kas rejenerasyonu ile ilişkilidir. Burada, LC3'ün in situ tespiti için bir protokol sunuyoruz, kontrol ve yaralı farelerdeki kas dokusu bölümlerinin MyoD pozitif MuSC'lerinde bir otofaji markörü.

Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması

Hipoksi yoğun eğitim sprint yeteneği tekrarlanan vasküler uyarlamalar potansiyel olarak bazı hastalarda yararlı ikna etmek ve sporcuların geliştirmek için kanıtlanmış bir protokoldür. Burada, protokol ve ex vivo vasküler işlevi değerlendirme sistemini kullanarak bu vasküler uyarlamalar tanımlamak fizibilite eğitim fare kullanarak sınayın.

Supramaximal yoğunluğu hipoksik egzersiz ve farelerde vasküler işlevi değerlendirme

Kısa oturum (≤10 min) yüksek yoğunluk ara egzersiz (HIIT) daha uzun egzersiz yöntemleri için bir alternatif olarak ortaya çıkıyor, henüz daha kısa türevleri nadiren hayvan çalışmalarında modellenmiştir. Burada, biz 10 dk tarif, 3 gün bir hafta, yokuş yukarı koşu bandı HIIT protokolü bu erkek fiziksel performansını yükseltir ve dişi fareler yaşlı.

Kısa oturum yüksek yoğunluklu ara egzersiz ve koşu bandı değerlendirme yaşlı farelerde

Bu prosedür, farelerde çevrilebilir bir aşamalı yüklü koşu tekerleği direnç eğitim modelini açıklar. Bu direnç eğitim modelinin birincil avantajı, tamamen gönüllü olması, böylece hayvanlar için stresi ve araştırmacı üzerindeki yükü azaltmasıdır.

Farelerde Progresif Direnç Eğitimi için Basit ve Ucuz Bir Koşu Tekerleği Modeli

Bu protokol, Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde otofajinin besin tükenmesi yoluyla indüklenmesini açıklamakta ve transgenik sinek suşlarını kullanarak otofajideki değişiklikleri analiz etmektedir.

Drosophila melanogaster larva yağ gövdesinde açlığa bağlı otofajinin analizi

Bu makale, diyete bağlı obezitenin Sprague-Dawley sıçan modelinde yüksek yoğunluklu aralıklı antrenman (HIIT) protokolünün morfometrik yanıtlarını ve antrenman performansı sonuçlarını sunmaktadır. Bu protokolün amacı, zayıf ve obez sıçanlarda egzersiz yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak ve HIIT'e fizyolojik yanıtları belirlemektir.

Egzersiz eforunu en üst düzeye çıkarmak ve sıçanlarda fizyolojik değişiklikleri indüklemek için kronik yüksek yoğunluklu aralıklı antrenman ve diyete bağlı obezite modeli

İn vitro deneylere dayanarak, bu çalışma, PINK1 / Parkin sinyal yolunun önemli bir rol oynadığı mitopajiyi etkileyerek kardiyomiyositlerin oksidatif stres hasarını onarmada krosetinin mekanizmasını ortaya koymuştur.

H9c2 Miyokard Hücrelerinin Crocetin ile Oksidatif Stresten PINK1 / Parkin Yolu Aracılı Mitopaji ile Korunması

Bu protokol, fareler için statik eğitim ekipmanı yapmak için basit bir yöntem sağlar. Cihaz, geleneksel egzersizin tip 2 diyabet (T2DM) üzerindeki müdahale etkisini doğrulamak için farelerin uzuvlarının kas izometrik kasılmasını korur ve T2DM'nin klinik tedavisi için yeni egzersiz tedavisi sağlar.

Tip 2 Diyabetik Fareler için Statik Kuvvet Antrenmanı Yöntemi

Bu video, aerobik mantar lignocellulosic bitki dokularında bozulma çalışma kontrollü bir ortamda bir yaklaşım göstermektedir. Besin kaynakları ve nem kontrolü için agar-blok microcosms yeteneği önemli bir avantaj, ancak bu yaklaşım genellikle karışık başarı verimleri. Biz, tekrarlanabilir, düşük değişkenlik verim kritik tuzaklar adresi.

Aerobik Mantarlar Kontrollü Bitki Doku Ayrışma Agar-Blok Microcosms

Öğrenin, farelerde aerobik egzersizle otofaji aktivasyonunu nasıl tetikleyeceğinizi. Bu yöntem, GFP-LC3 transgeni kullanarak kas ve beyin dokularında otofaji seviyelerini ölçer. Egzersizin hücresel sağlık üzerindeki faydalarını anlamak için değerli bir yaklaşımdır.

Farelerde Aerobik Egzersiz ile Autophagy etkinleştirme

Daha fazla video keşfet