Farelerde Aerobik Egzersiz ile Autophagy etkinleştirme

Otofaji aktivasyonu çeşitli hastalıkların önlenmesinde yararlıdır. Fizyolojik yaklaşımlardan biri in vivo otofaji fiziksel egzersiz teşvik etmek. Burada aerobik egzersiz ile Otofaji etkinleştirmek ve farelerde otofaji düzeylerini ölçmek için nasıl gösterir.

Bu deneyin genel amacı, farelerde otofajiyi zorla veya istemli koşu ile fizyolojik olarak aktive etmek ve daha sonra belirli dokulardaki otofaji seviyelerini ölçmektir. Bu yöntem, otofaji ile ilgili temel sorulara, özellikle de otofaji ve eylemin aerobik egzersizin aracılık ettiği faydalı etkilere nasıl katkıda bulunduğuna cevap vermeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fiziksel egzersizin fareler kullanılarak in vivo olarak otofaji arasında hızlı bir aerobik salınım olmasıdır.

Bu deney için, GFP-LC3 olarak bilinen, in vivo olarak egzersize bağlı otofajiyi tespit etmek için bir trans geni barındıran sekiz ila on iki haftalık C57 siyah altı fare ile başlayın. Fare koşu bantlarının kullanımıyla ilgili ayrıntılar için aşağıdaki JoVE yayınına bakın. Koşu bandının elektriksel uyarısını düşük yoğunluğa ayarlayın.

İlk iki seanslarında, fareleri on derece yokuş yukarı açık koşu bandına alıştırın. İlk gün, koşu bandı dakikada sekiz metre hızla koşarken fareleri beş dakika boyunca egzersiz yapın. İkinci gün, fareleri başlangıçta dakikada sekiz metre hızla on dakika çalıştırın ve beş dakika sonra hızı dakikada on metreye yükseltin.

Üçüncü gün, fareleri tam 90 dakika boyunca çalıştırın. Koşu bandını dakikada on metre hızla başlatın ve tekrarlanan ayak şoklarını önlemek için fareleri hafif dürtmeler kullanarak koşmaya teşvik edin. Fareleri gözlemlemek ve manipüle etmek çok önemlidir, böylece 90 dakikalık çalışma sırasında çok fazla elektrik çarpması almazlar.

Koşu boyunca, fareleri koşu bandında kalmaya teşvik etmek için parmaklarınızı kullanın. 40 dakika sonra, 6hızı dakikada bir metre artırın. 50 dakika sonra hızı tekrar dakikada bir metre artırın.

60 dakika sonra, hızı dakikada bir metre daha artırın. 70 dakika sonra, 90 dakikalık koşunun son beş dakikası dakikada 17 metre olacak şekilde hızı her beş dakikada bir artırmaya başlayın. Denemenin bitiminden sonra, istenirse doku toplanması için fareleri hemen ötenazi yapın.

Bu test için fareleri ayrı ayrı barındırın. Daha önce tarif edilenle aynı türü kullanın. Bisiklet kilometre sayacı takılı 11,4 santimetre çapında bir fare koşu tekerleği hazırlayın.

Her dönüş 358 milimetre hareket ölçmelidir. Fareyi tekerleğin bulunduğu kafese taşıyın ve farenin iki hafta boyunca serbestçe kullanmasına izin verin. Her 24 saatte bir, farenin kilometre sayacından koştuğu mesafeyi kaydedin.

İki hafta sonra, gerektiği gibi analiz için dokuları toplayın. Otofajik akıyı ölçmek için, fareleri üç gün boyunca otofaji inhibitörü klorokin ile tedavi edin. Klorokini PBS'de mililitre başına beş miligramda çözün ve gram başına 50 mikrogram dozunda intraperitoneal olarak farelere enjekte edin.

Farelere art arda üç gün boyunca günde bir enjeksiyon yapın ve son enjeksiyondan üç saat sonra dokuları toplayın. Koşu bandı ile çalıştırılan fareler için, üçüncü gün enjeksiyondan 90 dakika sonra 90 dakikalık koşuya başlayın, böylece koşu enjeksiyondan üç saat sonra sona erer. Daha sonra farelere ötenazi yapın ve hemen dokularını toplayın.

Fiksatifi hazırlayarak egzersiz yaptıktan sonraki 90 dakika içinde bir hayvanı bollaştırmaya hazırlanın. 30 mililitrelik bir şırıngaya 15 ila 20 mililitre taze yapılmış yüzde dört paraformaldehit yükleyin ve şırıngayı 20 gauge kateter iğnesi ile bağlayın. Yüklü şırınga pompasını takın ve sürekli akışta saatte 90 mililitreye ayarlayın.

Hayvan temiz bir çalışma yüzeyinde, sırtüstü pozisyonda, kalbi açığa çıkarmak için göğüs boşluğunu diyaframdan kesin. Şimdi, kateter iğnesini sağ ventriküle yerleştirin. Ardından, kanı boşaltmak ve pompayı başlatmak için karaciğer üzerinde küçük bir kesi yapın.

Akciğer ve karaciğer tamamen soluklaşana kadar fiksatifi enjekte edin. Genellikle 15 mililitre fiksatif yeterli olacaktır. Bolluktan sonra, iğneyi çıkarın ve ilgilenilen dokuları toplayın.

İskelet kasını toplamak için vastus lateralis'i inceleyin. Kasları ortaya çıkarmak ve kuadriseps femoris'i lokalize etmek için bacağın derisini kısaca geriye doğru çekin. Ardından, femur kemiğinin üst kısmına bağlı dış kas olan vastus lateralis'i inceleyin.

Daha fazla fiksasyon ve dehidrasyon için, hasat edilen dokuları dört santigrat derecede 24 saat boyunca yüzde dört paraformaldehit içine yerleştirin. Ertesi gün, dokuları yüzde 15 sükroz PBS'ye aktarın ve gece boyunca veya çözeltiye yerleşene kadar dört santigrat derecede ıslanmalarına izin verin. Daha sonra, dokuları gece boyunca veya daha uzun süre dört santigrat derecede yüzde 30 sükroz PBS'ye aktarın.

Bu banyolar sırasında dokuları mümkün olduğunca karanlıkta tutun. Ardından, dokuları OCT gibi bir gömme ortamına yerleştirin ve gerekirse daha küçük parçalara ayırın. Ardından, küçük bir petri kabında birkaç dakika alışmalarına izin verin.

Daha sonra, bunları kapsayacak kadar OCT ile kriyomoldlara aktarın. Kalıplarda, kesit yüzeylerini tabana doğru yönlendirin ve kabarcık oluşturmaktan kaçının. Ardından, numuneleri OCT beyaza dönene kadar kuru buzla doldurulmuş kapalı bir köpük soğutucuda dondurun.

Şimdi, tek tek numuneleri etiketli folyolara sarın, plastik bir torbaya koyun ve işlenene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bir raportör sistem olarak GFP etiketli LC3 kullanılarak, tarif edildiği gibi egzersiz yapılan farelerde otofaji indüksiyonu gözlendi. Otofaji stimülasyonundan sonra, LC3 noktasal yapılarda sitozolden otofagozoma yer değiştirdi.

Egzersiz yapan fareler, dinlenme durumdaki farelere kıyasla hem iskelet kasında hem de serebral kortekste çok daha fazla GFP-LC3 puncta'ya sahipti. Bir LC3 antikoru kullanılarak yapılan Western blot analizi, egzersizin lipid konjugatif LC3-II oluşumunu önemli ölçüde indüklediğini gösterdi, bu da sitozolik LC3-I'in LC3-II'ye dönüşümünün arttığını düşündürdü. Daha sonra, otofajik kargo reseptörü p62'nin bozunması ölçüldü.

90 dakikalık koşu bandı aktivitesi, iskelet kasında dinlenme durumuna göre daha yüksek bir p62 bozulmasına neden oldu. Bu etki, egzersizden önce klorokin enjeksiyonu ile kurtarıldı. Klorokin, lizozomal bozunmanın bir inhibitörü olduğundan, bu veriler, gözlenen fenomenin otofagozom bozunmasındaki bir bloktan ziyade yüksek bir otofobik akıdan kaynaklandığını göstermektedir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, metabolizmanın ve hayvan davranışlarının bozulmasında egzersiz mekanizması üzerindeki etkilerini araştırmak için otofaji alanında öncülere sahipti. Bu prosedürü denerken, fareleri çalışırken izlemek önemlidir. Bu prosedürü takiben, elektrik mikroskobu gibi yöntemler vardır.

Mitofaji ve lipofaji gibi belirli otofaji yollarında egzersiz gibi ek soruları yanıtlamak için hayvan mikroskobu yapılabilir.