Nötrofil fagozomun Görüntüleme ve Sitoplazma bir oranlı metrik pH Göstergesi kullanma

Bu konfokal mikroskopi tekniğinin genel amacı, nötrofil fagositoz vakuolünün ve sitoplazmasının pH değerini ve alanını görüntülemektir. Bu yöntem, fagositoz vakuolü ve sitoplazmadaki pH'ın dinamik değişimlerinin yanı sıra fagositoz vakuolünün hacminin izlenmesini ve miktarının belirlenmesini sağlar. Bu ölçümler, NADPH oksidaz aktivitesine göre değişiklik gösterir ve bu enzimin fonksiyonu ile fagositoz vakuolü membranı boyunca gerçekleşen iyon akışlarının vekil belirteçleri olarak kullanılabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, hem fagozomun hem de sitoplazmanın geniş bir pH aralığına sahip bir boya ile eş zamanlı olarak görüntülenemebilmesidir. Bu prosedüre başlamak için, 50 µg carboxy-S-1 succinimidyl ester'i 100 µL yüksek saflıkta DMSO içinde seyrelterek bir alikot hazırlayın. Karışması için iyice vorteksleyin.

Ardından, 15 ml'lik bir tüp içerisinde 0,1 molar sodyum bikarbonat içinde 1 x 10⁸ ısı ile öldürülmüş veya HK Candida'dan bir mililitre hazırlayın. 2.000 RPM'de vorteks üzerinde karıştırırken, HK Candida'ya her seferinde bir damla olacak şekilde 100 µL carboxy-S-1 ekleyin. Bundan sonra, tüpü alüminyum folyo ile sarın ve oda sıcaklığında bir saat boyunca roller üzerine yerleştirin.

Bir saat sonra, HKC-S-1 hücrelerini her seferinde 10 dakika boyunca 2,250 ×g santrifüj ile üç kez yıkayın. İlk iki yıkama için peleti 15 mL 0.1 M sodyum bikarbonat içinde yeniden süspande edin. Üçüncü yıkamadan sonra, peleti 1 mL BSS tamponu içinde yeniden süspande edin.

HKC-S-1 süspansiyonunu 100 µL'lik alikotlar halinde tüplere aktarın ve -20 °C'de saklayın. HKC-S-1'i insan nötrofilleri için opsonize etmek amacıyla, çözülmüş 100 µL HKC-S-1'e 100 µL insan IGG serumu ekleyin. 37 °C'de ve 1.000 RPM'de bir ısıtıcı çalkalayıcıda 60 ila 90 dakika, ardından bir roller'da 4 °C'de iki saat boyunca karıştırın.

Bundan sonra, örneği BSS tamponu ile her biri bir dakika boyunca 17,000 ×g'de santrifüj ederek üç kez yıkayın. Ardından, örneği 100 µL BSS tamponu içinde tekrar süspande edin. İnsan periferik kan nötrofilleri için, sağlıklı bir donörden venipunksiyon yoluyla 15 mL kan alın ve bunu mililitre başına 1,000 IU sodyum heparin çözeltisi içeren 20 mL'lik bir şırıngaya aktarın.

Bir pipet ucu kullanarak, şırıngaya 1,5 milliliters %10 dekstran çözeltisi enjekte edin. Şırıngayı üç kez nazikçe ters çevirin ve ardından tezgah üzerinde dik konumda 30 ila 60 dakika bekletin. 30 ila 60 dakika sonra, kan yaklaşık olarak ikiye ayrılmalı; üstte saman rengi bir buffy coat tabakası ve altta eritrositler içeren bir tabaka oluşmalıdır.

Üst tabakayı bir iğne aracılığıyla dikkatlice dışarı itin veya bir pipet ucuyla alın, ardından kırmızı tabakayı almamaya dikkat ederek 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. İki belirgin tabaka elde etmek için, beş mililitrelik bir pipet kullanarak tüpün altına, buffy coat tabakasının altına üç ila dört mililitre yoğunluk gradyanı medyumu ekleyin. Ardından, örneği 900 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatanı dökün ve kırmızı peleti bırakın. Ardından, peleti dağıtmak için hafifçe vorteksleyin. Sonrasında, pelete yedi mililitre distile otoklavlanmış su ekleyin ve peleti yeniden süspande etmek için 20 saniye boyunca tersyüz edin.

Ardından, yedi mililitre 2x salin ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez ters çevirin; böylece geri kalan kırmızı kan hücreleri lizis olur, ardından örneği 300 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve peleti BSS tamponu içerisinde mililitre başına yaklaşık 4 × 10⁶ olacak şekilde yeniden süspande edin. Bu prosedürde, sekiz kuyucuklu bir mikroskopi plağının her kuyucuğunu, oda sıcaklığında 40 ila 60 dakika boyunca 200 µL poli-L-lizin ile ön işlemden geçirin, ardından poli-L-lizini uzaklaştırın ve kuyucukları 200 µL distile su ile iki kez yıkayın.

Ardından, her bir kuyucuğa hazırlanan hücre süspansiyonundan 200 µL ekleyin ve oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika inkübe edin. Bundan sonra, bir tüpe 100 µL yüksek saflıkta DMSO ekleyip vorteksleyerek karıştırarak S-1-AM esterinden bir alikot hazırlayın. Küçük bir tüpe 1,7 mL BSS tamponu ve 20 µL S-1-AM ekleyin ve karışımı vorteksleyin.

Ardından, kuyucukları 200 microliters BSS tamponu ile iki kez yıkayın ve tamponu S-1-AM solüsyonu ile değiştirin. Sıvıyı kuyucukların duvarından aşağıya doğru nazikçe pipetleyerek, kuyucuk tabanına yapışmış hücre tek tabakasını rahatsız etmemeye özen gösterin. Sonrasında, örneği oda sıcaklığında en az 25 dakika inkübe edin.

Ardından, kuyucukları 200 µL BSS tamponu ile iki kez yıkayın. Bir inhibitörü test etmek için, BSS tamponu içinde uygun ilaçtan bir ana karışım hazırlayın ve kuyucukları bununla iki kez yıkayın. Daha sonra, opsonize edilmiş HKC-S-1 hücrelerini beş mikron seviyesinde yaklaşık üç saniye boyunca sonike edin ve her bir kuyucuğa 10 µL ekleyin; ardından plakayı 37 °C'de 15 ila 20 dakika inkübe ederek hücreleri fagositoz anlık görüntülerinin alınması için hazır hale getirin.

Konfokal mikroskop kullanarak, hücrelerin 555 nanometrede uyarılmasını ve emisyonun 560 ila 600 nanometre ile 610 nanometrenin üzerindeki iki detektör tarafından algılanmasını sağlayacak şekilde lazer dalga boyunu ayarlayın. Ardından, hücreleri 63X yağ daldırma lensi kullanarak görüntüleyin. Merkez karoyu görüntülemek için sürekli ayarda bir karo tarama görüntüsü kullanın.

Görüntüyü optimize etmek için floresans yoğunluğunu ve dedektör kanallarının kazancını kullanarak lazerin odağını ve yoğunluğunu ve iki kanalın kazancını ayarlayın. Ardından, her iki kanalı da görüntülemek için ayarları kullanarak görüntüyü bölün. Deneye başlamadan önce, sitoplazmada veya vakuollerde, kırmızı noktalar şeklinde görünen bir floresans yoğunluğu doygunluğu olmadığından emin olun.

Eğer öyleyse, kırmızı noktaların sayısı minimuma inecek ancak hücreler ve fagosomlar görülebilecek kadar parlak ve net kalacak şekilde lazer yoğunluğunu azaltın. Bu prosedürde, ImageJ'yi açın ve analiz için seçilen görüntü dosyasını araç çubuğuna yükleyin. İki kanalı birleştirmek için Image, Color ve ardından Make Composite seçeneklerini kullanın.

Sonuçları kaydetmek için bir dosya seçmek üzere sağ tıklayın. Ardından, araç çubuğundaki Çizgi Aracı'na (Line Tool) tıklayın ve genişliği ikiye çıkarmak için çift tıklayın. Bir fagozomun genişliği boyunca bir çizgi çizin, ardından pH değerini ölçmek için sağ tıklayın.

Sitoplazma boyunca bir hat çizilerek sitoplazmik pH aynı şekilde ölçülebilir. Ölçümler tamamlandıktan sonra, Dosyayı Kaydet seçeneğini belirlemek için sağ tıklayın. Fagozom alanını ölçmek için, alanın etrafını serbest elle çizmek üzere araç çubuğundaki dördüncü simgeyi kullanın.

Ardından, Alanı Ölç (Measure Area) seçeneğini belirlemek için sağ tıklayın. Burada, pH değerine karşılık gelen S-1 boyalı fagozomların yaklaşık renklerini gösteren kalitatif bir görsel anahtar yer almaktadır. Sarı renk daha yüksek asiditeyi, kırmızı renk ise daha yüksek alkaliniteyi belirtir.

Bu görüntü, fagositozdan 20 dakika sonra Hvcn1 kanalından yoksun fare kemik iliği nötrofillerini göstermektedir. Fagozomlar oldukça kırmızı, alkali ve şişmiş görünmektedir. Buradaki kırmızı ok hücre içi bir Candida'yı, diğer ok ise hücre dışı bir Candida'yı işaret etmektedir.

Bu görüntü, Candida yutmuş vahşi tip fare kemik iliği nötrofillerini göstermektedir. Bunlar, Hvcn1 nakavt nötrofillere göre çok daha az alkalidir. Bu görüntü, fagositozdan sonraki aynı zaman noktasındaki insan periferik kan nötrofillerini göstermektedir.

Fare yaban tip hücrelerine göre biraz daha alkali görünmektedirler, ancak fagozomlar Hvcn1 nakavt hücreleri kadar büyük ve kırmızı değildir ve bu görüntü, beş mikromolar diphenylene iodonium varlığında Candida fagositozu yapmış insan nötrofillerini göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık dört ila beş saatte tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, nötrofillerin aktive olmaması için izolasyon sırasında dikkatli olunması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Vakuoler veyale sitozolik pH'taki değişimler ile vakuoler hacimdeki değişikliklerin solunumsal patlama (respiratory burst) kaynaklı olup olmadığını belirlemek için, bu solunumsal patlama, serbest radikal üretimini veya oksijen tüketimini doğrudan ölçen diğer yöntemlerle ölçülebilir. Bu videoyu izledikten sonra, insan nötrofillerinin nasıl izole edileceği, ardından fagozom ve sitoplazmanın nasıl boyanacağı ve görüntüleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İnsan kan örnekleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür gerçekleştirilirken eldiven ve koruyucu kıyafet giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.