Nötrofil fagozomun Görüntüleme ve Sitoplazma bir oranlı metrik pH Göstergesi kullanma

Bu yazıda phagosomal pH ve alan olarak rasyometrik göstergesi seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, ya da S-1 kullanılarak, insan ve fare nötrofillerin sitoplazmik pH'ını ölçmek için basit bir yöntem tarif etmektedir. Bu canlı hücre konfokal floresan mikroskop ve görüntü analizi kullanılarak elde edilir.

Bu konfokal mikroskopi tekniğinin genel amacı, nötrofil fagositik vakuol ve sitoplazmanın pH'ını ve alanını görüntülemektir. Bu yöntem, fagositik vakuoldeki ve sitoplazmadaki pH'daki dinamik değişikliklerin ve ayrıca fagositik vakuolün hacminin izlenmesini ve ölçülmesini sağlar. Bu ölçümler, NADPH oksidazın aktivitesi ile değişir ve işlevinin ve fagositik vakuolün zarı boyunca iyon akışlarının vekil belirteçleri olarak kullanılabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, hem fagozom hem de sitoplazmanın aynı anda geniş bir pH aralığına sahip bir boya ile görüntülenebilmesidir. Bu işleme başlamak için, 50 mikrogramını 100 mikrolitre yüksek dereceli DMSO içinde seyrelterek bir karboksi-S-1 süksinimidil ester alikotu hazırlayın. Karıştırmak için iyice girdaplayın.

Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpte 0.1 molar sodyum bikarbonat içinde 10 kere 10 kere bir mililitre veya HK Candida hazırlayın. 2.000 RPM'de bir girdap üzerinde karıştırırken HK Candida'ya her seferinde bir damla 100 mikrolitre karboksi-S-1 ekleyin. Bundan sonra, tüpü alüminyum folyo ile sarın ve bir saat boyunca oda sıcaklığında bir silindire yerleştirin.

Bir saat sonra, HKC-S-1'i her seferinde 10 dakika boyunca 2.250 kez g'de santrifüjleme ile üç kez yıkayın. İlk iki yıkama için, peleti 15 mililitre 0.1 molar sodyum bikarbonat içinde tekrar süspanse edin. Üçüncü yıkamadan sonra, bir mililitre BSS tamponunda tekrar süspanse edin.

HKC-S-1 süspansiyonunu 100 mikrolitrelik alikotların tüplerine aktarın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. İnsan nötrofilleri için HKC-S-1'i opsonize etmek için, 100 mikrolitre çözülmüş HKC-S-1'e 100 mikrolitre insan IGG serumu ekleyin. 60 ila 90 dakika boyunca 37 santigrat derece ve 1.1000 RPM'de bir ısı çalkalayıcı üzerinde ve ardından iki saat boyunca dört santigrat derecede bir silindir üzerinde karıştırın.

Bundan sonra, numuneyi BSS tamponunda üç kez, her biri bir dakika boyunca 17.000 kez g'de santrifüjleme ile yıkayın. Daha sonra, numuneyi 100 mikrolitre BSS tamponunda yeniden askıya alın. İnsan periferik kan nötrofilleri için, sağlıklı bir donörden damar delinmesi yoluyla 15 mililitre kan alın ve mililitre başına 1.000 IU'da 90 mikrolitre heparin sodyum çözeltisi içeren 20 mililitrelik bir şırıngaya aktarın.

Bir pipet ucu kullanarak, şırıngaya 1,5 mililitre% 10 dekstran çözeltisi enjekte edin. Nazikçe üç kez ters çevirin ve ardından 30 ila 60 dakika boyunca bankta dik olarak bırakın. 30 ila 60 dakika sonra, kan, saman renginde bir üst buffy coat tabakası ve eritrosit içeren bir alt tabaka ile kabaca ikiye bölünmelidir.

Üst tabakayı bir iğneden dikkatlice dışarı itin veya bir pipet ucuyla çıkarın, ardından 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve kırmızı tabakayı çıkarmaktan kaçının. Beş mililitrelik bir pipet kullanarak, iki farklı katman elde etmek için tüpün altına, buffy coat katmanının altına üç ila dört mililitre yoğunluk gradyan ortamı ekleyin. Daha sonra, numuneyi 10 dakika boyunca 900 kez g'de santrifüjleyin.

Süpernatanı dökün ve kırmızı peleti geride bırakın. Bunu takiben, peleti rahatsız etmek için hafifçe girdap. Daha sonra, pelete yedi mililitre damıtılmış otoklavlanmış su ekleyin ve peleti yeniden askıya almak için 20 saniye ters çevirin.

Bunu takiben, yedi mililitre 2x salin ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez ters çevirin, kalan kırmızı kan hücrelerini parçalayın, ardından numuneyi beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı dökün ve peleti BSS tamponunda mililitre başına yaklaşık dört kez 10 ila altıya kadar yeniden süspanse edin. Bu prosedürde, oda sıcaklığında 40 ila 60 dakika boyunca her bir oyukta 200 mikrolitre poli-L-lizin içeren sekiz kuyulu bir mikroskopi plakasını ön işleme tabi tutun, daha sonra poli-L-lizini çıkarın ve kuyucukları iki kez 200 mikrolitre damıtılmış su ile yıkayın.

Daha sonra, her bir oyuğa 200 mikrolitre hazırlanmış hücre süspansiyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika inkübe edin. Bundan sonra, bir tüpe 100 mikrolitre yüksek dereceli DMSO ekleyerek ve karıştırmak için girdap yaparak bir S-1-ester alikotu hazırlayın. Küçük bir tüpe 1.7 mililitre BSS tamponu ve 20 mikrolitre S-1-ekleyin ve karışımı girdaplayın.

Daha sonra, kuyucukları 200 mikrolitre BSS tamponu ile iki kez yıkayın ve tamponu S-1-çözeltisi ile değiştirin. Sıvıyı kuyuların duvarından aşağı nazikçe pipetleyerek kuyu dibine bağlı hücre tek tabakasını rahatsız etmemeye dikkat edin. Daha sonra, numuneyi oda sıcaklığında en az 25 dakika inkübe edin.

Bunu takiben, kuyuları 200 mikrolitre BSS tamponu ile iki kez yıkayın. Bir inhibitörü test etmek için, BSS tamponunda uygun ilacın bir ana karışımını oluşturun ve kuyuları iki kez yıkayın. Daha sonra, opsonize HKC-S-1'i beş mikronda yaklaşık üç saniye boyunca sonikasyon yapın ve her bir oyuğa 10 mikrolitre ekleyin, daha sonra plakayı 15 ila 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, hücreleri fagositozun anlık görüntüleri için görüntülenmeye hazır hale getirin.

Konfokal bir mikroskop kullanarak, lazer dalga boyunu, hücreler 555 nanometrede uyarılacak ve emisyon 560 ila 600 nanometrede ve 610 nanometrenin üzerinde iki dedektör tarafından algılanacak şekilde ayarlayın. Ardından, 63X yağa daldırma lensi kullanarak hücreleri görüntüleyin. Ortadaki döşemeyi görüntülemek için sürekli ayarda bir döşeme tarama görüntüsü kullanın.

Floresan yoğunluğunu ve dedektör kanallarının kazancını kullanarak, görüntüyü optimize etmek için lazerin odağını ve yoğunluğunu ve iki kanalın kazancını ayarlayın. Bundan sonra, her iki kanalı da görüntülemek için ayarları kullanarak görüntüyü bölün. Deneye başlamadan önce, sitoplazmada veya vakuollerde kırmızı noktalar olarak görünecek olan floresan yoğunluğunun doygunluğu olmadığını kontrol edin.

Eğer öyleyse, lazer yoğunluğunu azaltın, böylece minimum sayıda kırmızı nokta olur, ancak hücreler ve fagozomlar görülebilecek kadar parlak ve net olur. Bu yordamda, ImageJ'yi açın ve analiz için seçilen görüntü dosyasını araç çubuğuna yükleyin. İki kanalı birleştirmek için Görüntü, Renk'i ve ardından Bileşik Yap'ı kullanın.

Sonuçları saklamak üzere bir dosya seçmek için sağ tıklayın. Ardından, araç çubuğundaki Çizgi Aracına tıklayın ve genişliği ikiye çıkarmak için çift tıklayın. Bir fagozomun genişliği boyunca bir çizgi çizin ve ardından pH'ı ölçmek için sağ tıklayın.

Sitoplazmik pH, sitoplazma boyunca bir çizgi çizilerek aynı şekilde ölçülebilir. Ölçümleri bitirdikten sonra, Dosyayı Kaydet'i seçmek için sağ tıklayın. Fagozom alanını ölçmek için, alanın etrafında serbest el çizmek için araç çubuğundaki dördüncü simgeyi kullanın.

Ardından, Ölçüm Alanı'nı seçmek için sağ tıklayın. İşte pH'a karşılık gelen S-1 lekeli fagozomların yaklaşık renginin nitel bir görsel anahtarı. Sarı renk daha fazla asitliği, kırmızı ise daha fazla alkaliniteyi gösterir.

Bu görüntü, fagositozdan 20 dakika sonra Hvcn1 kanalından yoksun fareye bağlı ilik nötrofillerini göstermektedir. Fagozomlar çok kırmızı, alkali ve şiş görünür. Buradaki kırmızı ok hücre içi bir Candida'yı, bu ok ise hücre dışı bir Candida'yı işaret ediyor.

Bu görüntü, Candida'yı yutmuş vahşi tip fare kemik iliği nötrofillerini göstermektedir. Hvcn1 nakavt nötrofillerinden çok daha az alkalidirler. Bu görüntü, fagositozdan sonraki aynı zaman noktasında insan periferik kan nötrofillerini göstermektedir.

Fare vahşi tip hücrelerden biraz daha alkali görünürler, ancak fagozomlar hala Hvcn1 nakavt hücreleri kadar büyük ve kırmızı değildir ve bu görüntü, beş mikromolar difenilen iyodonyum varlığında Candida'yı fagosite eden insan nötrofillerini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yaklaşık dört ila beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, nötrofilleri aktive etmemeleri için izole ederken dikkatli olmayı unutmamak önemlidir.

Vakuolar veya sitozolik pH veya vakuolar hacimdeki değişiklikler üzerinde görülen etkilerin solunum patlamasındaki değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için, bu solunum patlaması, serbest radikal üretimini veya oksijen tüketimini doğrudan ölçen başka yollarla ölçülebilir. Bu videoyu izledikten sonra, insan nötrofillerini nasıl izole edeceğinizi, ardından fagozom ve sitoplazmayı nasıl boyayacağınızı ve görüntüleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. İnsan kan örnekleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven ve koruyucu giysi giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.