Astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı Vitro iskemik benzeri koşullar altında izleme

Aşağıdaki protokol, oksijen glikoz yoksunluğu veya OGD gerçekleştirmek için yavru sıçanların beyinlerinden bir birincil astrositin izolasyonunu göstermeyi amaçlamaktadır. Saflaştırılmış astrositlerin oksijen glikozdan yoksun ortama maruz kalması, iskemik inmelerde bulunan bazı koşullara reaksiyonu test etmemizi sağlayan bir modüldür. Oksijene maruz kaldıktan sonra metodik değişiklikler, glukoz yoksunluğu, GFAP gibi seçici astrosit belirteçleri kullanılarak gözlemlenebilir ve ölçülebilir.

Özetle, iskemik benzeri koşullara maruz kalan bu izole hücreler, hipoksik koşullarda aktive olan yeni parça yollarını ve iskemik inmeye karşı koruma sağlayan diğer ilaçları test etmek için kullanılabilir. Protokolün bu bölümünde astrositler yavru sıçan kortekslerinden izole edilecektir. Bu prosedürün amacı, oksijen glikoz yoksunluğu deneylerini gerçekleştirmek için birincil bir astrositik hücre kültürü elde etmektir.

Bu prosedür için malzemeler şunlardır, Bu prosedürde kullanmadan önce tüm malzemeleri otoklavlayın. Ve protokole başlamadan önce davlumbazı en az 20 dakika UV ışığına maruz bırakın. Bu prosedüre başlamak için, her plakaya üç ila beş mililitre tam DME ortamı pipetleyin.

Her fare beyni için bir tane, tüm korteksler için iki ve meninksler olmadan tüm korteksler için üç olmak üzere aşağıdaki gibi bölünecektir. % 70 etanol ile dezenfekte ettikten sonra bir yavrunun kafasını ayırın. Başın arkasından başlayarak buruna doğru bir kesi yapın.

Kafatasını kavisli forsep ile çıkarın ve korteksleri açığa çıkaran beyinciği nazikçe kazıyın. Açıkta kalan beyinleri bir cımbızla çıkarın ve beyni ortamla birlikte ilk petri kabına yerleştirin. Diğer tüm yavrular için bu adımları tekrarlayın.

Mikro diseksiyon forsepslerinin keskin ucu ile orta hat fissürü boyunca hafifçe bölerek serebral hemisferleri ayırın. Cımbızı kullanarak kıstırma hareketiyle beyaz maddeyi ve hipokampusu çıkararak korteksleri soyun ve geride bırakın. Soyma kortekslerini iki numaralı etiketli petri kabına aktarın.

Petri kabındaki tüm disseke korteksleri birleştiren tüm beyinler için prosedürü tekrarlayın. Ortamı tüm korteksler arasında eşit olarak dağıtmak için tabağı hafifçe sallayın. Soyulmuş korteksleri kaplayan meninksleri tanımlamak için diseksiyon mikroskobunu kullanın.

Meninksler, dokuyu çevreleyen küçük kırmızı kılcal damarlar aranarak tanımlanabilen çok ince şeffaf bir tabakadır. Korteksleri kaplayan meninksleri dikkatlice inceleyin ve çıkarın ve her korteksin her iki tarafında ince cımbız kullanarak bunları tek tek kortikal loblardan nazikçe soyun. Temiz korteksleri üç numara etiketli yeni bir petri kabına yerleştirin.

Mide veya blender yöntemini kullanarak doku ayrışması için, temiz, soyulmuş korteksleri ve ortamı petri kabından steril bir blender torbasına dökün. Ve torbanın toplam hacmini beş mililitreye çıkarmak için yeterli medya ekleyin. Torbayı, kapalı kapının üzerinde torbanın yaklaşık iki santimetresi görünecek şekilde mide 80'e yerleştirin.

Bu cihazdaki hücre ayrışması, yüksek hızda 2,5 dakika sonra yapılır. Alternatif olarak, steril torbayı kapatarak ve doku parçacıkları ince bir süspansiyon haline gelene kadar dokuyu başlıktaki bir beher ile hafifçe döverek doku ayrışması yapılabilir. Sürtünmeyi ve torbanın kırılmasını önlemek için torba ile beher arasında bir bez kullandığınızdan emin olun.

Hücre süspansiyonunu, ağ numarası 60 olan manşonun ortasına dökün. Filtrelenmiş hücreleri 100 numaralı bir ağın ortasına dökün ve yerçekimi ile filtrelemesine izin verin. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün.

Merkez füje, hücre süspansiyonunu 200 kez G'de, tercihen beş dakika boyunca bir döner kova yönlendirici ile bir merkez füje içinde. Süpernatanı çıkarın ve bir behere atın. Hücre paletine tamamen taze ortam ekleyin.

Serolojik bir pipet kullanarak, hücre paletini en fazla beş mililitre ortamda yeniden süspanse edin ve ayırın. İstenilen miktarda hücre süspansiyonunu bir şişeye ekleyin ve medya ile tamamlayın. Yeniden askıya alınan paleti orta ile şişeye ekleyin.

Hücreleri şişe boyunca eşit olarak dağıtın ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Medyayı her üç günde bir değiştirmeyi unutmayın. Aşağıdaki metodoloji, kontrollü bir ortamda hücreleri oksijen ve glikozdan mahrum bırakmayı amaçlamaktadır.

Bu modelin amacı, iskemik benzeri bir inme durumunda astrositlerin tepkisini incelemektir. Bu prosedür için kullanılan malzemeler, gaz sistemine bağlı serolojik bir pipet yerleştirerek glikoz içermeyen ortamı boşaltın. Çözeltiyi gaz karışımı ile dakikada 10 ila 15 litrelik bir akışta 10 dakika boyunca köpürtün.

10 dakika tamamlandıktan sonra OGD ortamının pH'ını 7.4'e ayarlayın. 50 mililitrelik tüp filtre sistemini kullanarak temizlenmiş glikoz içermeyen ortamı filtreleyin. Her deney için her zaman yeni OGD ortamı yapmak önemlidir.

Bu, ortamın oksijenden arındırılmasını sağlayacaktır. Astrosit ortamını çıkarın ve hücrelerden glikozu çıkarmak için hücresel PBS ile iki kez yıkayın. OGD ortamını kuyucuklara ekleyin.

Çok kuyulu tabağı, kapağı açık olarak hipoksi odasının içine yerleştirin. Gaz karışımını giriş vanasına bağlayın ve çıkış vanasını açık bırakın. Hazneyi gaz karışımı ile dakikada 10 ila 15 çöpte beş ila yedi dakika yıkayın.

Gaz akışını durdurun ve önce çıkış vanasındaki kelepçeyi kapatın. Ardından, gaz giriş valfi borusundaki kelepçeyi kapatın. Hipoksik odayı, OGD'de istenen süre boyunca 37 santigrat derecede hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

İnkübasyon süresi sona erdikten sonra, OGD ortamını aspire edin ve normoksik durum için hücrelere dikkatlice tam DMEM ekleyin. Hücreleri sıfır 24 ve 48 saatlik normoksik koşullar için kültür inkübatörüne geri koyun. Bu protokol, astrositlerin yenidoğan sıçan kortekslerinden izolasyonunu tanımlar.

Birincil kültürlerin saflığı doğrulandıktan sonra OGD deneyleri yapıldı. Bu iskemik benzeri modelde, glukoz ve oksijen yoksunluğu, GFAP gibi astrositik belirteçler veya PCNA gibi proliferasyon belirteçleri kullanılarak immünofloresan tarafından izlenen daha folojik bir değişikliğe neden oldu. Bu modelin avantajlarından biri, belirli bir hücre tipi yanıtını incelememize izin vermesidir.

Bu teknikteki sınırlılık, astrositlerin izolasyonu nedeniyle hücreden hücreye etkileşimin olmamasıdır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmenin olası yollarından biri, astrositleri diğer hücre tiplerinden veya bir ko-kültürden gelen koşullara maruz bırakmaktır. Özetle, izole edilmiş bir hücre sisteminde oksijen glikoz yoksunluğu yöntemi, farklı nöral koruyucu veya nörotoksik moleküllerin etkilerini doğrudan test etmemizi sağlar.

Ayrıca, astrosit biyolojisini incelemek için geçerli bir araçtır. Son olarak, bu model, in vivo modeller kullanarak deneysel koşullarda gelişimsel ilaçları incelemek için güçlü bir temel oluşturmaktadır.