Tümör ilişkili damarlara kullanmanın intravital mikroskobu gelişmiş Dorsal deri kıvrım pencere Chambers transgenik floresan fareler üzerinde

Bu protokolün genel amacı, bir fare modelinde tümörle ilişkili vaskülatür gelişimini ayrıntılı olarak incelemek için gelişmiş bir dorsal deri kıvrım odası kullanmaktır. Bu yöntem, tedavinin iyileştirilmesi ve tümörün ilerlemesinin anlaşılması gibi kanser alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, süreçlerin doğru bağlamda, gerçek hayatta incelenmesi ve bu süreçlerin zaman içinde incelenebilmesidir.

Bu prosedür, laboratuvarımdaki kıdemli araştırmacı Doktor Ann Seynhaeve tarafından gösterilecek. Transgenik olmayan bir donör fareden, alıcı farenin dorsal pencere odasına implantasyon için 10 mm çapında nekrotik olmayan bir tümör parçası toplayın. Sinjeneik bir tümör için normal bir fare donörü veya bir ksenogreft için immün yetmezliği olan fare donörü kullanın.

Alıcı fare en az 12 haftalık olmalı ve yirmi veya daha fazla gram ağırlığında olmalıdır. Tüm cerrahi prosedürleri aseptik koşullar altında gerçekleştirin. Örneğin, cerrahi aletleri ve hazne malzemelerini otoklavlayın.

Alıcı fareyi sakinleştirdikten sonra, elektrikli bir düzeltici kullanarak tüm sırt tarafındaki tüyleri alın ve ardından tüy dökücü jel kullanın. Cildi durulayın, temizleyin ve kurulayın. Son olarak, tüyleri alınmış cildi etanol ile ovalayın.

Şimdi, omurga boyunca yatay bir merkez çizgisini işaretleyin. Ardından, görünüm penceresini çizginin en az 2 mm altına yerleştirin ve pencerenin çevresini dış görünüm üzerinde işaretleyin. Daha sonra, bir neşter ve makas kullanarak, alttaki fasyaya zarar vermeden çevre çizgisi içindeki cildi dikkatlice çıkarın.

Ardından, deri kıvrımını yukarı çekin ve pencereyi yerinde tutan cıvatalar için pencere alanının her iki yanında 1 mm'lik delikler açmak için bir kulak zımbası kullanın. Arka çerçeveyi farenin üzerine yerleştirin ve somunları cıvataların üzerine yerleştirerek çerçeveyi sabitleyin. Ardından, oturduğundan emin olmak için cildi çerçevenin iki ila üç milimetre üzerine çekin.

Eğer öyleyse, çerçevenin üst kısmındaki iki dikiş deliğinden 23 gauge iğne batırın. Somunları sıkarak çerçeveyi sabitleyin ve sıkıştırma iğnesi tutucuları ile tutun, somunları aşırı sıkmayın ve cildin cıvataların etrafında dönmesini önleyin. Ardından, çerçeveyi cilde sabitlemek için iğneleri dikişlerle değiştirin.

Şimdi fareyi yana çevirin. Bu açıdan kalın bir dolgu camı parçası ve standart bir 12 milimetre kapak camı yerleştirin. Her ikisini de bir tutma halkası ile sabitleyin, böylece ön pano cama sıkıca sarılır.

Bir sonraki adım, pencereyi %0,9 sodyum klorür kullanarak nemlendirmektir. Görüş alanına birkaç damla düşmesine izin verin ve fazlalığı emdirin. Şimdi, pencerenin hemen altında, fasyada bir milimetre küp tümör dokusunu tutabilecek derin bir cep yapmak için 90 derecelik bir bükülmeye sahip 25 gauge bir iğne kullanın.

Daha sonra tümör dokusunu cebe yerleştirin. Son olarak, standart bir 12 milimetre kapak camı ve bir tutma halkası kullanarak pencere görüş alanını kapatın. Herhangi bir hava kabarcığı bir saat içinde dağılacaktır.

Fareyi sakinleştirmeden önce, özel yapım sıcaklık kontrollü bir platformu 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Fareyi sakinleştirdikten sonra, ısıtılmış platformun üzerine yerleştirin. İzofluran vermek için bir nosekon takın ve değerlendirme beş dakikadan fazla sürecekse, oftalmik bir randevu uygulayın.

Şimdi, pencerenin cıvatalarını kullanarak hazneyi özel yapım tutucuya cıvatalayın ve tutucuyu platforma sabitleyin. Ardından cam pencereyi su ve pamukla temizleyin. Şimdi, mikroskopta, parlak alan ve flüoresan ışığı altında 10 kez objektifi kullanarak tümördeki damar gelişimini kontrol edin.

Brüt muayeneden sonra, konfokal lazerleri açın. Mikroskop kontrol panelini tur başına 100 voltluk akıllı bir kazanca ayarlayın. Tur başına %10'luk akıllı ofset, orta yakınlaştırma orta X ve Y konumlandırma ve tur başına 100 mikron Z konumu.

Alım modunu XYZ veya XYZT olarak ayarlayın. Bir çözünürlük seçin. İki veya 400 Hertz'lik bir çekim hızı seçin.

İğne deliğini havadar bir üniteye ayarlayın. Ve çift yönlü X seçeneğini seçin. Olası bir örtüşen spektral aralığa sahip birden fazla floroforu değerlendirirken, sızıntıyı önlemek ve doğru ışın yollarını ayarlamak için çerçeveler arasında sıralı taramayı seçin.

Çizgi ortalamasını dört olarak ayarlayın ve son olarak deney için yeni bir veri seti seçin. Şimdi, bunu yaparken ilgilenilen dokuya odaklanın, daha yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip kuru lensler kullanmak en iyisidir. Ardından, kazancı ve ofseti aşırı pozlamanın olmadığı bir yere ayarlayarak mümkün olan en iyi sinyal-gürültü oranını elde etmek için hızlı canlı taramayı kullanın.

Şimdi, edinme sekmesinde Z yığınını seçin. Hızlı bir Z taraması yapın. Hızlı taramadan, tam taramanın başlangıç ve bitiş konumlarına karar verin.

Ardından, Z adım boyutunu iğne deliği boyutuna göre ayarlayın ve tam taramaya devam edin. Floresan etiketleri eksprese eden konakçı fareler, tarif edilen protokol kullanılarak tümör implantasyonundan sonra görüntülendi. eNOStag-GFP etiketi, Golgi'de ve endotel hücrelerinin hücre zarında ifade edilir.

ROSAmT/mG etiketi, Cre Rekombinaz eksprese eden hücrelerde her yerde kırmızı floresan ve yeşil floresan ifade eder. Bu teknolojinin bir uygulaması, tümörlerde tüm aşamalar görüldüğü için damar gelişiminin incelenmesi içindir. Örneğin, endotel cephelerinin vaskülarize olmayan alanlara filizlendiği görülebilir.

Tümörler ayrıca hasarlı damarlara ve olgun dallı damarlara sahip vasküler yataklara sahiptir. Başka bir uygulama, floresan yapan nanopartiküller gibi kana etiketler uygulayarak lümen oluşumunu, kan akışını ve ekstravazasyonu incelemektir. Böylece damar tüplerinin lümeninde ve endotel ucu hücrelerine yakın kan akımı gözlenebilir.

Uç hücrelerde, stokta bir lümen oluşumu gözlenebilir. Kemoterapötik ajanların etkisini araştırmak için intravital mikroskopi de kullanılabilir. Örneğin, bir eNOStag-GFP hayvanına nanopartikül enjeksiyonundan 24 saat sonra, nanopartiküller tümör interstisyumuna minimal ekstravazasyon ile vaskülatürde kaldı.

Bununla birlikte, nanopartiküller TNF ile kombinasyon halinde uygulandığında, tümör interstisyumuna ekstravazasyon gözlendi. Bu, tümörler arası ilaç dağıtımında bir artış olduğunun kanıtıdır. Bu videoyu izledikten sonra, dorsal deri kıvrımlı pencere odasının nasıl kurulacağını ve konfokal mikroskopi kullanarak tümörle ilgili süreçleri nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.