Kurbağa Sinir Uçlarına Sinir Kütüğü Vasıtasıyla Kalsiyum Boyası Yükleme: Kurbağa Nöromüsküler Kavşağında Kalsiyum Geçici Kayıt

Merhaba, benim adım Dimitry Samigullin, Rusya Bilim Akademisi, Kazan Biyokimya ve Biyofizik Enstitüsü Sinaptik Süreçlerin Biyofiziği laboratuvarında çalışıyorum. Laboratuvarımızda, Nöromüsküler Kavşakta kalsiyum sinyalizasyonunun geniş yollarını inceliyoruz. Sinaptik kalsiyum seviyesini ölçmek için en ulaşılabilir yöntemlerden biri optik bir kayıttır.

Burada, kalsiyuma duyarlı bir boyanın, bir sinir kütüğü aracılığıyla, kurbağa sinir uçlarına yüklenme yöntemini açıklıyoruz. Ayrıca, kurbağa terminallerinde geçici bir kalsiyum miktarını ölçmek ve analiz etmek için protokolü sunuyoruz. Bu yöntemi kullanarak, aktif ilaçların sinaptik aktivite sırasında kalsiyumun presinaptik seviyesi üzerindeki etkisini incelemek mümkündür.

Boya yükleme çözeltisinin hazırlanması. Fluorescein'in Kalsiyum Boyası Oregon Yeşili BAPTA, az miktarda 500 mikrogram toz ile 500 mikrolitre halinde gelir. Toza HEPES içeren 14 mikrolitre çözelti ekleyin.

Vorteks yükleme çözeltisi ve iyice karıştırmak için aşağı döndürün. Işığa maruz kalmamak için şişeyi yükleme solüsyonu ile folyo ile sarın. Yükleme solüsyonunu eksi 20 santigrat derecede bir dondurucuda saklayın.

Boya yükleme prosedürü. Hayvandan bir kutanöz pektoris kasını inceleyin. Disseke edilmiş dokuyu gümüş kaplı bir Petri kabına monte edin.

Dokuyu ince paslanmaz çelik pimlerle gerin. Ringer solüsyonunu Petri kabına ekleyin. Bir tıraş bıçağı kullanarak, on mikrolitrelik pipet tüpünün ince ucundan yaklaşık 2 milimetrelik küçük bir parça kesin.

Doldurma pipetini Petri kabında tutmak için bir parça hamuru hazırlayın. Doldurma pipetini plastik bir şırınga ile silikon bir tüp ve pipet tüplerinden yapılmış adaptörler aracılığıyla bağlayın. Geçici Ringer solüsyonunu plastik bir pipetle Petri kabından çıkarın.

Bir şırınga ile kuru hazırlık. Bu, çözeltinin doldurma pipetinde emilmesini önleyecektir. Yükleme solüsyonu içeren şişeyi dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında karanlık bir yerde çözülmeye bırakın.

İnce bir cımbız ve makasla, gözle kontrol altında, steril mikroskop ile kasın yakınından siniri kesin. Yaklaşık iki milimetre sinir kütüğü bırakın. Doldurma pipetini bir tüp ve şırınga ile hamuru kullanarak Petri kabına sabitleyin.

Sinir dalına yaklaştırın. Doldurma pipetindeki sinir kütüğünü nazikçe aspire edin. Emme borusunu doldurma pipetinin kör ucundan çıkarın.

Doldurma pipetindeki sinir kütüğünü şırınga ile kurutun. Doldurma pipetini sinir kütüğü ile yukarı doğru hareket ettirin. Sinir kütüğünü dışarıdan vazelin ile izole edin.

Bir kez daha, doldurma pipetindeki sinir kütüğünü şırınga ile kurutun. Uzun pipet ucu olan bir pipet kullanarak sıfır noktası beş mikrolitre yükleme solüsyonunu çizin. Yükleme solüsyonunun bulunduğu pipet ucunu nazikçe doldurma pipetine yerleştirin.

Karışımı doğrudan sinir kütüğüne boşaltın. Doldurma pipetinin açık ucunu Vazelin ile kapatın. Petri kabına az miktarda çözelti ekleyin.

Preparasyonu oda sıcaklığında karanlık ve ıslak bir yerde beş saat inkübe edin. İnkübasyon işleminden sonra, hazırlığı alın ve doldurma pipetini yükleme solüsyonu ile çıkarın. Preparasyonu bir banyoya yerleştirin ve Ringer solüsyonu ile yıkayın.

Hazırlandığı banyoyu gece boyunca sekiz santigrat derece sıcaklıkta bir buzdolabında saklayın. Dokuyu mikroskopi için hazırlayın. Hazırlığı banyodan alın.

Hazırlığı gümüş kaplı bir odaya monte edin ve dokuyu hafifçe gerin. Dokuyu taze Ringer solüsyonu ile durulayın. Emme stimülasyon elektrodunu alın.

Stimülasyon Emme Elektrodunu, ucu sinirin kesilen ucuna yakın olacak şekilde hazneye yerleştirin. Siniri elektroda çekin. Elektrotun yapımı Khazokoff'un makalesinde anlatılmıştır, makaleye bir bağlantı malzemelerde bulunmaktadır.

Hazırlık odasını mikroskop tablasına sabitleyin. Sıcaklık probunu yerleştirin. Hazırlama odasındaki Peltier elemanı için giriş borularını bir güç kablosuna bağlayın.

Çıkış borusunu hazırlama odasına yerleştirin. Bir perfüzyon pompasını açın. Terim kontrol ünitesini açın.

Kontrol ünitesindeki sıcaklığı 20 santigrat dereceye ulaşacak şekilde ayarlayın. Ultraviyole koruma kalkanı takın. Stimülatör üzerindeki gecikme süresini ve periyodu ayarlayın.

Emme elektrodundan bir kabloyu stimülatör ile bağlayın. Aç onu. Düşük büyütme hedefi altında, uyaranı açarak kas kasılmasını kontrol edin.

Perfüzyon sistemini düşük kalsiyum ve yüksek magnezyum içeren bir Ringer solüsyonu ile doldurun. Perfüzyon hızını dakikada yaklaşık iki mililitre olarak ayarlayın. Objektifi 40 kat büyütme ile değiştirin.

Polychrome V.Select emisyon dalga boyunu ve sürekli mod aydınlatmasını açın. Deklanşörü açın. 40 kat büyütme hedefinin altında, floresan modunda aydınlatmalar terminallerin yüklü olmasını sağlar.

Terminali bulun ve ona odaklanın. Yüklü sinir ve iyi yüklenmiş motor sinir terminalleri şekilde gösterilmiştir. Kırmızı-Kısa Nöro CCD Kamera ile video çekimi.

Turbo-SM yazılımını çalıştırın. Ayarları değiştir'i seçin. Giriş çerçeve sayısı 500'dür.

Deneme adını girin. Temel yapılandırma saniyede 1000 karedir. 80'e 80.

Harici tetikleyiciyi seçin. Tetikleme öncesi zamanı girin. Eksi on milisaniye.

Tekrar sayısını girin, 20. Polychrome yazılımında, harici tetik aydınlatma modunu seçin. Clampex yazılımını çalıştırın.

Yük stimülasyon protokolü. Protokol, Kazan Federal Üniversitesi web sitesindeki laboratuvar sayfamızdan indirilebilir. Kayıttan önce Turbo-SM yazılımında karanlık bir kare yakalayın.

Trinoküler küp üzerinde ışık yolu değişim seviyelerini seçin. Kamera için yüzde 100. Stimülasyon protokolünü çalıştırın.

İlgilendiğiniz bölgeyi seçin ve sinyali kontrol edin. Sinir stimülasyonuna yanıt olarak, sinir ucuna kalsiyum girişini yansıtan floresan yoğunluğunun değişimini kaydediyoruz. Veri analizi.

Turbo-SM yazılımında dosyayı seçin. Ardından, ortalama dosyaları seçin. Dosyaları seçin.

Ortalama dosyanın adını girin ve ortalamasını alın. Ortalama dosyayı uygun dosya olarak kaydedin. Seçin, uygun dosya olarak kaydedin.

Dosya adını girin ve kaydedin. Image J'yi çalıştırın ve aşağıdaki enstrümanları açın. Analiz, araçlar, ROI Yöneticisi.

Kaydedilmiş ortalama dosyayı uygun biçimde bulun. Daha iyi bir görünüm için pencereyi yakınlaştırın ve Görüntü J.Zoom'a sürükleyip bırakın. Arka plan olduğuna inandığınız şeyin üzerinde dikdörtgen bir ilgi alanı seçin.

ROI yöneticisine ekleyin. ROI yöneticisinde daha fazlasını seçin. Çok ölçülü. Yükleme ortalaması.

Verileri kopyalayın, Excel'e aktarın. Excel'de, bir oran için arka planın ortalama değerini hesaplamak için ortalama işlevini kullanın. Excel'i kapatmadan, Görüntüye dönün J.Kaydetmeden arka plan hesaplaması ile pencereyi kapatın.

ROI Manager'ı kullanın, dikdörtgen arka plan çizimini silin. Açık enstrüman süreci, matematik, çıkarma. Excel'den hesaplanan ortalama eşik değerini girin ve yığınlardan zemini çıkarın.

Bir sinir terminali etrafında dikdörtgen bir ilgi alanı seçin. ROI Manager'a ekleyin. ROI Yöneticisi'nde, daha fazlası, Çoklu ölçüm, yükleme azaltma, ortalama'yı seçin.

Excel penceresinde kopyalayın ve yapıştırın. Excel enstrüman çizim grafiğini kullanın. Sinyali başlatmadan önce düz bir alan seçin.

Grafiği, geri kalan ilk floresan değerlerinden sinyalin başlangıcına kadar olan ayrıntılarla yükleyin. Ardından, ortalama dinlenme floresan değerlerine nokta sayısını belirleyin. Bu değerlerin ortalamasını alın, ardından geri kalan floresan ortalama sayısını bulun.

Geri kalanında sinyalleri floresan ile bölün. Birini çıkarın ve yüzde 100 ile çarpın. Sinyali çizin ve geçici kalsiyum genliğini hesaplayın.

Floresan sinyallerinin zaman parametreleri, kalsiyum-boya-kompleks oluşumunun ileri ve/veya geri reaksiyonlarının hızına bağlıdır. Kalsiyum sinyalinin yükselme süresi, kalsiyum girişinin dinamiklerini temsil eder. Terminalde difüzyon ve boya ile kalsiyum etkileşimi.

Kalsiyumun geçici bozunması, boya afinitesine ve kalsiyum tamponlama hızına ve geri çekilmesine bağlıdır. Kalsiyum geçici genliğinin analizi, nörotransmitter salınımına katılan kalsiyum girişi üzerindeki farklı aktif maddelerin etkisini incelemek için kullanılabilir. Bu yükleme tekniği, sitozomal kalsiyumdaki değişikliklerin görüntülenmesi için çok uygundur.

Floresan göstergeler ve hem tek sinir stimülasyonu hem de ritmik sinaptik aktivite ile. Kalsiyum geçici genliğinin analizi, farklı maddelerin nörotransmitter salınımına katılan kalsiyum girişi üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir. Dikkat etmek istediğimiz bazı önemli noktalar var.

Kuluçka prosedürü iki aşamadan oluşur. Oda sıcaklığında ve buzdolabında inkübasyon. Boya ile zaman inkübasyonunu oda sıcaklığında kontrol etmek önemlidir.

Sinir kütüğünün uzunluğuna, boyaya ve odadaki sıcaklığa bağlı olarak kuluçka süresi değişebilir. Ameliyat öncesi terminalleri ve proksimal kısımları, sinir kütüğüne yakın aşırı pozlama yaparsanız, aşırı yüklenebilir. Buzdolabındaki uzun inkübasyon nedeniyle, boya sinir uçları boyunca eşit olarak dağıtılır.

Boyanın sinire girmesine izin vermek için sinirin boya yükleme solüsyonuna yerleştirilmesi önemlidir, çünkü daha uzun zaman aralıkları, muhtemelen kapalı sinirin alınması nedeniyle etkisiz yükleme üretti. Boya bölümlendirmesini azaltmak için, boyanın genişletilmiş formunu kullanmak mümkündür. Dokunun uzun floresan aydınlatmasını önlemek çok önemlidir, çünkü hayatta kalmasını etkiler.

Terminalleri aramak için görünür ışık kanalında Nomarski optiklerini kullanıyoruz. Kayıt sırasında, aydınlatmalı görüntüyü diyafram ile sınırlandırıyoruz. Sinirin deklanşör damgası kullanılarak uzun yükleme işlemi süresi azaltılabilir.

Bu durumda, cam mikro baypas kullanılabilir.