Name: Kurbağa Sinir Uçlarına Sinir Kütüğü Vasıtasıyla Kalsiyum Boyası Yükleme: Kurbağa Nöromüsküler Kavşağında Kalsiyum Geçici Kayıt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 5 s
Description: Öğrenin, kurbağa sinir uçlarına sinir kütüğü vasıtasıyla kalsiyum boyası yükleme ve kalsiyum geçici kayıt yöntemini. Bu teknik, sinaptik iletimdeki kalsiyum sinyallerini ve ilaç etkilerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, Rusya Hükümeti tarafından Kazan Federal Üniversitesi&#39;nin Rekabetçi Büyüme Programı ve Rusya Temel Araştırma Vakfı tarafından yapıldı (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983). Makalenin daha önceki taslaklarında yararlı yorumlar sağlamaktan dört anonim gözden geçirene teşekkür ediyoruz. Ses kayıtları için Yuliya Aratskaya&#39;ya şükranlarımızı sunarız. Victor Ilyin&#39;e el yazmasının son düzenleme ile ilgili çok faydalı yorum ve yardım için minnettarız.

Deneyler Rana ridibunda kurbağasından muskulus kutanöz pektorisin izole edilmiş sinir-kas preparatları üzerinde gerçekleştirildi. Her iki cinsiyetteki hayvanların büyüklüğü yaklaşık 5-9 cm&#39;dir. Deneysel prosedürler, NIH Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu&#39;na uygun olarak, Kazan Federal Üniversitesi ve Kazan Tıp Üniversitesi&#39;ndeki laboratuar hayvanlarının kullanımına ilişkin esaslara uygun olarak gerçekleştirildi. Deneysel protokol Avrupa Toplulukları Konseyi 86/609 / EEC sayılı Direktifin gerekliliklerini karşıladı ve Kazan Tıp Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylandı. 1. Çözümlerin Hazırlanması <ol><li> Ringer solüsyonunun hazırlanması. <ol><li> Ringer solüsyonunu hazırlayın: 113.0 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 3.0 mM NaHC03 ve 1.8 mM CaCl2. PH&#39;ı 7.2-7.4&#39;e ayarlayın. </li><li> Ringer solüsyonunu düşük bir Ca 2+ ile hazırlayın </Yüksek Mg2 + içeriği: 113.0 mM NaCl, 2.5 mM KCI, 3.0 mM NaHC03, 6.0 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2. PH&#39;ı 7.2-7.4&#39;e ayarlayın. </li></ol></li><li> Boya yükleme çözeltisinin hazırlanması. <ol><li> HEPES-Na içeren su bazlı çözeltiyi 10 mM&#39;de hazırlayın (pH 7.2-7.4). </li><li> Boya 30 ile bir şişeye 14 uL HEPES çözeltisi ekleyin. NOT: Ca 2+ gösterge boyası, 500 μL toz ile 500 μL&#39;lik bir şişeye gelir. </li><li> Harca karıştırın ve karıştırarak iyice karıştırın. </li><li> Ca 2+ göstergesinin nihai konsantrasyonunu 30 mM&#39;ye düşürmek için çözeltiyi seyreltin. Işıktan kaçının ve -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Boya yükleme prosedürü <ol><li> Kutanöz pectoris kasını pektoralis proprius sinir parçasıyla ayırın . NOT: Diseksiyon prosedürü mevcutturBlioch ve ark. Tarafından ücretsiz olarak indirilen bir makalede . , 1968 31 . <ol><li> Diseksiyon prosedürü için iki ince forseps ve kornea makası kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın). Diseksiyonlanmış dokuyu silikon elastomer kaplı bir Petri kabına, Ringer çözeltisi ile önceden doldurulmuş halde aktarın ve dokuyu hafifçe paslanmaz çelik iğnelerle, çanakta biraz gergin olacak şekilde düzeltin. </li><li> Petrol kabını Ringer solüsyonunun taze bir miktarı ile tekrar doldurun. Bağ dokularını çıkarın. Sinire zarar vermeyin. </li></ol></li><li> Dolum pipetini hazırlayın: Tıraş bıçağı kullanarak, standart plastik 10 μL pipet ucunun konik kısmının ~ 2 mm uzunluğundaki parçasını kesin. </li><li> Petri kabındaki dolum pipetini takmak için bir parça modelleme kili hazırlayın. </li><li> Doldurma pipetinin arkasını bir plastik şırıngaya silikon boru ve plastik bağlantı adaptörleri aracılığıyla pipet uçlarından bağlayın. </li><li> D önceY yükleme prosedürü, plastik bir pipet kullanarak Petrol kabından Ringer solüsyonunu çıkarın. Kas-sinir preparatını ince bir şırınga kullanarak kurutun; Bu dolum pipetinin daha sonra yüklenmesi üzerine Ca 2+ boyasının seyrelmesini önleyecektir. </li><li> Ca 2+ gösterge şişesini dondurucudan çıkarın ve karanlık bir yerde oda sıcaklığında çözülmesine izin verin. </li><li> Düşük büyütme (10 ×) ile stereomikroskop kontrolü altında, kas ve sinir arasındaki bağlantıyı tespit edin. İnce cımbız ve makasla, kas yüzeyinin yakınında pektoralis proprius siniri kesin (bkz. Adım 2.1). Yaklaşık 2 mm uzunluğunda bir sinir kütüğü bırakın. </li><li> Modelleme kili kullanarak Petri kabındaki boruya ve şırıngaya tutturulmuş dolum pipetini düzeltin. </li><li> Pipetin ucunu sinir kütüğü yakınına getirin. </li><li> Çimdiklemeden, sinir kütüğünü dolum pipetinin ucu içine yavaşça aspire edin. </li><li> Emme borusunu körelmeden çıkarınT Dolum pipetinin sonu. </li><li> Uzun bir iğneli bir şırınga kullanarak aşırı miktardaki çözeltiyi dolum pipetinden dikkatlice çıkarın (Malzeme Tablosuna bakın). Sinir güdüklerini sıkmayın. </li><li> Sinir kütüğü ucunda emilmiş tutarak, dolum pipetinin ucunu dikey olarak biraz yukarı kaldırın. </li><li> Petrol jöle kullanarak dolum pipet ucunun dışından sinir kütüğünün aspire edilmiş bölümünü izole edin. </li><li> Gerekirse dolum pipetinde yalıtılmış sinir güdükünü kurutun: uzun bir iğneli bir şırınga kullanarak dolum pipetinden aşırı miktarda solüsyonu aspire edin. </li><li> Uzun pipet ucuyla bir pipet kullanarak boya yükleme çözeltisinin 0.5 μL&#39;sini çizin (adım 1&#39;e bakın). </li><li> Dolum pipetine yükleme çözeltisiyle birlikte pipet ucu nazikçe yerleştirin. Karışımı doğrudan sinir güdüğü üzerine çıkarın. </li><li> Dolum pipetinin açık ucunu petrol jeli ile kapatın. </li><li> Ringer&#39;in küçük bir parçasını ekleyin.Hazırlanışı ıslak tutmak için Petri kabında olution. </li><li> Preparatı karanlık ve ıslak koşullar altında oda sıcaklığında 5 saat inkübe edin. </li><li> Dolum pipetini yükleme çözeltisiyle çıkartın, hazırlığı Ringer solüsyonuyla durulayın ve gece boyunca 8 ° C&#39;de buzdolabında saklayın. </li></ol> 3. Mikroskopi için Doku Hazırlama <ol><li> Preparatı silikon elastomer kaplı bölmeye monte edin ve biraz gerginleşecek şekilde çelik mikro iğnelerle sabitleyin. </li><li> Dokuyu bir miktar taze Ringer solüsyonuyla durulayın. </li><li> Siniri uyarmak için bir emme elektrodu kullanın; Elektrodun yapımı, Kazakov ve diğerleri tarafından kağıdın ücretsiz indirilmesiyle mümkündür . , 2015 32 . Elektrot ucunu sinirin kesik ucuna yakın konuma getirin ve sinir güdüğü elektrot deliğine aspire edin. </li><li> Hazırlama bölmesini mikroskop sahnesine monte edin. PlacSıcaklık probu ve haznedeki giriş ve çıkış ateşleri. </li><li> Güç kablosunu Peltier elemanına bağlayın. </li><li> Hazırlığı süper kaynaştırmak için basit bir yerçekimi tahrikli sistem kullanın. Fazla çözeltiyi çıkarmak için perfüzyon emme pompasını açın. </li><li> Termo kontrol ünitesini açın. </li><li> Sıcaklık kontrolünü 20 ° C&#39;ye ayarlayın. </li><li> Ultraviyole koruma koruyucusunu takın. </li><li> Uyarıcı tel elektrotunu elektrik stimülatörüne bağlayın ve 4x objektif lens ile mikroskop altında kas kasılmalarını izleyin. </li><li> Perfüzyon sistemini düşük Ca 2+ ve yüksek Mg 2+ içerikli Ringer çözeltisi ile doldurun. NOT: Bu çözüm, kas kasılmalarını önlemek için kullanılır. Dış kalsiyum konsantrasyonundaki azalma ve dış magnezyumun yükselmesi, Ca2 + geçişlerinin amplitüdünde azalmaya neden olur. Bununla birlikte, önceki tecrübelere dayanarak, 0.9 mM CaCI <sub&gt; 2 ve 6 mM MgCl 2 , Ca 2+ geçici değerlerinin amplitüdünü güvenilir şekilde çözmek için hala yeterlidir. Örneğin Ca 2+ konsantrasyonunu azaltmadan kas kasılmalarını azaltmanın başka yollarının var olduğunu belirtmek gerekir. Örneğin, d-tubokurarin veya alfa-bungarotoksin, nikotinik asetilkolin reseptörlerinin spesifik bloke edicileri, kas kasılmalarını tamamen veya kısmen bloke eder 17 , 27 , 28 , 30. Bununla birlikte, bu toksinlerin ilavesi presinaptik kalsiyum girişini de etkileyebilir 33 . Bunu önlemek için, μ-konotoksin GIIIA kullanılabilir 27 . </li><li> Pompayı açın ve düşük Ca 2+ ve yüksek Mg 2+ ile Ringer solüsyonuyla preparat süperfüzyonuna başlayın. </li><li> Mikroskopta 40 × objektif merceğine geçin. </li><li> Açma t<html> O monokromatör ( Malzeme Tablosuna bakınız). </li><li> Monokromatör kontrol yazılımında 488 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyu ve sürekli aydınlatma modu seçin. </li><li> Floresan modunda yüksek büyütme altında, sinir terminallerine boya yüklendiğinden emin olun. </li></ol><img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig1.jpg" /> Şekil 1 : Ca 2+ göstergesi yüklü sinir ve terminaller. ( A ) Yükleme prosedüründen sonra Ca 2+ göstergesi ile dolu sinir. Ölçek çubuğu = 200 μm. ( B ) Ca 2+ göstergesi ile dolu sinir uçları. Ölçek çubuğu = 20 μm. ( C ) Ca 2+ -indikatör floresan, sinir bitiminde açıkça görülür. Ölçek çubuğu = 20 μm._blank &quot;&gt; Bu figürde daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. <ol start="17"><li> Preparatın düşük Ca 2+ ve yüksek Mg 2+ solüsyonunda en az 30 dakika dengelenecek şekilde bırakın. </li></ol> 4. Dijital CCD Kamera ile Video Çekimi Not: Flüoresan sinyallerini yakalama ayrıntıları her mikroskop ve kamera türü için özeldir, ancak en önemli husus görüntü yakalama hızıdır. <ol><li> NMJ&#39;deki tek Ca 2+ geçici kayıtları için minimum yakalama frekansı olarak 1 kHz kullanın. NOT: Hızlı dijital CCD kameralar floresan görüntüleme için gereklidir (Malzeme Tablosuna bakınız). Burada veri toplama sistemi ve yazılımı ( Malzeme Tablosuna bakınız) kamera, monokromatör ve uyarıcının senkronizasyonu için kullanıldı. Kısacası, bu protokol, verilerin dijital çıkışlarında senkronizasyon darbelerinin üretilmesine izin verirDeklanşörü açmak, video sinyalini yakalamak ve uyarımı başlatmak için görüntü toplama sistemi. Tüm geçici parametreler, protokollerde ve / veya cihazlarda ayarlanabilir. Tipik bir protokol, 1 kHz&#39;de (80 x 80 piksel) elde edilen 500 çerçeve serisidir. Uyarma ışığı ile aydınlatma, Ca 2+ göstergesini beyazlatabilir ve hücre dokusunu fotodasajlayabilir. Bu nedenle, uyarma ışığına uzun süre maruz kalmaktan kaçının. Bu protokolde, deklanşör yalnızca videoyu çekmek için gereken süre boyunca açıktır. Belirli sinir terminali başına yirmi dizi elde edin. Buradaki amaç aynı bölgeleri kontrol grubunda ve ilaç dağıtımından sonra izlemektir. </li><li> Mikroskopun 4X nesnel objektifi altında kas ve sinir dallarını görselleştirmek için parlak alan rejimini kullanın. </li><li> 40X nesnel objektife geçin ve epifloresan rejimi ve 488 nm&#39;lik bir uyarılma dalga boyu kullanarak boya yüklü sinir uçları arayın. İlgi çeken bir sinir uçlu bölgeyi tanımlayın. </li><li> Trinoküler tüp üzerindeF mikroskop, ışık yolu değişim seviyeleri seçin:% 100 kamera ışık. </li><li> CCD kamera için satın alma yazılımını başlatın. </li><li> &quot;Canlı&quot; modda ROI&#39;yi bulun ve odağı ayarlayın. </li><li> &quot;Değiştir&quot; menüsünü seçin. </li><li> Saniyede 1.000 kare (fps), 80 x 80 çözünürlükte &quot;Temel Yapılandırma&quot; kullanın. </li><li> Giriş karelerinin sayısını 500 olarak ayarlayın. </li><li> Denemenin adını girin. </li><li> &quot;Harici Tetikleyici&quot; yi seçin. </li><li> Ön tetikleme süresini 10 ms olarak ayarlayın. </li><li> Yineleme sayısını 20 olarak ayarlayın. </li><li> Monokromatör kontrol yazılımında 488 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyu ve &quot;harici tetik aydınlatma&quot; modunu seçin. </li><li> Veri toplama yazılımını çalıştırın. </li><li> Uyarım protokolünü yükleyin. </li><li> Videoyu kaydetmeden önce, video edinme yazılımını kullanarak karanlık çerçeveyi yakalayın. </li><li> Uyarım protokolünü çalıştır. </li><li> ROI ve chec&#39;i seçinK kaydedilen sinyali. </li></ol> 5. Veri Analizi NoOTE: Veri analizi için CCD kamera yazılımını ve ImageJ&#39;yi kullanın; Veriler bir elektronik tablo programında eğri olarak gösterilir. CCD kamera yazılımında, ortalama 20 tekrarlar ve sonuçları bir ImageJ destek dosyasına aktarır. ImageJ&#39;de ROI ve arka planı seçin. Arka planı YG&#39;den çıkartın. Veriyi bir oran olarak gösterin: (ΔF / F 0 -1) x% 100, burada ΔF uyarılma esnasında flüoresansın yoğunluğudur ve F 0 istirahatte flüoresan yoğunluğudur. <ol><li> CCD kamera edinme yazılımında Dosya&gt; Ortalama Dosyalar&#39;ı tıklayın. Dosyaları seçin ve ortalamaları alın. </li><li> &quot;Fit dosyası olarak kaydet&quot; i tıklayarak ortalama dosyayı bir .fit dosyası olarak kaydedin. </li><li> ImageJ yazılımını çalıştırın. Aşağıdaki adımları uygulayın: </li><li> Görüntü&gt; ayarla&gt; parlaklık / kontrast&#39;ı tıklayın. </li><li> Resim&gt; yığınlar&gt; araçlar&gt;; Yığın sıralayıcı. </li><li> Analiz&gt; araçlar&gt; ROI yöneticisi&#39;ni tıklayın. </li><li> Sürüklenen ve ortalama .fit dosyasını ImageJ penceresine bırakın. </li><li> Daha iyi bir görüntü elde etmek için pencereyi yakınlaştırın. </li><li> İmleci hareket ettirerek, son kareyi seçin ve silin (karanlık çerçeve budur) </li><li> Arka plan olduğuna inanılan alan üzerinde dikdörtgen bir ROI seçin. ROI yöneticisine ekleyin </li><li> Daha&gt; Çok Ölçü&#39;yi tıklayarak arka planı ölçün. MEAN&#39;i not edin. Veriyi kopyalayın, bir elektronik tablo programına dışa aktarın ve bir oran için eşiğin ortalama değerini hesaplayın. </li><li> İşlemi&gt; Ana&gt; Çıkar&#39;ı tıklayarak eşiği yığınlardan çıkartın. Eşiğin ortalama değerini girin. </li><li> Bir sinir terminalinin etrafında dikdörtgen bir ROI seçin. ROI yöneticisine ekleyin. </li><li> Daha&gt; Çok Ölçüm&#39;ü tıklayarak ölçün. MEAN&#39;i not edin. Kopyalayıp bir elektronik tablo programına dışa aktarın. </li><li> Sinyallerin ofset ortalamasını. NOT:Uyarılmadan baz renklendirme floresanını gösteren ilk birkaç düzine nokta; Dinlenme sırasındaki floresan budur. </li><li> Sinyalleri, dinlenme sırasındaki flüorüre göre bölün. </li><li> &quot;1&quot; çıkarın ve% 100 çarpın. </li><li> Sinyali çizin ve Ca 2+ geçici genlik hesaplayın. </li></ol>

<ol><li>Llinás, R., Sugimori, M., Silver, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdomains+of+high+calcium+concentration+in+a+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal.</a> Science. 256, 677-679 (1992).</li>
<li>Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+calcium+trigger+neurotransmitter+release%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">How does calcium trigger neurotransmitter release?</a> Curr Opin Neurobiol. 11, 320-326 (2001).</li>
<li>Burnashev, N., Rozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Ca2%2B+dynamics%2C+Ca2%2B+buffers+and+synaptic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy.</a> Cell Calcium. 37, 489-495 (2005).</li>
<li>Schneggenburger, R., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+calcium+and+control+of+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic calcium and control of vesicle fusion.</a> Curr Opin Neurobiol. 15, 266-274 (2005).</li>
<li>Pang, Z. P., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+Ca2%2B-triggered+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 496-505 (2010).</li>
<li>Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+influx+and+transmitter+release+in+a+fast+CNS+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium influx and transmitter release in a fast CNS synapse.</a> Nature. 383, 431-434 (1996).</li>
<li>Borst, J. G., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+current+during+a+single+action+potential+in+a+large+presynaptic+terminal+of+the+rat+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium current during a single action potential in a large presynaptic terminal of the rat brainstem.</a> J Physiol. 506, 143-157 (1998).</li>
<li>Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+presynaptic+calcium+and+calcium-activated+potassium+currents+regulating+neurotransmitter+release+at+cultured+Xenopus+nerve-muscle+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses.</a> J Neurosci. 17, 2990-3001 (1997).</li>
<li>Molgó, J., Mallart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Anemonia+sulcatatoxin+II+on+presynaptic+currents+and+evoked+transmitter+release+at+neuromuscular+junctions+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Effects of Anemonia sulcatatoxin II on presynaptic currents and evoked transmitter release at neuromuscular junctions of the mouse.</a> Pflugers Arch. 405 (4), 349-353 (1985).</li>
<li>Slutsky, I., Rashkovan, G., Parnas, H., Parnas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+feedback+inhibition+of+acetylcholine+release+in+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent feedback inhibition of acetylcholine release in frog neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 22 (9), 3426-3433 (2002).</li>
<li>Haugland, R. P. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. Gregory, J. , MolecularProbes. Eugene,Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2538708">Fluorescent indicators of ion concentrations.</a> Methods Cell Biol. 30, 127-156 (1989).</li>
<li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20194474">How calcium indicators work.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (3), (2010).</li>
<li>DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+detection+of+action+potential-induced+presynaptic+calcium+transients+at+a+Xenopus+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction.</a> J Physiol. 505, 585-592 (1997).</li>
<li>Sabatini, B. L., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+presynaptic+calcium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of presynaptic calcium currents.</a> Biophys J. 74, 1549-1563 (1998).</li>
<li>Suzuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+dynamics+at+the+frog+motor+nerve+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Pflug+Arch+Eur+J+Phisiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal.</a> Pflug Arch Eur J Phisiol. 440, 351-365 (2000).</li>
<li>Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627302005731">The life cycle of Ca2+ ions in dendritic spines.</a> Neuron. 33, 439-452 (2002).</li>
<li>Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-pixel+optical+fluctuation+analysis+of+calcium+channel+function+in+active+zones+of+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 31, 11268-11281 (2011).</li>
<li>Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRegehr%2C+WG+%22Imaging+in+neuroscience+and+development%3A+a+laboratory+manual%22">Imaging in neuroscience and development: a laboratory manual</a>. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 307-314 (2005).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+Application+of+Indicators+for+Calcium+Imaging+at+the+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Topical Application of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 786-790 (2012).</li>
<li>Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+loading+with+Patch+Pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dye loading with Patch Pipettes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (4), 277-281 (2009).</li>
<li>Coleman, W. L., Bill, C. A., Simsek-Duran, F., Lonart, G., Samigullin, D., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+II+and+calcium+regulate+vesicle+docking+and+the+cross-talk+between+vesicle+pools+at+the+mouse+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals.</a> J Physiol. 586 (19), 4649-4673 (2008).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Injection+of+Indicators+for+Calcium+Imaging+at+the+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct Injection of Indicators for Calcium Imaging at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 797-801 (2012).</li>
<li>Talbot, J. D., David, G., Barrett, E. F., Barrett, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dependence+of+damage+to+mouse+motor+nerve+terminals+following+oxygen%2Fglucose+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Calcium dependence of damage to mouse motor nerve terminals following oxygen/glucose deprivation.</a> Exp Neurol. 234 (1), 95-104 (2012).</li>
<li>Peng, Y. Y., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+LHRH+is+linearly+related+to+the+time+integral+of+presynaptic+Ca2%2B+elevation+above+a+threshold+level+in+bullfrog+sympathetic+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca2+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia.</a> Neuron. 10, 465-473 (1993).</li>
<li>Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Latrotoxin+releases+calcium+in+frog+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alpha-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals.</a> J Neurosci. 20 (23), 8685-8692 (2000).</li>
<li>Newman, Z., Malik, P., Wu, T. Y., Ochoa, C., Watsa, N., Lindgren, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+mediate+muscarine-induced+synaptic+depression+at+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction.</a> Eur J Neurosci. 25 (6), 1619-1630 (2007).</li>
<li>Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward-filling+of+dextran-conjugated+indicators+for+calcium+imaging+at+the+drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (7), 3440-3450 (2012).</li>
<li>Wu, L. G., Betz, W. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8893033">Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).</li>
<li>Blioch, Z. L., Glagoleva, I. M., Liberman, E. A., Nenashev, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+mechanism+of+quantal+transmitter+release+at+a+chemical+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">A study of the mechanism of quantal transmitter release at a chemical synapse.</a> J Physiol. (1), 11-35 (1968).</li>
<li>Kazakov, A., Aleksandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. <a target="_blank" href="http://research-journal.org/en/biology-en/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/">A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects.</a> Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. 40 (9), In Russian 13-16 (2015).</li>
<li>Khaziev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine-induced+inhibition+of+presynaptic+calcium+signals+and+transmitter+release+in+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction.</a> Front Physiol. 7 (621), 1-10 (2016).</li>
<li>Bélair, E. L., Vallée, J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+modulation+of+synaptic+efficacy+at+the+neuromuscular+junction+of+Rana+pipiens+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo modulation of synaptic efficacy at the neuromuscular junction of Rana pipiens frogs.</a> J Physiol. 569 (1), 163-178 (2005).</li>
<li>Samigullin, D., Fatikhov, N., Khaziev, E., Skorinkin, A., Nikolsky, E., Bukharaeva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+presynaptic+calcium+currents+and+endogenous+calcium+buffers+at+the+frog+neuromuscular+junction+with+two+different+calcium+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Synaptic+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes.</a> Front Synaptic Neurosci. 6 (29), 1-10 (2015).</li>
<li>Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11152728">Intraterminal Ca2+ and spontaneous transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurophysiol. 85 (1), 287-294 (2001).</li>
<li>Shahrezaei, V., Cao, A., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17182774">Ca2+ from one or two channels controls fusion of a single vesicle at the frog neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 26 (51), 13240-132499 (2006).</li>
<li>Troncone, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+and+reversible+blocker+of+presynaptic+calcium+channels+in+frog+and+crayfish+neuromuscular+junctions+from+Phoneutria+nigriventer+spider+venom%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous and reversible blocker of presynaptic calcium channels in frog and crayfish neuromuscular junctions from Phoneutria nigriventer spider venom.</a> J Neurophysiol. 90 (5), 3529-3537 (2003).</li>
<li>Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Sudakov, I. A., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12668-016-0318-6">Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction.</a> BioNanoSci. 7 (1), 162-166 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu yazıda, sinir kütüğü aracılığıyla kurbağa sinir uçlarına Ca 2+ -duyarlı boya yükleme yöntemi uyguladık. Yükleme prosedürünün sonuna gelindiğinde, sinirin proksimal kısmındaki tüm terminallerin flüoresans düzeyleri belirgindir. Probun terminal içi konsantrasyonunun 40 ila 150 μM arasında değiştiği tahmin edilmektedir17. Kuluçka prosedürü iki aşamada gerçekleştirilir: Oda sıcaklığında ve daha sonra bir buzdolabında daha düşük bir sıcaklıkta. Oda sıcaklığında boya ile doku inkübasyon süresini kontrol etmek önemlidir. Sinir güdükünün gerçek uzunluğuna, spesifik boyaya ve sıcaklığa bağlı olarak kuluçka süresi değişebilir. Aşırı maruz kaldıysa, proksimal kısımların sinir kütüğüne yakın terminalleri aşırı yüklenebilir. Bununla birlikte, sinirin orta kısmında tatmin edici yüklü terminaller bulmak hala mümkündür. Inci sırasındaBuzdolabında uzun süre inkübasyon yapılırsa, boya sinir uçlarına eşit olarak dağıtılır. Kendi gözlemlerimiz 33 , 35 ve diğer araştırmacıların verileri 30 , yükleme prosedürünün postsinaptik yanıtın amplitüdünde veya minyatür son plak potansiyellerinin frekansı üzerinde kayda değer bir etkisinin bulunmadığını ispatlıyor. Yüklü müstahzarlarda iyi bir ömrü belgelenmiştir. Dikkat çekmek istediğimiz bazı önemli noktalar var. Boyanın kesik sinir aksonlarına girmesini sağlamak için eksizyon sonrası sinir kütüğünü boya yükleme çözeltisine yerleştirmek çok önemlidir; Gecikmeler muhtemelen sinir aksonlarının 27 , 36 nın tekrar kapanmasına bağlı olarak etkisiz yüklemeye neden olabilir. Bazı araştırmacılar, sinir güdükünü 100 mM EDTA (bir Ca 2+ - ve Mg 2+ -çelatör) Kesilen aksonların tekrar kapanmasını önlemek için sinirin çıkarılmasından hemen sonra. Tampon, 1-2 dakika sonra çıkarıldı ve bir boya yükleme çözeltisi 37 ile değiştirildi . Yükleme prosedürü için plastik hortum yerine bir petrol jeli kuyusu kullanılması daha kısa bir sinir kütüğü kullanımına izin verir. Bu yaklaşımı kullanırken sinir, boya ile HEPES çözeltisine daldırıldıktan sonra kesilir ve aksonlar boyar madde çözeltisinde iki değerlikli iyonların olmaması nedeniyle yeniden mühürlemezler 27,28. Çalışmamızda, dekstran yerine Ca 2+ göstergesinin suda çözünen tuz formunu kullandık. Dekstran konjugatları aksonda tuz formlarından daha yavaş yayılır. Bununla birlikte, dekstran konjugatının kullanımı, boya bölümlendirmesini ve sinir ve NMJler tarafından taşınmasını azaltır. Kalsiyum yeşil 1-3.000 MW dekstran konjügatının iyi bir difüzyon hızı vardır ve azaltılmış bölümlendirmeyi gösterir <s<html> Up class = &quot;xref&quot;&gt; 38. Dokunun uzun süre flüoresanla aydınlatılmasını önlemek çok önemlidir; çünkü bu durum, sağlığını ve sağkalımını etkiler. Sinir terminalleri aramak için görünür ışık kanalında Nomarski optik kullanıyoruz. Kayıt esnasında aydınlatılmış alanı bir diyafram ile sınırlıyoruz. Dikkat çeken nokta, bu yükleme yönteminin yalnızca uzun inkübasyonlara dayanabilen preparatlara uygun olmasıdır. Daha kırılgan dokular üzerinde çalışmalar yapıldığında boya yükleme süresini azaltmak için ( örneğin, sıcakkanlı hayvanların sinapsları), sinir kütüğü uzunluğunu küçültmek ve 29 , 39 yüklemek için mikropipet kullanmak gereklidir. Bu yükleme tekniği, hem tek sinir uyarımı hem de ritmik sinaptik aktivite altında flüoresan göstergeler ile sitosolik Ca 2+ görüntüleme değişiklikleri için çok uygundurEf &quot;&gt; 17 , 27 , 35 Ca 2+ -transient genlik analizi, nörotransmitter salınımına katılan kalsiyum girişi üzerindeki farklı maddelerin etkisini incelemek için kullanılabilir.

Kalsiyum iyonları (Ca 2+ ), mediatör salınımı 1 , 2 , 3 , 4 , 5&#39;in başlatılması, bakımı ve plastisitesi dahil birçok sinirsel sinyalleme sürecine katılır. Aksiyon potansiyelinin gelmesinden sonra, hücre dışı Ca 2+ sinir terminaline girer ve nörotransmiter salınımı başlatır. Bazı sinapslarda, kalsiyum akımı doğrudan elektrofizyolojik yöntemlerle 6 , 7 , 8 ölçülebilir. Nöromüsküler kavşak (NMJ) durumunda, sinir uçlarının minik boyutundan dolayı direkt yama kelepçesi ve iki elektrotlu gerilim kelepçesi teknikleri kullanılamaz. NMJ&#39;deki sinir uçlarından içe Ca 2+ akımlarının kayıtları dolaylı elektrofizler ile yapılabilirİyonik yöntemler 9 , 10 . Bununla birlikte, bu yöntemler, sodyum ve potasyum iyon kanalı bloke edicileri tarafından sinapsın ön işleme tabi tutulmasını gerektirir. Optik yöntemler, iyonik akımların sinir terminalinde farmakolojik olarak ayrılmasını gerektirmez ve aksiyon potansiyelleri tarafından tetiklenen Ca 2 + akışı ve ardından axoplasm 11 Ca 2+ iyonlarının elevasyonu , 12 , 13 , 14&#39;e izin verir . Bu yöntemler serbest Ca 2+ iyonlarının 15 , 16 , 17 , 18 , 19&#39;unun bağlanması üzerine spesifik Ca 2+ -duyarlı boyaların flüoresanındaki değişikliklerin kayıtlarına dayanmaktadır. Ca 2+ göstergeleri c içine yüklenebilirDeneyin amacına bağlı olarak çeşitli yöntemler vasıtasıyla basılmaktadır. Araştırmacılar yama pipeti 22 veya mikroenjeksiyon 23 , 24 , 25 ile yüklemeye devam eden membran geçirgen boya formları 20 , 21&#39;in banyo uygulamasını kullanıyorlar. Bununla birlikte, tüm bu yöntemlerin sinaptik mimarlık özelliklerine bağlı olarak NMJ durumunda bazı sınırlamaları vardır. NMJ için en uygun ve başarılı yöntem, 26 , 27 , 28 , 29 ileri dolum yöntemi ile boyayı sinir güdüğü üzerinden yüklemektir. Bu teknik, periferik sinir uçlarına çeşitli fluoresan boyaları yüklemek için kullanılabilir. Bu yöntem Drosophila sinir terminalleri 28 , kertenkele motor siniri için başarıyla kullanılmıştır28 ve kurbağa motor sinir terminalleri 17 , 26 , 27 , 30 . Çalışma esnasındaki nesnelere bağlı olarak metodik ayrıntılar değişebilir. Larvaların küçük sinirleri için cam mikro-pipet kullanılabilir 28 . Birkaç araştırmacı, kasları sinirlendiren sinirin yeni kesilen ucunun bir boya ile önceden doldurulmuş bir kuyuya daldırıldığı bir yöntem 27 , 28&#39;i tarif etmiştir. Bundan sonra, preparat boya ıslatmak için birkaç saat bırakılır. Boya aksonlar tarafından emilir ve sinir terminallerine taşınır. Bu yazıda, sinir kütüğü aracılığıyla kurbağa motoru sinir uçlarına bir floresan göstergesi yüklemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Protokolümüz, bir boya ile dokunun kuluçka için plastik bir pipet kullanır. Ayrıca, Ca 2+ fluorescence tra&#39;ı nasıl edinip analiz edeceğimizi de tarif ediyoruznsients.

<table><tbody><tr><td>Ca2 + indikatör</td><td>Moleküler Problar, ABD</td><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 heksapotasyum tuzu, O6806</td><td>500 & mu; g</td></tr><tr><td>Silikon Elastomer</td><td>Dow Corning, ABD</td><td>Sylgard 184 elastomer</td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Biohit, Rusya</td><td>720210</td><td>0.5-10 & mikro; L</td></tr><tr><td>Pipet ucu</td><td>Fisher Scientific, ABD</td><td>02-707-175</td><td>10 ve mikro; L</td></tr><tr><td>Pipet ucu</td><td>Biohit, Rusya</td><td>781349</td><td>10 & mikro; L</td></tr><tr><td>Tıraş Bıçağı</td><td>Fisher Scientific, ABD</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Minutien</td><td>Pimleri İnce kesme aletleri, Kanada</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Kornea Mini Makas</td><td>MT MEDI CORP, Kanada</td><td>S-1111</td><td></td></tr><tr><td>Kuyumcu Forseps</td><td>MT MEDI CORP, Kanada</td><td>F-9610</td><td></td></tr><tr><td>Kuyumcu Forseps</td><td>MT MEDI CORP, Kanada</td><td>F-9611</td><td></td></tr><tr><td>Modelleme yerel kil</td><td>üreticisi</td><td></td><td>herhangi bir yerel üretici tarafından değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Petrol jölesi</td><td>yerel üreticisi</td><td></td><td>herhangi bir yerel üretici tarafından değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Microspin FV 2400&nbsp;</td><td>Biosan, Latva</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Çok dönüşlü MSC 3000</td><td>Biosan, Latva</td><td>BS-010205-AAN</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık hipodermik iğneler</td><td>Bbraun</td><td>100 Sterican</td><td>0.4 & kez; 40mm</td></tr><tr><td>Syrynge</td><td>yerel üretici</td><td></td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>H0887</td><td>100ml</td></tr><tr><td>Mikroskop, BX51</td><td>Olympus, Japonya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veri toplama sistemi&nbsp;</td><td>Moleküler Cihazlar, ABD</td><td>Digitdata 1550</td><td></td></tr><tr><td>yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar, ABD</td><td>pClamp yazılımı, Sürüm 10</td><td>protokolü şu adresten indirilebilir: http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro</td></tr><tr><td>Banyo ve banyo sıcaklık kontrol cihazı</td><td>Deneysel Oluşturucu</td><td></td><td>sıcaklık kontrollü herhangi bir oda ile değiştirilebilir. Örneğin https://www.warneronline.com/&nbsp'dan;</td></tr><tr><td>Monokromatör</td><td>Till Photonics, Almanya</td><td>Polychrome V</td><td>artık mevcut değil, başka bir şeyle değiştirilebilir&nbsp; &nbsp; Kullanılabilir kararlı ışık kaynağı 488 nm</td></tr><tr><td>monokromatör kontrol yazılımı</td><td>Till Photonics, Almanya</td><td>Polycon</td><td></td></tr><tr><td>Dijital CCD kamera</td><td>Redshirt görüntüleme, ABD</td><td>Neuro CCD SMQ</td><td></td></tr><tr><td>Model 2100 İzole Nabız Stimülatörü</td><td>A-M Sistemleri, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD kamera Redshirt görüntüleme için edinme yazılımı</td><td>, ABD</td><td>Turbo SM yazılımı</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri, ABD</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Elektronik tablo programı</td><td>Microsoft, ABD</td><td>Microsoft Office Excel&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

kurbağa sinir uçlarına sinir kütüğü vasıtasıyla kalsiyum boyası yükleme: kurbağa nöromüsküler kavşağında kalsiyum geçici kayıt

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Presinaptik sinir terminallerinde presinaptik kalsiyum düzeylerini ölçmenin en uygun yöntemlerinden biri optik kayıttır. Hücredeki serbest kalsiyum konsantrasyonuna bağlı olarak emisyon yoğunluğunu veya dalga boyunu değiştiren kalsiyuma duyarlı floresan boyaları kullanmaya dayanır. Kalsiyum boyaları ile hücreleri lekelemek için kullanılan çeşitli yöntemler vardır. En yaygın olanları, boyaların bir mikropipet ile yüklenmesi veya boyaların asetoksimetil ester formları ile ön-kuluçka işlemidir. Bununla birlikte, bu yöntemler ortaya çıkan metodolojik sorunlardan dolayı nöromüsküler kavşaklara (NMJ&#39;ler) pek uygulanmaz. Bu yazıda kurbağa sinirinin kurbağa sinir kütüğü boyunca sinir uçlarına kalsiyuma duyarlı bir boya yüklemek için bir yöntem sunuyoruz. Harici kalsiyumun sinir terminallerine girişi ve bundan sonra kalsiyum boya bağlanması milisaniyedeki zaman ölçeğinde gerçekleştiğinden, bu etkileşimi kaydetmek için hızlı görüntüleme sistemi kullanmak gereklidirns. Burada, hızlı bir CCD kamerayla kalsiyum geçişini kaydetmek için bir protokolü açıklıyoruz.

Boya yükledikten ve motor sinir uyarımı üzerine, sinir terminallerinde floresan sinyalinin (Ca 2+ geçici) amplitüdünde bir artış tespit edilebilir (bkz. Şekil 2 ). Ca 2+ geçici parametreleri Tablo 1&#39;de sunulmuştur. Nicel olarak, çalışmamızda ölçülen Ca 2+ geçici parametreleri, soğukkanlı hayvanların sinapslarındaki diğer bilim adamlarının elde ettiği verilere 15 , 34 yakındır. Ca 2+ geçici maddelerinin parametreleri, Ca 2+ &#39; nın boya ile bağlanma hızına ve ardından çözünme oranına bağlıdır. Sinir sonlanmasına, renkle etkileşime ve sitoplazmdaki difüzyona Ca 2+ girme oranı Ca 2+ geçiciinin yükselme zamanını etkiler. Floresan sinyalin bozulma süresi boya afınitesine,Hücre içi tamponlar ile Ca 2+ etkileşimi hızı ve iyon pompaları ile uzaklaştırılması 35 . Ca 2+ geçici maddelerin genlik analizi, çeşitli maddelerin nörotransmitter salınımına katılan kalsiyum girişi üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir 33 . <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig2.jpg" /> Şekil 2 : Ortalama Ca 2+ Geçici NMJ kurbağasında ölçülür. Ca 2+ geçici, 13 kurbağa NMJ&#39;sinin sinyal ortalamasına dayanarak hesaplandı. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55122/55122fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ZirveΔF / F (%) </td><td> Yükseliş süresi% 20 -% 80 (ms) </td><td> Τ (ms) </td></tr><tr><td> 12,6 ± 1,1 (n = 13) </td><td> 4.6 ± 0.5 (n = 13) </td><td> 115.3 ± 8.3 (n = 13) </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Ca 2+ geçici maddesinin ortalama parametreleri . Veriler ortalama ± SE olarak sunulmuştur; N farklı NMJ&#39;lerdeki ölçümlerin sayısıdır. Zirve ΔF / F, ΔF / F&#39;nin ortalama amplitüdidir.

Burada, sinir uçlarına kurbağa sinir kütüğünden kalsiyuma duyarlı bir boya yüklemek için bir yöntem açıklıyoruz. Ayrıca, periferik sinir uçlarında hızlı kalsiyum geçişlerinin kaydedilmesi ve analizi için bir protokol de sunuyoruz.

Kurbağa Sinir Uçlarına Sinir Kütüğü Vasıtasıyla Kalsiyum Boyası Yükleme: Kurbağa Nöromüsküler Kavşağında Kalsiyum Geçici Kayıt

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Merhaba, benim adım Dimitry Samigullin. Rusya Bilimler Akademisi'ne bağlı Kazan Biyokimya ve Biyofizik Enstitüsü'nün Sinaptik Süreçler Biyofizik laboratuvarında çalışıyorum. Laboratuvarımızda, nöromüsküler kavşaktaki kalsiyum sinyalizasyonunun çeşitli yollarını inceliyoruz. Sinaptik kalsiyum düzeyini ölçmek için en erişilebilir yöntemlerden biri optik kayıttır.Burada, kurbağa sinir uçlarında, bir sinir güdüğü aracılığıyla kalsiyuma duyarlı bir boyanın yükleme yöntemini açıklıyoruz. Ayrıca, kurbağa terminallerindeki geniş kalsiyum geçişinin ölçümü ve analizi için protokolü sunuyoruz. Bu yöntem kullanılarak, sinaptik aktivite sırasında kalsiyumun presinaptik seviyesi üzerindeki aktif ilaçların etkisi incelenebilir.Boya yükleme solüsyonunun hazırlanması. Fluorescein'in Kalsiyum Boyası Oregon Green BAPTA, 500 mikrolitre hacminde, küçük bir miktar olan 500 mikrogram toz şeklinde gelir. Toza, HEPES içeren 14 mikrolitre solüsyon ekleyin.Yükleme solüsyonunu vorteksleyin ve tamamen karışması için santrifüjle çöktürün. Işığa maruz kalmasını önlemek için yükleme solüsyonunun bulunduğu viyali folyo ile sarın. Yükleme solüsyonunu bir dondurucuda -20 °C'de saklayın.Boya yükleme prosedürü. Hayvandan bir kutanöz pectoris kası disseke edin. Disseke edilen dokuyu gümüş kaplı bir Petri kabına yerleştirin.Dokuyu ince paslanmaz çelik iğnelerle gerin. Petri kabına Ringer çözeltisi ekleyin. Bir jilet kullanarak, on mikrolitrelik pipet ucunun ince ucundan yaklaşık 2 milimetrelik küçük bir parça kesin.Petri kabı üzerinde dolum pipetini sabitlemek için bir parça oyun hamuru hazırlayın. Dolum pipetini, bir silikon tüp ve pipet tüplerinden yapılmış adaptörler aracılığıyla plastik bir şırıngaya bağlayın. Geçici Ringer çözeltisini, plastik bir pipet yardımıyla Petri kabından uzaklaştırın.Şırınga ile kuru hazırlama. Bu, doldurma pipetine solüsyonun çekilmesini önleyecektir. Yükleme solüsyonu içeren şişeyi dondurucudan çıkarın ve karanlık bir yerde, oda sıcaklığında çözülmeye bırakın.Görsel kontrol altında, steril bir mikroskop eşliğinde, ince bir cımbız ve makas kullanarak siniri kasın hemen yakınından kesin. Yaklaşık iki milimetrelik bir sinir güdüğü bırakın. Dolum pipetini bir tüp ve şırınga ile birlikte plastikin kullanarak Petri kabına sabitleyin.Sinir dalına yaklaştırın. Sinir kütüğünü dolum pipetine nazikçe aspire edin. Emme tüpünü dolum pipetinin küt ucundan çıkarın.Dolum pipetindeki sinir güdüğünü şırınga yardımıyla kurulayın. Dolum pipetini sinir güdüğüyle birlikte yukarı kaldırın. Sinir güdüğünü dış ortamdan Vazelin ile izole edin.Şırınga yardımıyla doldurma pipetindeki sinir kütüğünü bir kez daha kurulayın. Uzun uçlu bir pipet kullanarak 0.5 µL yükleme solüsyonu çekin. Yükleme solüsyonu içeren pipet ucunu nazikçe doldurma pipetinin içine yerleştirin.Karışımı doğrudan sinir güdüğüne püskürtün. Dolum pipetinin açık ucunu Vazelin ile sızdırmaz hale getirin. Petri kabına az miktarda solüsyon ekleyin.Hazırlığı oda sıcaklığında, karanlık ve nemli bir yerde beş saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon işleminin ardından hazırlığı alın ve yükleme çözeltisi içeren dolum pipetini çıkarın. Hazırlığı bir banyoya yerleştirin ve Ringer çözeltisi ile yıkayın.Hazırlığın bulunduğu banyoyu bir gece boyunca sekiz derece Celsius sıcaklıktaki buzdolabında bekletin. Dokuyu mikroskopi için hazırlayın. Hazırlığı banyodan çıkarın.Gümüş kaplı bir hazne içinde montaj hazırlığını yapın ve dokuyu hafifçe gerin. Dokuyu taze Ringer çözeltisi ile durulayın. Vakum Stimülasyon Elektrodunu alın.Stimülasyon Vakum Elektrodunu, ucu sinirin kesik ucuna yakın olacak şekilde hazneye yerleştirin. Siniri elektroda doğru çekin. Elektrodun yapımı Khazokoff'un makalesinde açıklanmıştır; makalenin bağlantısı materyaller kısmında yer almaktadır.Hazırlama haznesini mikroskop tablasına sabitleyin. Sıcaklık probunu yerleştirin. Hazırlama haznesindeki Peltier elemanı için güç kablosundaki giriş tüplerini bağlayın.Çıkış tüpünü hazırlama haznesine yerleştirin. Perfüzyon pompasını çalıştırın. Sıcaklık kontrol ünitesini açın.Kontrol ünitesindeki sıcaklığı 20 °C olacak şekilde ayarlayın. Ultraviyole koruma kalkanını takın. Stimülatör üzerindeki gecikme süresini ve periyodu ayarlayın.Vakum elektrodu ile stimülatör arasına bir tel bağlayın. Cihazı açın. Düşük büyütmeli bir objektif altında, stimülasyonu başlatarak kas kasılmasını kontrol edin.Perfüzyon sistemini düşük kalsiyumlu ve yüksek magnezyumlu bir Ringer çözeltisi ile doldurun. Perfüzyon hızını dakikada yaklaşık iki mililitreye ayarlayın. Objektifi 40 kat büyütme ile değiştirin.Polychrome V.Select emisyon dalga boyunu ve sürekli mod aydınlatmasını açın. Deklanşörü açın. 40 kat büyütmeli objektif altında, floresan mod aydınlatmalarında terminallerin yüklendiğinden emin olun.Terminali bulun ve ona odaklanın. Yüklü sinir ve iyi yüklü motor sinir terminalleri şekilde gösterilmiştir. Görüntü yakalama işlemi Red-Short Neuro CCD Kamera ile gerçekleştirilmiştir.Turbo-SM Yazılımını çalıştırın. Değiştir Ayarlar (Change Settings) seçeneğini belirleyin. Kare sayısı girişi olarak 500 değerini girin.Deney adını giriniz. Temel konfigürasyon saniyede 1000 kare ve 80 x 80 çözünürlüktür.Harici tetikleyiciyi seçin. Tetikleme öncesi süreyi girin. Eksi on milisaniye.Tekrar sayısını 20 olarak girin. Polychrome yazılımında, harici tetikleme aydınlatma modunu seçin. Clampex yazılımını çalıştırın.Stimülasyon protokolünü yükleyin. Protokol, Kazan Federal Üniversitesi web sitesindeki laboratuvar sayfamızdan indirilebilir. Kayda başlamadan önce Turbo-SM yazılımında bir karanlık kare (dark frame) yakalayın.Trinoküler küp üzerinde ışık yolu değişim seviyelerini seçin. Kamera için yüzde 100'ü belirleyin. Stimülasyon protokolünü çalıştırın.İlgi bölgesini seçin ve sinyali kontrol edin. Sinir stimülasyonuna yanıt olarak, sinir ucuna kalsiyum girişini yansıtan floresans yoğunluğu değişimini kaydederiz. Veri analizi.Turbo-SM yazılımında, dosya (file) seçeneğini seçin. Ardından, dosyaları ortala (average files) seçeneğini seçin. Dosyaları seçin.Ortalama dosyasının adını girin ve bunları ortalayın. Ortalama dosyayı fit dosyası olarak kaydedin. Seçin, fit dosyası olarak kaydedin.Dosya adını girin ve kaydedin. Image J'yi çalıştırın ve aşağıdaki araçları açın: Analiz, araçlar, ROI Manager.Fit formatında kaydedilmiş ortalama dosyayı bulun. Dosyayı Image J'ye sürükleyip bırakın. Daha iyi bir görünüm için pencereyi yakın. Arka plan olduğunu düşündüğünüz alan üzerinde dikdörtgen bir ilgi alanı seçin.Bunu ROI yöneticisine ekleyin. ROI yöneticisinde, "more" (daha fazla) seçeneğini, ardından "Multi-measure" (Çoklu ölçüm) seçeneğini belirleyin. Ortalama değerleri yükleyin.Verileri kopyalayın ve Excel'e aktarın. Excel'de, bir oran için arka planın ortalama değerini hesaplamak amacıyla ortalama (average) fonksiyonunu kullanın. Excel'i kapatmadan Image J'ye geri dönün. Arka plan hesaplamasının yapıldığı pencereyi kaydetmeden kapatın.ROI Manager'ı kullanarak dikdörtgen arka plan çizimini silin. Cihaz işlem (instrument process) menüsünden matematik (math) ve çıkarma (subtract) seçeneklerini açın. Excel'den hesaplanan ortalama eşik değerini girin ve arka planı yığınlardan çıkarın.Bir sinir terminalinin etrafında dikdörtgen bir ilgi alanı (ROI) seçin. Bunu ROI Yöneticisine ekleyin. ROI Yöneticisinde, more, Multi-measure, load down, mean seçeneklerini belirleyin.Excel penceresine kopyalayıp yapıştırın. Excel cihaz plot grafiğini kullanın. Sinyal başlamadan önce düz bir alan seçin.Grafiği, dinlenme halindeki ilk floresan değerlerinden sinyalin başlangıcına kadar olan ayrıntılarla doldurun. Ardından, dinlenme floresan değerlerini ortalamak için kullanılacak nokta sayısını belirleyin. Bu değerlerin ortalamasını alın, daha sonra dinlenme halindeki floresan değerinin ortalamasını bulun.Sinyalleri dinlenme halindeki floresansa bölün. Bir çıkarın ve yüzde 100 ile çarpın. Sinyali grafiğe dökün ve kalsiyum transient genliğini hesaplayın.Floresans sinyallerinin zaman parametreleri, kalsiyum-boya-kompleks oluşumunun ileri ve/veya geri tepkimelerinin hızına bağlıdır. Kalsiyum sinyalinin yükselme süresi, kalsiyum girişinin dinamiklerini temsil eder. Bu, kalsiyumun terminaldeki difüzyonunu ve boya ile olan etkileşimini yansıtır.Kalsiyum transiyentinin sönümlenmesi, boya afinitesine, kalsiyum tamponlama hızına ve kalsiyumun geri çekilmesine bağlıdır. Kalsiyum transiyenti amplitüd analizi, farklı aktif maddelerin nörotransmitter salınımında rol oynayan kalsiyum girişine olan etkisini incelemek için kullanılabilir. Bu yükleme tekniği,le sitozomal kalsiyumdaki değişimlerin görüntülenmesi için oldukça uygundur.Floresan indikatörler ile hem tekli sinir stimülasyonu hem de ritmik sinaptik aktivite kullanılarak analiz yapılır. Kalsiyum geçici genlik analizleri, nörotransmitter salınımında rol oynayan kalsiyum girişine farklı maddelerin etkisini incelemek için kullanılabilir. Dikkat çekmek istediğimiz bazı önemli noktalar bulunmaktadır.İnkübasyon prosedürü iki adımdan oluşur: oda sıcaklığında inkübasyon ve buzdolabında inkübasyon. Boya ile oda sıcaklığında yapılan inkübasyon süresinin kontrol edilmesi önemlidir.Sinir güdüğünün uzunluğuna, kullanılan boyaya ve oda sıcaklığına bağlı olarak inkübasyon süresi değişiklik gösterebilir. Preoperasyon terminallerini aşırı maruz bırakırsanız, sinir güdüğüne yakın proksimal kısımlar aşırı yüklenebilir. Buzdolabındaki uzun süreli inkübasyon sayesinde boya, sinir uçları boyunca eşit şekilde dağılır.Boyanın sinire girmesini sağlamak için, kesimden sonra birkaç dakika içinde sinirin boya yükleme solüsyonuna yerleştirilmesi esastır; çünkü daha uzun zaman aralıkları, muhtemelen kapanan sinir nedeniyle etkisiz yüklemeye yol açmıştır. Boya kompartmanlaşmasını azaltmak için boyanın genişletilmiş formu kullanılabilir. Dokunun sağkalımını etkilediği için, dokunun uzun süre floresan ışığa maruz kalmasını önlemek çok önemlidir.Terminalleri aramak için görünür ışık kanalında Nomarski optikleri kullanıyoruz. Kayıt sırasında, aydınlatılmış alanı diyafram ile sınırlıyoruz. Yükleme işleminin uzun süresi, sinirin shutter damgası kullanılarak azaltılabilir.Bu durumda, cam mikro-bypass kullanılabilir.

loading-calcium-dye-into-frog-nerve-endings-through-nerve-stump

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kalsiyum sinir sistemi her yerde bulunan bir haberci, sinaptik gücü nörotransmitter salınımı ve değişiklikleri tetiklenmesi için gerekli. Burada Ca 2 +-göstergeler Drosophila sinir uçları içine yüklemek için bir teknik göstermektedir. Biz de gerekli aparat imalatı göstermek ve tekniğinin başarısı için kritik noktaları vurgulamak.

Kalsiyum Göstergeleri ile yükleme Drosophila Sinir Terminalleri

Burada yengeç stomatogastric ganglion nöronlar detaylı aktivite, hızlı ve yüksek çözünürlüklü floresan voltaj duyarlı boya görüntüleme için bir metodoloji mevcut.

Gerilim duyarlı Boyalar ile Yengeç Stomatogastric Ganglion Nöronlar Optik Görüntüleme

Biz nöron veya polietilen emme pipet kullanarak herhangi bir nöronal yoluna floresan ve kalsiyum duyarlı boyalar yüksek konsantrasyon tanıtmak için basit ve düşük maliyetli tekniği tanımlandı.

Sinirler, yolları ve Floresan Boyalar ile Spinal Roots Retrograd Yükleniyor

Bu videoda, Drosophila larvaları sinir lifleri, hücre zarı lipidlerine bağlanan FM boyasına daldırılır. Emme mikroelektrodu ve elektrik darbeleri, FM boyasını yeni oluşan endositik veziküllere dahil ederek endositoz sürecini uyarır. Nörotransmisyonun presinaptik aşamalarını görselleştiren bu yöntem, sinaptik fonksiyonu ve nörotransmitter salınımını incelemek için yararlıdır.

Drosophila Larva Sinir Hücrelerinde Mikroelektrot Aracılı FM Boya Yükleme ve Boşaltma

Kaynak: Heredia, D. J., et. al. Fare diyaframının üçlü sinapsında hücreye özgü kalsiyum sinyalinin ex vivo görüntülemesi. J. Vis. Uzm.  (2018) Bu video floresan görüntülemeyi göstermektedir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini ifade eden transgenik bir farede nöromüsküler kavşaklarda (NMJ'ler) kalsiyum dinamikleri. Bir NJM, frenik sinir ile diyaframdaki floresan etiketli asetilkolin reseptörleri ile tanımlanır. Aynı anda birden fazla sinyali görselleştirmek için bir görüntü ayırıcı...

Transgenik Bir Farenin Diyaframındaki Nöromüsküler Kavşaklarda Kalsiyum Dinamiğinin Floresan Görüntülemesi

Kaynak: Zhilyakov, NV ve diğerleri, Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Yüksek Zamansal Çözünürlüğe Sahip Fare Nöromüsküler Kavşağında Kalsiyum Geçici Akımlarının Kaydı. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, konfokal mikroskopi kullanılarak sinir uçlarında hızlı kalsiyum geçişlerinin kaydedilmesine yönelik görüntüleme tekniğini göstermektedir. Siniri uyararak ve kalsiyum bağlayıcı boyalardan gelen floresan değişikliklerini yakalayarak, sinir ucundaki dinamik kalsiyum akışını ve klerensini görselleştirerek...

Fare Sinir Uçlarında Hızlı Kalsiyum Geçişlerinin Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Görüntülenmesi

Enterik sinir sistemi (ENS), bağırsak duvarında bulunan ve bağırsak reflekslerini kontrol eden bir nöron ve glia ağıdır. Bu protokol, Ca2+ görüntüleme kullanılarak ENS'nin canlı preparatlarında enterik nöronların ve glia'nın aktivitesini kaydetme yöntemlerini açıklar.

Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca 2+ Görüntüleme

Burada, Xenopus laevis'in  koku soğancığındaki sıcaklık tepkilerini ölçmek ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.Koku alma reseptörü nöronları ve mitral hücreler diferansiyel olarak boyanır, daha sonra kalsiyum değişiklikleri kaydedilir, bu da ampuldeki bazı sinir ağlarının burunda indüklenen sıcaklık düşüşlerine duyarlılığını yansıtır.

koku ampul kalsiyum Değişiklikleri İzleme yoluyla Sıcaklık kaynaklı Nöronal Aktivite Kayıt<em&gt; Xenopus laevis</em

Sinaptik vezikül (SV) Bisiklete binme nöronal sinapslarda, hücreler arası iletişim çekirdek mekanizması vardır. FM boya alımı ve yayın kantitatif SV endo - ve ekzositozu raporlaması birincil yoludur. Burada, biz FM1-43 Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ) modeli sinaps Bisiklet sürmeyi tüm uyarım yöntemleri karşılaştırın.

FM sinaps Bisiklete binme boya: yüksek potasyum depolarizasyon, elektrik ve Channelrhodopsin stimülasyon karşılaştırma

Sinaptik iletim için gerekli olan hücre altı olayları görselleştirmek için iki ilgili yöntem tanımlanmıştır. Bu protokoller, in vitro kültürlü nöronların canlı hücre görüntülemesini kullanarak presinaptik kalsiyum akışı ve sinaptik vezikül membran füzyonunun dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Protokol, kesilmiş sinirden fare motor sinir terminallerine floresan kalsiyum boyası yükleme yöntemini açıklar. Ek olarak, konfokal mikroskopi kullanarak periferik sinir uçlarındaki hızlı kalsiyum geçicilerini kaydetmek için benzersiz bir yöntem sunulmuştur.

Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Fare Nöromüsküler Kavşağında Yüksek Zamansal Çözünürlükte Kalsiyum Geçici Maddelerinin Kaydı

Öğrenin, kurbağa sinir uçlarına sinir kütüğü vasıtasıyla kalsiyum boyası yükleme ve kalsiyum geçici kayıt yöntemini. Bu teknik, sinaptik iletimdeki kalsiyum sinyallerini ve ilaç etkilerini incelemek için kullanılır.

Kurbağa Sinir Uçlarına Sinir Kütüğü Vasıtasıyla Kalsiyum Boyası Yükleme: Kurbağa Nöromüsküler Kavşağında Kalsiyum Geçici Kayıt

Daha fazla video keşfet