Xeno-ücretsiz Koşullarda 3-D Kültürler Üretim ve Tedavi Mezenkimal Kök Yönetim / Stromal Cell (MSC) küremsi Astarlı

Bu deneylerin genel amacı, deneysel ve klinik uygulamalarda, xeno-free koşullar altında hazırlanmış mezenkimal kök/stromal hücrelerin (MSC'ler) terapötik küresel agregalarını veya sferoidlerini verimli bir şekilde üretmek ve enjekte etmektir. Bu yöntemler; dağınık hücrelerin transplantasyonu sonrası ve doku hasarıyla yaygın olarak ilişkilendirilen olumsuz koşullar nedeniyle sıkça görülen yetersiz hücre tutunması, sağkalım ve fonksiyonellik gibi MSC terapötikleri alanındaki temel engellerin aşılmasına yardımcı olabilir.

Bu prosedürlerin temel avantajı, MSC sferoidlerinin; şu anda hücrelerin bazı klinik uygulamalarını kısıtlayan ve bazı klinik öncesi verilerin yorumlanmasını da karıştırabilen FBS gibi immünojenik hayvan ürünleri olmadan hazırlanabilmesi, prime edilmesi ve enjekte edilebilmesidir. Bu mekanizma, MSC tabanlı etkinliğin aracılanmasında potansiyel olarak çok faydalı olsa da, MSC aracılı doku onarımını ve diğer medya formülasyonlarının terapötik gen ekspresini nasıl değiştirebileceğini anlamak için de kullanılabilir. Bu prosedürleri, laboratuvarımdan iki teknisyen olan Josh Beaver ve Bret Cloughle gösterecekler.

Mezenkimal kök hücreleri, metin protokolüne uygun olarak ekip inkübe ettikten sonra, hücreleri trypsin ve EDTA ile hasat edin; hasat edilen hücreleri 450 ×g'de santrifüj ettikten sonra tüm hücreleri uygun besiyeri ile tek bir konik tüpte birleştirin. Hücreleri santrifüjleyin ve peleti küçük bir hacim besiyeri içinde yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri saydıktan sonra, yaklaşık 25.000 hücreden oluşan sferoidler oluşturmak için hasat edilen MSC'leri aşağıdaki besiyerlerinden birinde mikrolitre başına 714 hücre olacak şekilde seyreltin.

Ardından, hücrelerden 35 µL'lik damlaları 150 mm'lik bir ters kültür kabı kapağının alt kısmına pipetleyin. Oda sıcaklığındaki 20 mL PBS'yi kabın tabanına aktarın ve damlaların bulunduğu kapağı, damla tepeleri aşağıya bakacak şekilde tek ve sürekli bir hareketle ters çevirin. Daha sonra kapağı dikkatlice kültür kabının tabanına yerleştirin.

Uygun küre oluşumuna izin vermek için kabı, üç gün boyunca rahatsız edilmeden inkübatöre yerleştirin. İnkübasyonun ardından, kapağı dikkatlice çıkarıp damlacıklar tekrar yukarı bakacak şekilde ters çevirerek sferoid hasadına başlayın. Ardından kapağı yaklaşık 10 ila 20 derecelik bir açıyla eğik tutun ve sferoidleri içeren damlacıkları plakanın kenarına itmek için bir hücre kaldırıcı kullanın.

Bir mililitrelik pipet kullanarak, kürenin son ortamını 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve sferoidlerin maksimum düzeyde geri kazanılmasını sağlamak için oda sıcaklığındaki PBS'yi ve aynı pipet ucunu kullanarak plakayı yıkayın. Gerçek zamanlı PCR analizleri için, küre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 450 ×g'de santrifüjleyin. Ardından süpernatanı aspire edin.

Sferoidleri PBS ile yıkayın ve hem santrifüj hem de aspirasyon adımlarını tekrarlayın. Hayvanlara nakil için, sferoidlerin santrifüjlemeden tüpün dibine çökmesine izin verin. İmmünomodülatör ve antikanser potansiyel analizleri için şartlandırılmış ortam (CM) toplamak amacıyla, az önce gösterildiği gibi bir hücre toplayıcı (cell lifter) ve pipet kullanarak sferoidleri ve CM ortamını 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Ancak, kapakları PBS ile yıkamayın. 450 ×g'de 5 ila 10 dakika santrifüj etmeyi takiben, süpernatantı 1,5 mL'lik tüplere aktarın. Süpernatantı 10.000 ×g'de ve oda sıcaklığında 5 ila 10 dakika santrifüj edin.

Ardından, berraklaştırılmış CM'yi dikkatlice toplamak için bir pipet kullanın ve -80 °C'de saklamak üzere yeni 1,5 mL tüplere aktarın. Bu videoda gösterildiği gibi sferoitleri hazırladıktan ve tüpün dibine çökmeleri için üç ila dört dakika bekledikten sonra, süpernatantı aspire edin ve xeno-free koşullarını korumak için %0,2 ila 0,5 HSA ile takviye edilmiş HBSS ekleyerek sferoitleri yıkayın. Daha sonra, süpernatantı aspire edin.

Sferoidlerin üzerine 100 ila 200 µL steril HBSS/HSA ekleyin ve tüpleri buza yerleştirin. Metin protokolüne göre bir fareyi anesteziye aldıktan sonra, hayvanı sırtı aşağı gelecek şekilde BSL-2 kabinine yerleştirin ve farenin alt karın bölgesini dezenfekte etmek için %70 etanol kullanın. 20-gauge intravenöz kateterin kapağını çıkarın ve bir elinizle fare derisini tutarken, bükülmüş diz eklemi ile genital bölgeyi birleştiren hayali çizginin ortasını belirleyin; kateter stilet düzeneğinin iğne ucu orta hatta bakacak şekilde, diğer elinizle intraperitoneal enjeksiyonu gerçekleştirin.

Metal stiletto iğnesini, kateter stiletto düzeneğinden nazikçe çıkarın. Stilettoyu kan, idrar ve dışkı açısından kontrol edin ve ardından atın. 100 µL steril HBSS/HSA içeren 100 ila 200 mikrolitrelik bir pipet ucunu, sıkı bir sızdırmazlık oluşturacak şekilde kateter şırınga adaptörüne yerleştirerek plastik kateterin doğru yerleşimini doğrulayın.

Ardından sıvıyı periton boşluğuna yavaşça enjekte edin. 100 ila 200 mikrolitrelik bir pipet ucuyla, MSA sferoidlerini ve HBSS/HSA'yı toplayıp tüm hacmi, az önce gösterildiği gibi kateter aracılığıyla periton boşluğuna aktarın. Sonrasında, 100 mikrolitre HBSS/HSA ile sferlerin bulunduğu tüpü yıkayın ve sferlerin tüm hacmini periton boşluğuna aktarın.

Kateterin üzerine antiseptik emdirilmiş bir gazlı bez yerleştirin, kateteri peritoneal boşluktan yavaşça çıkarın ve atın. Kateterde herhangi bir sferoid kalıp kalmadığını kontrol edin. Ardından, sferoidlerin eşit şekilde dağıldığından emin olmak için peritoneal boşluğu parmaklarınızla nazikçe masajlayın.

Sferoidlerin farelere verilmesinin hemen ardından, enjeksiyonlar için hazırlanan sferoidlerin aktivasyon seviyesini değerlendirmek için 40 ila 120 sferoidi, %2 FBS ve 1X penisilinle streptomisin eklenmiş bir ila iki mililitre Alpha MEM içeren 12 veya 6 kuyucuklu bir plakadaki katetere aktarın. Altı saat sonra, kuyucuklardaki besiyerini 1,5 veya 15 mililitrelik tüplere aktarın ve tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 450 ×g hızında santrifüjleyin. Son olarak, berraklaştırılmış CM'yi yeni 1,5 mililitrelik tüplere aktarın ve PGE-2 konsantrasyonunu ölçmek için ticari bir ELISA kitini metin protokolüne uygun olarak kullanın.

Burada görüldüğü üzere, yaklaşık 25.000 MSC'nin 35 mikrolitre CCM damlacıkları içinde süspande edildiğinde, hücreler önce küçük agregatlar oluşturur, ancak sonunda 72. saatte damlacığın tepesinde tek bir kompakt küre oluşturacak şekilde birleşirler. Bu şekil, tek kompakt kürelerin ve XFM-1'in oluşumunun, CCM'deki tahmini toplam protein içeriğini yansıtan bir konsantrasyon olan 13 miligram/mililitre HSA takviyesi gerektirdiğini göstermektedir. Küre oluşumu sırasında MSC fenotipi radikal bir şekilde değişir ve uygun şekilde kimyasal olarak tanımlanmış xeno-free ortamda olduğunda, PGE2 ve TSG6 dahil olmak üzere çok sayıda anti-enflamatuar faktörün ekspresyonu artar.

Buna karşın, HSA içermeyen XFM-2 veya XFM-1 ortamlarında küreler şeklinde kültüre edilen MSC'lerde TSG6 ve PGE2 üretimi belirgin şekilde artmamaktadır. Son olarak, in vitro etkilerle benzer şekilde, LPS'nin IV yoluyla uygulanmasıyla sistemik inflamasyonun indüklenmesini takiben farelerin periton boşluğuna enjekte edilen XFM-1 HSA küreleri, proinflamatuar TNF alpha'yı azaltırken peritondaki PGE2 ve IL-10 seviyelerini artırmıştır. Yöntem kavrandıktan sonra, her bir asılı damla plakası bir ila iki dakika içinde hazırlanabilir.

Ve sağlam sferoidlerin intraperitoneal iletimi, uygun şekilde gerçekleştirildiğinde hayvan başına 5 ila 10 dakika içinde tamamlanabilir. Asılı damla tekniğini kullanarak MSC sferoidleri üretirken, farklı xeno-free medya formülasyonlarının küre oluşumu ve terapötik genlerin ekspresyonunu artırma açısından eşit olmadığını hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, sferoidlerdeki MSC'lerin organizasyonunu ve ayrıca sferoidin farklı kısımlarındaki MSC'lerde aktive olabilecek ek sinyal yolaklarının neler olduğunu anlamak için konfokal mikroskopi gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

Bu gelişmenin ardından, bu yöntem MSC bilimcilerinin diğer 3D kültür koşullarını ve bunların MSC primingleme ile terapötik gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini incelemelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, asma damla tekniği kullanarak MSC'lerin sferoitler şeklinde nasıl primingleneceği, in vitro ortamda terapötik etkinliklerinin nasıl değerlendirileceği ve in vivo etkinlik testleri için bozulmamış sferoitlerin farelere nasıl etkili bir şekilde nakledileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, erişkin insan kök hücreleriyle çalışmanın özel ekipman ve eğitim gerektirdiğini ve hücreler uygun şekilde yönetilmediği takdirde tehlikeli olabileceğini unutmayın.

Yetişkin insan kök hücreleri ile çalışırken her zaman uygun KKD kullanılmalıdır.