Name: bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Öğrenin bakteriyel histidin kinaz otofosforilasyonunu nitroselüloz bağlama deneyi ile nicelendirmeyi. Bu yüksek verimli yöntem, pikomol düzeyinde fosfohistidin tespiti ve kinetik parametre elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Ulusal İhtiyaç programı (P200A100044) Alanlarında Lisansüstü Yardımlaşma aracılığıyla Milli Eğitim Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.

Dikkat: Bu protokol radyoaktif maddelerin uygun kullanımı konusunda eğitim ve kullanım gerektirir. Beta radyasyon koruma da dahil olmak üzere, bu testte yaparken gerekli kişisel koruyucu donanımları kullanın. Atıkların büyük miktarlarda deney yıkama aşamasında üretilen olarak radyoaktif atıklar, dikkatle ele alınması gerekir. Atık böyle kolayca devrilebilecek veya dökülen olmayacak büyük bir kova ya da şişe gibi dik kapta saklanır emin olun. Deney tamamlandığında, dikkatlice sıvı atık uygun radyoaktif atık konteynerleri işaretli transfer. dikkatle tüm malzeme Kulp ve kirlenme çalışma alanını izlemek için yakınlardaki bir Geiger sayacı tutun. NOT: Bu protokol bizim gruptan önceden bildirilen tahlil gözden geçirilmiş bir versiyonu. H 3 PO 4 15 Phosphohistidine stabilitesi, bu yöntemi kullanarak önce bir uncharacterized histidin kinaz için test edilmelidir. phosphohistidine styetenek test daha önce tarif edilmiştir. Kinaz içermeyen 15 bir negatif kontrol dahil edilmelidir. Bu, her bir numuneden arka plan sinyalini çıkarmak ve [γ- 32P] -ATP yeterli zardan yıkanır sağlamak için gereklidir. Reaktifler ve Materyallerinin Hazırlanması 1. <ol><li> bakteri kültürü önceden bu testte kullanmadan histidin kinazları arındırın. <ol><li> Bu denemenin gelişimi için Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802), bir histidin kinaz (gen İD 1.189.383) saflaştınlır. Ndel ve XhoI kısıtlama bölgeleri kullanılarak ifade vektörü pET-23aHis-TEV içine kinaz klon ve mutant Vp1876 D499A oluşturmak vermek üzere bölgeye yönelik mutagenez yerine. </li><li> E. coli BL21 (DE3) &#39;e pLysS içine plazmid dönüşümü ve 37 ° C&#39;de TBC medya hücreleri büyür. ampisilin (100 ug / ml) ve kloramfenikol ile Ek kültürleri (34 ug / mL), ve ajitasyon ile büyümeyeOD, 0.6 ila 600 (250 rpm). </li><li> 25 uM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar IPTG ile protein sentezlenmesinin neden olması ve 16 ° C&#39;de gece boyunca kültür büyür. santrifüj (5000 xg), sonikasyon ile lyse ve santrifüj ile Hasat hücreleri hücresel enkaz (18,000 xg) kaldırın. </li><li> Ni-NTA agaroz kullanılarak His etiketli kinazın saflaştırılır. SDS-PAGE ile saflık teyit edin. Her bir protein için arıtma optimize etmek ve bu testte kullanmadan önce saflık teyit etmektedir. </li></ol></li><li> 25 mM H 3 PO 4 yıkama çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış iyonu giderilmiş su, 1 L için, 25 mM nihai konsantrasyona kadar H3 PO 4 ekleyin. Bu çözeltinin pH değeri yaklaşık 2.0 kadardır. Buz üzerinde 25 mM H 3 PO 4 yerleştirin. </li><li> 325 mM ila 3 saat arasında bir 13x stok çözeltisi PO 4, Hazırlama kinaz reaksiyonu söndürmek için kullanılır. Bu çözeltinin pH değeri, yaklaşık 1.5. Buz üzerinde 325 mM H 3 PO 4 yerleştirin. NOT: H 3 PO 4 </sub&gt; 25 mM&#39;lik bir son konsantrasyonda yeterli nitroselüloz zara bağlanmasını histidin bağlı değildir radyo etiketli fosfatın önlenmesine yardımcı olur, aynı zamanda reaksiyon söndürür ve. </li><li> 4x 160 mM Tris-HCI, pH 8.0, 600 mM KCI, 16 mM MgCI2 ihtiva eden reaksiyon tamponu stok solüsyonu ve% 40 gliserol hazırlayın. </li><li> Kurulan protein konsantrasyonu yöntemleri (Bradford, UV-Vis, vs.) histidin kinaz konsantrasyonunu ölçmek. 16,17 4 kez arzu edilen nihai konsantrasyonu olan bir konsantrasyonuna sahip bir histidin kinaz çözelti hazırlayın. Yeterli bir sinyal elde edilmesi için, reaksiyon, nihai protein konsantrasyonu ideal olarak en az 5 uM olmalıdır. </li><li> 4x radyo etiket hazırlayın etiketsiz ATP uygun 4x konsantrasyonu ve etiketli ile ATP çözeltisi [32 P γ-]: deney için etiketsiz oranı. NOT: Bu karışıma dahil edilmelidir [γ- 32P] -ATP miktarı ^ [ne kadar bağlıdır7, - 32P] -ATP sonunda, her reaksiyon için tespit edilir. Reaksiyon başına 5 uCI - Biz 0.1 arasında değişen nihai konsantrasyonlarda yeterli sinyali almış. etiketlenmemiş ATP oranı, belirli bir deneyde, tüm reaksiyonlar için sabit tutulması: etiketli önemlidir. Tüm konsantrasyonlar arasında etiketlenmemiş ATP oranı sabiti: birden fazla ATP konsantrasyonlarının arzu edildiğinde, bu şekilde etiketlenmiş tutmak gibi seri seyreltileri, yapılmalıdır. Nihai ATP konsantrasyonu tipik olarak 10 uM, en az 1 mm arasında değişir ve her konsantrasyon güvenilir kinetik veriler elde etmek için üç kopya halinde test edilmelidir. </li><li> 96- de nokta lekesi aparatı <ol><li> Nitroselüloz zar (0.2 um gözenek boyutu) 8 cm x 12 cm parça kesin. </li><li> Membran cihazı kapatılır ve tüm çukurlar tamamen zar ile kaplıdır şekilde oturduğundan emin olacak şekilde bir nokta lekesi cihazında Pozisyon nitroselüloz. doğru monte Eğer vakum İçi olduğunda, hava kaçağı olmamalıdıried. </li><li> Filtrat toplamak için, ikinci bir yan kol şişeye tertibatı bağlanır. supap sapı itibaren, cihaz rahatça ikincil şişeyi devrilme olmadan kullanılabilir şekilde yeterli boru bağlayın. </li><li> aspiratör / vakum kaynağına bağlı yan kol şişesi bağlayın. </li><li> Cihaz tamamen alete vakum uygulanarak sızdırmaz olduğunu test edin. Cihaz doğru monte edilirse, güçlü bir vakum kuyu tüm mevcut olacaktır. Tüm boru bağlantıları Parafilm sarılmış olabilir ya da sıkı bir mühür sağlamak için sarın Saran. </li><li> İsteğe bağlı olarak, iyi birine reaksiyon tamponu vakum, pipet 100 uL test etmek. Vakum kuyunun içinden ve membran üzerine tüm sıvı çizmek için yeterince güçlü olmalıdır. </li><li> tüm numuneler zar üzerinde lekeli olabilir hazır olana kadar vakum kapatın. </li></ol></li></ol> 2. Reaksiyon Başlatma ve Quenching <ol><li> Reaksiyon bileşenlerinin karıştırılması <ol><li> Önceki başlatılışının içinreaksiyon tamponu -ATP (1.6) [32 P γ-], histidin kinaz (1.5), (bölüm 1.4) ve GKD 2 O.: tirme, 4x stok solüsyonları olarak dört reaksiyon bileşenleri hazırlamak </li><li> Reaksiyon tamponu, histidin kinaz eşit hacimlerde karıştırın ve GKD 2 O, bu reaksiyon bileşenleri kısa bir süre (10 dakika) oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. NOT: Nihai reaksiyon hacmi Deney zamana bağlı olarak, enzim-bağlı ya da alt-tabaka bağımlı olmasına bağlıdır. Birden alikotları istenen bir zaman noktasında, aynı reaksiyon alınır ve söndürüldü gibi zamana bağlı tepkimeler, büyük olmalıdır. Reaksiyon hacmi, istenen zaman noktalarının sayısına bağlıdır. Deney reaksiyon 30 uL içeren nitroselüloz zar üzerine her nokta için optimize edilmiştir. 10 zaman noktalarında arzu edilir böylece, eğer, reaksiyon, hacim, en azından 300 uL olmalıdır (daha yüksek bir ses seviyesi gibi 330 uL bir pipetleme hata durumunda tercih edilebilir).Enzim ve substrat bağımlı deneyler daha küçük reaksiyon hacimleri gerektirir. Bu nitroselüloz zar üzerinde benekli nihai hacim olarak, bu deneyler için reaksiyon hacmi 30 uL kadar küçük olabilir. </li><li> Reaksiyonun başlatılması için, reaksiyona [32P γ-] -ATP çözeltisinin bir hacim kazandırmak ve aşağı yukarı pipetleme karıştırılır. Bir zamanlayıcı ile geçen reaksiyon zamanı takip ve reaksiyon istenilen zaman için devam etmesine izin. </li><li> Reaksiyonu söndürmek reaksiyona buzla soğutulmuş 325 mm ila 3 saat toplam reaksiyon hacmi PO 4 1/13 ilave yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Seçenek olarak ise, 325 mm ila 3 saat reaksiyona PO 4 bir kısım ilave edin. Not: 3 konumundaki H atomu PO 4 nihai konsantrasyonu yeterli reaksiyonun sönmesi için 25 mm olmalıdır. Örneğin, 30 uL reaksiyonuna 2.5 uL 325 mM H 3 PO 4 ekleyebilir veya &lt;30 uL reaksiyon 2.5 mL 325 mM H 3 PO ekleyinsub&gt; 4. Reaksiyonun son pH yaklaşık 4.0&#39;dır. H 3 PO 4 Bu konsantrasyon olarak test edilmiş ve phosphohistidine düşürmeden bu tamponda kinaz reaksiyonu söndürmek için doğrulanmıştır. <ol><li> Örneğin, 7.5 uL [γ- 32P] -ATP ile reaksiyon başlatılır 7.5 uL 4x reaksiyon tamponu, 7.5 ul 4x histidin kinaz ve 7.5 uL GKD 2 O karıştırın. 2.5 uL 325 mM H 3 PO 4 ile reaksiyonu söndürmek. </li></ol></li><li> Tüm reaksiyonlar sona kadar hemen buz üzerine söndürüldü reaksiyonlann. Not: verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için, bütün reaksiyonlar kadar her 15 ya da 20 başlatılan bir reaksiyonun başlatılması için tavsiye edilir, ve arzu edilen reaksiyon süresi geçtikten sonra, tüm söndürüldü kadar, bir reaksiyonda her 15 ya da 20 söndürme. ilk defa deney kullanılarak olanlar için, daha uzun bir aralık daha yönetilebilir olabilir. </li></ol></li></ol> 3. Spotting oNitroselüloz f söndürdüler reaksiyonlar <ol><li> 96-iyi nokta leke cihazı üzerinde vakum başlat <ol><li> ikincil kap içine önceden monte 96-iyi nokta leke aparatı (bölüm 1.7) yerleştirin. Cihaz ve membran kullanımdan sonra radyoaktif gibi tertibat kolayca demonte edilmesi için bu kapsayıcı kadar büyük olmalıdır. </li><li> 96 gözlü nokta lekesi aparatına bir vakum uygulanır. </li><li> Cihaz vakum altına alındıktan sonra, dikkatli bir şekilde her bir nitroselüloz zar üzerine doğrudan söndürülmüş reaksiyon pipetleyin. Tüm reaksiyonlar membran üzerine yüklenir kadar tekrarlayın. Nitroselüloz bağlama kapasitesi bu yana (75-110 ug / cm2), daha doğru bir şekilde yüklendiğinde Neredeyse bütün kinaz membrana bağlanan kabul edilebilir fark edilir histidin kinaz miktarından daha büyüktür. NOT: Kullanılan aparat bağlı olarak, bakım nitroselüloz delinme dikkat edilmelidir. reaksiyonun tüm th ile temas yapmış olduğu gözlemleyine nitroselüloz. Bazı veya reaksiyon tüm kuyunun duvarları sopa ve nitroselüloz ulaşamaz için kolay olduğunu. </li><li> Buz soğukluğunda 25 mM H3 PO 4 100 uL ile kuyu yıkayın. Bu, tüm reaksiyonların tam yükleme sağlanması, membran ulaşmak için kuyuda sıkışmış olabilecek herhangi bir reaksiyon hacmi sağlayacaktır. tüm hacim zarından akmasına izin verin. </li></ol></li><li> Aparat sökme ve nitroselüloz membran transferi <ol><li> Dikkatle vakum kapatmadan önce cihazı sökmeye. Cihaz ve nitroselüloz membran hem şu anda radyoaktif olduğunu hatırlatırız. Şu anda ikincil kaptan herhangi aparat bileşenlerini çıkarmayın. </li><li> Forseps ile dikkatli bir şekilde, yaklaşık 200 ml 25 mM buz soğukluğunda H 3 PO 4 bir kaba aygıtından nitroselüloz membran aktarın. Yıkama radi olacak gibi, bu kabın üzerine bir kapak yerleştirinoactive. Şu anda, vakum kapatmak olabilir. </li></ol></li></ol> 4. Selülozik İşleme <ol><li> Selülozik yıkama <ol><li> bir rocker yıkama membran ile kap yerleştirin. membran hafifçe 20 dakika rock izin verin. </li><li> 20 dakika sonra, dikkatli bir büyük kovaya kullanılan yıkama solüsyonu geçici atık depolama için kullanılacak süzün. Membran ve tekrar buz gibi soğuk 25 mM H3 PO 4 200 mL ekleyin. Not: En az üç adet 20 dakika yıkama arka membrandan ATP sinyali [32P γ-] kaldırmak için gereklidir. Üçüncü yıkamadan sonra, bir Geiger sayacı ile radyasyon için kullanılan yıkama solüsyonu test edin. sinyal yıkama çözeltisi içinde mevcut olmayana kadar yukarıda tarif edildiği gibi bir zan yıkamaya devam edin. </li></ol></li><li> Selülozik kurutma <ol><li> Membran yeterli yıkandıktan sonra, kısa bir süre için hava ile kurumaya membran sağlar. Bu genellikle 5 dakika veya daha az sürer.</li></ol></li></ol> Depolama Fosfor Ekran 5. Pozlama Not: Bu bölüm isteğe bağlıdır. bir fosfor ekranına membran maruz zarında her bir noktada radyo-etiketli kinazın yoğunluğunun görünüm için izin vermesidir faydalıdır. Bu noktalar nispi yoğunluk her nokta fosforile histidin kinaz miktarı ile doğru orantılıdır. Ayrıca bölüm 7. oluşturulan olanlara yoğunluk görüntü işleme yazılımı ile ölçülebilir ve bu sonuçlar mukayese edilebilir, bu adım kalite kontrolü sağlar. Bu taramada görülen anormallikler sintilasyon sayımı elde edilen düzensiz sonuçları açıklayabilir. <ol><li> Fosfor ekran hazırlığı <ol><li> Depolama fosfor ekrana zarı maruz önce en az 5 dakika boyunca beyaz ışığa fosfor ekrana maruz bırakmaktadır. Bu ekran ile tutulabilir herhangi bir kalıntı görüntü silinir sağlar. </li><li> ekran temiz olduğundan emin olunve kuru. Gerekirse, yavaşça ekran üreticisi tarafından onaylanmış bir fosfor ekran temizleme solüsyonu ile ekranı temizlemek ve kurulayın. </li></ol></li><li> Nitroselüloz zar preparasyonu <ol><li> Dikkatle fosfor ekrana zarar vermesini kalan nemi önlemek için ince bir plastik wrap kuru nitroselüloz membran sarın. kırışıklık veya kabarcıklar hiç bulunmadığından emin olun. </li></ol></li><li> fosfor ekrana Pozlama <ol><li> Depolama fosfor ekran kaseti sarılmış nitroselüloz membran yerleştirin zar üzerine ekran yüzü aşağı yerleştirin ve kaseti kapatın. kaseti açmak veya pozlama sırasında membran kaydırma çift veya kirli görüntü yakalanır neden olacak gibi, fosfor ekran tarama zamanı gelinceye kadar membran hareket ettirmeyin. </li><li> sürece fosfor ekran üreticisi anlaşılacağı gibi en az 4 saat süreyle Açığa veya. </li><li> Pozlama tamamlandığında, fosfor ekran tarama ve fosfor tarayıcı ile görüntü yakalamak. </li></ol></li></ol> Sintilasyon sayımı için nitroselüloz zar hazırlama 6. <ol><li> Ponceau S boyanması ve destaining <ol><li> Kısaca Ponceau S boyama çözeltisi içinde nitroselüloz membran daldırın (% 0.1 Ponceau S (a / h)% 5 asetik asit) 1 - 2 dk. destaining önce leke ile tüm membran ıslatın. </li><li> zardan aşırı Ponceau S ile yapılır. </li><li> Histidin kinaz sadece lekeler lekeli kadar GKD 2 O ile membran durulayın. tüm noktalar protein saptanabilir miktarda içeriyorsa, bu prosedür sadece çalışacağını unutmayın. Not: Bu adım kinaz nitroselüloz bağlı olduğunu doğrulamak için gerekli olduğunu ve protein yükleme hatta tüm noktalar genelinde olduğu. Aynı zamanda benekli kinaz kolayca membran kesip sağlar. </li></ol></li><li> noktalar kesmek <ol><li> makas kullanarak, nitroselüloz membran üzerinde her noktayı kesip. Alon mükemmel kesmek için gerekli değildirg lekeli nokta kenar; zar yeterince yıkandı eğer nedeniyle kesilmiş noktalar değişen boyutuna arka plan önemsiz olacaktır. Her reaksiyon için tüm nokta kesip önemlidir. </li><li> forseps kullanarak, dikkatli bir sintilasyon şişeleri içine her noktayı aktarmak. 32P Cherenkov radyasyon ile kolayca tespit edilmektedir Resim sintilasyon kokteyli gereklidir. NOT: Alternatif olarak, nokta sivriltilmiş bir mantar delici kullanılarak kesilebilir. mantar delici ile nitroselüloz her nokta çıkarın ve bir iğne ile bir parıldama şişenin içine doğru itin. Bu yöntem ile, doku ayrıca radyasyona maruz minimize dokunulmasından gerekmez. </li></ol></li><li> [Γ- 32P] -ATP çözeltisi belirlenmesi CPM / pmol <ol><li> Spot birkaç dilüsyonları 1 cm nitroselüloz x 1 cm kareler üzerine ATP çözeltisi (bölüm 1.5) [32 P γ-]. Kısaca hava kuru. </li><li> forseps kullanarak, dikkatli bir sintilasyon içine her kareyi transferiŞişeler. Resim sintilasyon kokteyli gereklidir. Bu örnekler, ATP çözeltisi CPM / pmol belirlemek için bir standart eğri oluşturmak için kullanılır. </li></ol></li></ol> 7. Sintilasyon Sayım <ol><li> ışıldama sayacı kasetlerine içine tüm sintilasyon şişeleri yükleyin. sintilasyon sayacı yükleyin kasetleri. </li><li> Her flakon için CPM ölçmek için sintilasyon sayma programı çalıştırmak. Bu veriler, (bölüm 6.3) radyo-etiketlenmiş ATP karışımı CPM / pmol ile birlikte, her bir noktada, bu fosforile histidin kinaz miktarı ve otofosforilasyon böylece oranını hesaplamak için kullanılabilir. 18,19 </li></ol>

<ol><li>Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-component+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Two-component signal transduction.</a> Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).</li>
<li>Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histidine+kinases+and+response+regulators+in+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Histidine kinases and response regulators in networks.</a> Curr. Opin. Microbiol. 15 (2), 118-124 (2012).</li>
<li>Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+modules+in+bacterial+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Communication modules in bacterial signaling proteins.</a> Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).</li>
<li>Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphotransfer+profiling%3A+systematic+mapping+of+two-component+signal+transduction+pathways+and+phosphorelays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays.</a> Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).</li>
<li>Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+domains+in+bacterial+regulatory+proteins+that+respond+to+environmental+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli.</a> Cell. 49 (5), 579-581 (1987).</li>
<li>Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+sensor+histidine+kinase+controlled+by+transmembrane+helix+interactions+with+its+auxiliary+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (15), 5891-5896 (2008).</li>
<li>Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shewanella+oneidensis+MR-1+H-NOX+regulation+of+a+histidine+kinase+by+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide.</a> Biochemistry. 46 (48), 13677-13683 (2007).</li>
<li>Zhulin, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+superfamily+of+chemotaxis+transducers%3A+from+physiology+to+genomics+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Microb.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back.</a> Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).</li>
<li>Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+two+components%3A+a+novel+kinase+and+a+regulatory+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch.</a> Nature Struct. Biol. 7 (8), 626-633 (2000).</li>
<li>Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus+on+phosphohistidine%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">Focus on phosphohistidine.</a> Amino acids. 32 (1), 145-156 (2007).</li>
<li>Kee, J. -M., Muir, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chasing+phosphohistidine%2C+an+elusive+sibling+in+the+phosphoamino+acid+family%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family.</a> ACS Chem. Biol. 7 (1), 44-51 (2012).</li>
<li>Tawa, P., Stewart, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+CheA+Autophosphorylation+and+Dephosphorylation+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions.</a> Biochemistry. 33 (25), 7917-7924 (1994).</li>
<li>Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+mutational+analysis+of+the+PhoQ+histidine+kinase+catalytic+domain.+Insight+into+the+reaction+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism.</a> J. Biol. Chem. 276 (44), 41182-41190 (2001).</li>
<li>Fuhs, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+1-+and+3-Phosphohistidine+Antibodies%3A+New+Tools+to+Study+Histidine+Phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation.</a> Cell. 162 (1), 198-210 (2015).</li>
<li>Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+assay+for+the+quantification+of+histidine+kinase+autophosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (3), 331-337 (2015).</li>
<li>Bradford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 7 (72), 248-254 (1976).</li>
<li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li>
<li>Funt, B. L., Hetherington, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scintillation+counting+of+beta+activity+on+filter+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scintillation counting of beta activity on filter paper.</a> Science. 131 (3413), 1608-1609 (1960).</li>
<li>Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+phosphorus-32+and+calcium-45+in+biological+samples+by+%C4%8Cerenkov+and+liquid+scintillation+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Appl.+Radiat.+Isot%22%5BJournal%5D)">Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting.</a> Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31 (6), 371-374 (1980).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

daha önce tanımladığımız nitroselüloz bağlanma tahlili histidin kinazlar karakterize etmek için daha önce kullanılan yöntemlere göre birçok avantajı vardır. Geleneksel SDS / PAGE tabanlı otoradyografi ile karşılaştırıldığında, bizim yöntemi daha yüksek verim ve daha az zaman alıcıdır. Nitroselüloz zar SDS jelleri daha daha kolaydır ve sabit olması gerekmez. protein spotları görüntülenmiştir için nitroselüloz boyama Ponceau sağlar. Bu sintilasyon sayımı için her nokta kesip, ve protein yükleme tüm noktalar tutarlı olup o...

Adaptif cevap bakteriyel yaşam için çok önemlidir. algılamak ve çevresel değişimlere cevap verebilmek amacıyla, bakteri iki bileşenli sinyalizasyon olarak bilinen bir uyarıcı-tepki sistemi kullanın. Tipik, iki bileşenli bir sistem olarak 1,2, histidin kinaz, ortak kökenli bir uyarıcı tespit onun korunmuş histidin kalıntısı autophosphorylates, o zaman bir yanıt düzenleyici protein, alıcı alan bir korunmuş aspartat artığına fosfat aktarır. 3. Bu olay, bir alt etki uyarır yanıt düzenleyici, aktivitesinde bir değişiklik başlatır. 4,5 Böylece bakteriler duyu ve yerel ortamda değişikliklere uyum edebiliyoruz. Bazı iki bileşenli sinyalizasyon sistemlerin bu arketip sapma. Bazı durumlarda, histidin kinaz duyusal etki doğrudan duyu girişi algılar ve bir protein-protein etkileşimi yoluyla kinaz aktivitesi değiştiren bir tek başına proteinidir. 6 - Ancak 8, fonamental proses ve sistem bütün olarak rolü aynı kalır. İki bileşenli sinyal, bakterinin yaşamda kalması için gerekli olan bir yerde teşvik yanıt sistemi, ve histidin kinazlar sinyal transdüksiyonunda önemli bir rol oynar. 9 Bakteriyel biyoloji histidin kinazlar önemine rağmen, iyi tanımlanmamış kalır. Bu phosphohistidine tabiatında bulunan kararsızlık ve otofosforilasyonunu ölçmek için pratik bir yöntem olmaması kaynaklanmaktadır. Phosphohistidine fosfoserin, fosfotreonin ve fosfotirosin daha hassastır. 10 Böylece, sık Ser / Thr / Tyr kinazlar analiz etmek için kullanılan teknikler histidin kinazlar için geçerli değildir. Histidin kinazlar çalışma 11, in vitro deneyler, büyük ölçüde, SDS-PAGE otoradyografiye sınırlıdır. Bu yöntemde 12,13 [γ- 32P] -ATP kinaz ile kuluçkaya yatırılır, ve kinaz fosforilasyon pol ile analiz ediliryacrylamide jel elektroforezi (PAGE) jelin otoradyografisi eklenmiştir. Bu yöntem, bir yanıt regülatörüne kinaz kinaz otofosforilasyon, hem de phosphotransfer izlemek için de kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem, önemli eksiklikleri vardır. PAGE bazlı deneyler, düşük verimlilik ve zaman alıcıdır. Bu tür sınırlamalar bir proteini karakterize ve kinetik parametrelerin ascertaining için elverişli değildir. en son yayınlanan histidin kinazlar çalışmak için alternatif bir yöntem, oto-fosforilasyonunu tespit etmek için phosphohistidine antikorları kullanır. Bu yöntem 1-phosphohistidine ve 3-phosphohistidine arasında ayrım avantajı taşımasının yanısıra, 14 tespiti için kullanılan aletlere bağlı olarak, bu yöntem, bir geniş dinamik aralık veya algılama için yüksek bir üst sınır sağlayamayabilir. Bu nedenle, bu önemli proteinlerin incelemek için kullanılabilir, daha hızlı, daha az zahmetli ve daha hassas analiz için bir ihtiyaç vardır. Burada, tarif ve din vitro olarak saf halde bir bakteri histidin kinazlar otofosforilasyonu ölçmek için kullanılabilecek bir dikkatle geliştirilmiş nitroselüloz bağlanma tahlili göstermenin. Bu deney, daha yüksek verim ve sayfa tabanlı deneylerde daha az zaman alıcıdır. Yöntem ayrıca algılama ve geniş bir dinamik aralıkta yüksek bir üst sınırı sunan phosphohistidine ölçümü için Cherenkov radyasyon kullanır. Deney histidin kinazlar için kinetik parametreleri belirlemek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Fosforik asit</td><td>VWR</td><td>AAAA18067-AP</td><td>Reaksiyonları söndürme ve nitroselülozu yıkamak için</td></tr><tr><td>Tris baz</td><td>RPI</td><td>T60040-5000.0</td><td>Tris-HCl pH 8.0, kinaz reaksiyon tamponu için</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>RPI</td><td>P41000-2500.0</td><td>Kinaz reaksiyon tamponu için</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>RPI</td><td>M24000-500.0</td><td>Kinaz reaksiyon tamponu için</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>RPI</td><td>G22020-4000.0</td><td>Kinaz reaksiyon tamponu</td></tr><tr><td>için 5'-ATP</td><td>Promega</td><td>E6011</td><td>Kinaz substratı</td></tr> <tr><td>[&gamma; -32P] -5'-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002Z250UC&nbsp;</td><td>6.000 Ci/mmol</td></tr><tr><td>96 kuyulu nokta leke aparatı</td><td>Bio-rad</td><td>1706545</td><td>Lekelenme reaksiyonları için</td></tr><tr><td>Nitroselüloz</td><td>Whatman</td><td>32-10401396-PK</td><td>Lekelenme reaksiyonları için</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma aldrich</td><td>P3504-50G</td><td>Nitroselülozu boyamak için</td></tr></tbody></table>

bir nitroselüloz bağlama deneyi kullanılarak bakteriyel histidin kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Saflaştırılmış bakteriyel histidin kinazların otofosforilasyonunu ölçmek için yararlı bir yöntem gösteriyoruz. Histidin kinazlar, bakterilerin çevresel uyaranları algıladığı ve bunlara yanıt verdiği her yerde bulunan bir sistem olan iki bileşenli sinyal iletimine dahil olmalarıyla bilinir. İki bileşenli sinyalleme, bir histidin kinazın otofosforilasyonunu ve ardından bir yanıt düzenleyici proteinin alıcı alanına fosfotransfer yapılmasını içerir ve bu da sonuçta bir çıktı yanıtına yol açar. Histidin kinazın otofosforilasyonu, aynı kökenli bir çevresel uyaranın varlığına duyarlıdır, böylece bakterilere ortamdaki değişiklikleri tespit etmek ve bunlara yanıt vermek için bir araç verir. Bakteri biyolojisindeki önemlerine rağmen, histidin kinazlar, fosfohistidinin doğal kararsızlığı nedeniyle tam olarak anlaşılamamıştır. SDS-PAGE otoradyografi gibi bu proteinleri incelemek için geleneksel yöntemlerin önemli eksiklikleri vardır. Histidin kinazları karakterize etmek için kullanılabilecek bir nitroselüloz bağlama testi geliştirdik. Bu tahlil için protokol basit ve yürütülmesi kolaydır. Yöntemimiz daha yüksek verim, daha az zaman alır ve SDS-PAGE otoradyografiden daha büyük bir dinamik aralık sunar.

<html> Temsili bir veri kümesi, fosforlu bir görüntü cihazı (Şekil 1), nitroselüloz zarın, Ponceau S boyama (Şekil 2) ve sintilasyon sayımı verileri (Şekil 3) ile çekilen bir resmi içeren oluşturulmuş oldu. Şekil 3A, bir Lineweaver-Burk grafiğine enzim kinetik sabitleri gösterir. Bu sonuçlar, gram-negatif Vibrio parahaemolyticus (gen İD 1.189.383) elde edilen bir saflaştırılmış histidin kinaz kullanılarak elde ed...

Saflaştırılmış bakteriyel histidin kinazların otofosforilasyonunu ölçmek için kullanılabilecek optimize edilmiş bir nitroselüloz bağlanma testini rapor ediyor ve gösteriyoruz. Yöntemimiz, geleneksel SDS-PAGE tabanlı tekniklere göre çeşitli avantajlara sahiptir ve bu önemli proteinleri karakterize etmek için değerli bir alternatif sunar.

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Bu protokolün genel amacı, saflaştırılmış bakteriyel histidin kinazların otofosforilasyonunu nicelleştirmektir. Bu yöntem, iki bileşenli sinyalleme alanındaki temel sorulara yanıt bulmaya yardımcı olabilir; örneğin, protein-protein etkileşimlerindeki ilgili uyaranların histidin kinazların otofosforilasyonu üzerindeki etkisi gibi.Bu tekniğin temel avantajları, oluşturulan pikomol düzeyindeki fosfohistidini doğru bir şekilde tespit etmek ve histidin kinazlar için kinetik parametreler elde etmek amacıyla kullanılabilen yüksek kapasiteli bir yöntem olmasıdır. Bir doktora sonrası araştırmacı olarak, proteine bağlı radyoaktif ligandları nicelleştirmek için nitrocellüloz membranlar üzerinde filtrasyon kullanıyorum. Bu nedenle, bakteriyel histidin kinazlardaki histidin fosforilasyonunu nicelleştirmek için benzer bir teknik geliştirmenin mantıklı olduğunu düşündüm.Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı şekilde reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması ile başlayın. 96 kuyucuklu nokta-grafiği (dot-plot) düzeneğini kurmak için, sekiz santimetreye 12 santimetre boyutunda bir nitrocellüloz membran parçası kesin. Nitrocellulozu nokta-grafiği düzeneğine yerleştirin.Membranın, aparatın sızdı

quantification-bacterial-histidine-kinase-autophosphorylation-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, tek moleküllü bir aşağı çekme testi kullanarak protein fosforilasyonunun hassas bir miktar belirleme tekniğini göstermektedir. Polietilen glikol-biyotinin işlevselleştirilmesi ve etiketli antikorların kullanılması, fosforile tirozinin özgüllük ile saptanmasını arttırır.

Protein Fosforilasyon Analizi için Tek Moleküllü Aşağı Çekme Testi: Hücre Lizatında Protein Fosforilasyonunu Ölçmek İçin Yüksek Verimli Bir Teknik

Bu video, hücre içi nükleotid ikinci haberci bağlayıcı proteinlerin sistematik yüksek verimli taraması için bir teknik olan ligand testinin diferansiyel radyal kılcal etkisini göstermektedir. Bu teknik, habercilerin hücre lizatındaki aşırı eksprese edilen hedef proteine doğrudan bağlanmasına izin verir - protein saflaştırma ihtiyacını atlar.

Ligand Testinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi: Bakteriyel Nükleotid İkinci Haberci Bağlayıcı Hücre İçi Proteinleri Tanımlamak İçin Yüksek Verimli Bir Teknik

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

İletişim kuralı küçük molekül lipid ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) ile arıtılmış hEAG1 iyon kanal protein etkileşimleri açıklar. Ölçüm BLI roman küçük molekül iyon kanal ligand tarama için potansiyel bir yöntem olabilir gösterir.

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün G2 aşamasında aktif ve birçok hücresel yolları düzenler. Burada, bir vitro kinaz tahlil için bir protokol ile bu önemli kinaz hücresel hedefleri oluşturmak üzere Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması sağlar Cdk1 mevcut.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Burada, histidin öğesini pyrophosphokinase enzimler arındırıcı ve ince tabaka Kromatografi radiolabelled yüzeylerde ve ürünler için enzimatik aktivite içinde vitrotahlil kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Enzim etkinliği tahlil herhangi bir kinaz, nükleotit cyclase veya nükleotid trifosfat hidroliz olan mekanizma içerir fosfor-devret tepki genel olarak geçerlidir.

Bir arınma ve In Vitro etkinliği tahlil için (p) ppGpp sentetaz Clostridium difficile üzerinden

Rpda gibi sınıf 1 histon uyku (hdacs), mantar enfeksiyonları tedavi etmek için potansiyel hedefler olarak önem kazanmıştır. Burada, histon deasetilaz inhibitörlerinin in vitro etkinliğini test etmesini sağlayan bir HDAC aktivite tahlil Ile birlikte tap-Tagged rpda ' nın spesifik zenginleştirme için bir protokol sunuyoruz.

Enzimatik aktivite assay için Filasentous mantar Aspergillus nidulans bir tap-Tagged histon Deacetylase tek adımlı zenginleştirme

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Bu protokol, küçük DNA ve RNA yüzeyleri üzerinde polinükleotid kinazların (PNKs) kinaz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan bir testi tanımlar.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Mevcut protokol, geliştirilmiş bir tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi kullanarak protein fosforilasyonunu ölçmek için numune hazırlama ve veri analizini açıklamaktadır.

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Spesifik inhibitörleri taramak için hızlı ve doğru kimyasal tahliller, ilaç geliştirme cephaneliğinde önemli bir araçtır. Burada, HAT1 asetilasyon aktivitesinin inhibisyonunu ölçmek için ölçeklenebilir bir asetil-tıklama kimyası testi sunuyoruz.

Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

Öğrenin bakteriyel histidin kinaz otofosforilasyonunu nitroselüloz bağlama deneyi ile nicelendirmeyi. Bu yüksek verimli yöntem, pikomol düzeyinde fosfohistidin tespiti ve kinetik parametre elde edilmesini sağlar.

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

Daha fazla video keşfet