bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

Bu protokolün genel amacı, saflaştırılmış bakteriyel histidin kinazların otofosforilasyonunu nicelleştirmektir. Bu yöntem, iki bileşenli sinyalleme alanındaki temel sorulara yanıt bulmaya yardımcı olabilir; örneğin, protein-protein etkileşimlerindeki ilgili uyaranların histidin kinazların otofosforilasyonu üzerindeki etkisi gibi.

Bu tekniğin temel avantajları, oluşturulan pikomol düzeyindeki fosfohistidini doğru bir şekilde tespit etmek ve histidin kinazlar için kinetik parametreler elde etmek amacıyla kullanılabilen yüksek kapasiteli bir yöntem olmasıdır. Bir doktora sonrası araştırmacı olarak, proteine bağlı radyoaktif ligandları nicelleştirmek için nitrocellüloz membranlar üzerinde filtrasyon kullanıyorum. Bu nedenle, bakteriyel histidin kinazlardaki histidin fosforilasyonunu nicelleştirmek için benzer bir teknik geliştirmenin mantıklı olduğunu düşündüm.

Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı şekilde reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması ile başlayın. 96 kuyucuklu nokta-grafiği (dot-plot) düzeneğini kurmak için, sekiz santimetreye 12 santimetre boyutunda bir nitrocellüloz membran parçası kesin. Nitrocellulozu nokta-grafiği düzeneğine yerleştirin.

Membranın, aparatın sızdırmaz olduğundan ve tüm kuyucukların membran tarafından tamamen kapatıldığından emin olacak şekilde yerleştirildiğini kontrol edin. Filtratı toplamak için aparatı ikincil bir yan kollu erlene bağlayın. Valf gövdesinden, ikincil erlenin devrilmesini önleyerek aparatın rahatça kullanılmasına olanak tanıyan uygun bir hortum bağlayın.

Ardından, ikincil yan kol balonu bir aspiratör vakum kaynağına bağlayın. Cihaza vakum uygulayarak düzeneğin tamamen sızdırmaz olduğunu test edin. Düzenek doğru şekilde kurulmuşsa, tüm kuyucuklarda güçlü bir vakum oluşacaktır.

Sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için tüm boru bağlantıları Parafilm veya streç film ile sarılabilir. Başlatmadan önce, metin protokolünde açıklandığı üzere, dört reaksiyon bileşeninin tamamını dört X'lik stok çözeltiler olarak hazırlayın. Reaksiyon tamponu, histidin kinaz ve çift distile suyun eşit hacimlerini karıştırın.

Bu reaksiyon bileşenlerinin oda sıcaklığında kısa bir süre dengelenmesini sağlayın. Reaksiyonu başlatmak için bir hacim gamma-32 P ATP çözeltisi ekleyin ve pipetle aşağı yukarı hareket ettirerek karıştırın. Geçen reaksiyon süresini bir zamanlayıcı ile takip edin ve reaksiyonun istenen süre boyunca ilerlemesine izin verin.

Reaksiyonu durdurun. Reaksiyondan bir alikotu 325 millimolar fosforik asit içerisine ekleyin. Tüm reaksiyonlar sonlanana kadar durdurulmuş reaksiyonları derhal buz üzerine yerleştirin.

Önceden monte edilmiş 96 kuyucuklu dot-plot düzeneğini ikincil bir kaba yerleştirin. Kullanım sonrası düzenek ve membran radyoaktif hale geleceği için bu kap, düzeneğin içinde kolayca sökülebileceği kadar büyük olmalıdır. 96 kuyucuklu dot-plot düzeneğine vakum uygulayın.

Cihaz vakum altına alındıktan sonra, sönümlenmiş reaksiyonu her bir kuyucuktaki nitroselüloz membrana dikkatlice pipetleyin. Tüm reaksiyonlar membrana yüklenene kadar bu işlemi tekrarlayın. Nitroselülozun bağlanma kapasitesi, damlatılan histidin kinaz miktarından daha fazla olduğu için, doğru şekilde yüklendiğinde kinazın neredeyse tamamının membrana bağlandığı varsayılabilir.

Kullanılan aparata bağlı olarak, nitroselülozu delmemeye dikkat edin. Reaksiyonun tamamının nitroselülos ile temas ettiğini gözlemleyin. Reaksiyonun bir kısmının kuyucuk duvarlarına yapışması kolaydır.

Kuyucukları 100 µL buz soğuğunda 25 mM fosforik asit ile yıkayın. Bu işlem, kuyucukta hapsolmuş olabilecek herhangi bir reaksiyon hacminin membrana ulaşmasını sağlayarak tüm reaksiyonların eksiksiz yüklenmesini garanti edecektir. Tüm hacmin membran üzerinden akmasına izin verin.

Vakumu kapatmadan önce düzeneği dikkatlice sökün. Bu aşamada hem düzeneğin hem de nitrocellulose membranın radyoaktif olduğunu unutmayın. İkincil kaptan herhangi bir düzenek bileşenini çıkarmayın.

Nitrocellulose membranı bir penset yardımıyla dikkatlice aparattan alarak, yaklaşık 200 mililitre 25 milimolar buz gibi soğuk fosforik asit içeren bir kaba aktarın. Yıkama işlemi radyoaktif olacağı için kabın kapağını kapatın. Bu aşamada vakum kapatılabilir.

Yıkama membranının bulunduğu kabı bir sarsıcıya yerleştirin. Membranı 20 dakika boyunca hafifçe sallanmaya bırakın. 20 dakika sonra, kullanılan yıkama solüsyonunu geçici atık depolama için kullanılacak büyük bir kovaya dikkatlice boşaltın.

Membrana 200 mililitre buz soğukluğunda 25 milimolar fosforik asit ekleyin. Membrandaki arka plan gama-32 P ATP sinyalini gidermek için membranı bu şekilde en az üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamanın ardından, kullanılan yıkama solüsyonunu bir Geiger sayacı ile radyasyon açısından test edin.

Yıkama solüsyonunda hiçbir sinyal kalmayana kadar membranı yıkamaya devam edin. Membran yeterince yıkandıktan sonra, genellikle beş dakika veya daha kısa süren bir süre boyunca membranın havada kurumasına izin verin. Nitrocellulozun, metin protokolünde açıklandığı şekilde fosforlu yeşil ışığa maruz bırakılmasının ardından, Ponceau S boyama ve boya giderme işlemleri için hazırlık yapın.

Nitrocellüloz membranı bir ila iki dakika boyunca kısaca Ponceau S boyama çözeltisine daldırın. Boyanın giderilmesi işleminden önce membranın tamamının boya ile ıslanmasını sağlayın. Ardından, membrandaki fazla Ponceau S çözeltisini dökün.

Sadece histidin kinazdan gelen lekeler boyalı kalana kadar membranı çift distile su ile durulayın. Bu prosedürün yalnızca tüm lekelerin saptanabilir miktarda protein içerdiği durumlarda çalışacağını unutmayın. Makas kullanarak, nitrocellulose membran üzerindeki her bir lekeyi kesin.

Boyalı lekenin kenarından mükemmel bir şekilde kesmek gerekli değildir. Membran yeterince yıkandıysa, kesilen lekelerin boyutlarının farklı olması nedeniyle oluşacak arka plan etkisi ihmal edilebilir düzeydedir. Sadece her reaksiyon için lekenin tamamının kesilip çıkarılması önemlidir.

Pens kullanarak, her bir spotu dikkatlice sintilasyon tüplerine aktarın. Fosfor 32, Cherenkov radyasyonu ile kolayca tespit edilebildiği için sintilasyon kokteyline gerek yoktur. Ardından, gama-32 P ATP çözeltisinin çeşitli dilüsyonlarını bir santimetreye bir santimetre boyutundaki nitroselüloz karelere damlatın.

Pens yardımıyla, her bir kareyi dikkatlice sintilasyon kokteyli içermeyen sintilasyon şişelerine aktarın. Bu örnekler, ATP çözeltisinin pikomol başına dakika başına sayım değerini belirlemek için bir standart eğri oluşturmak amacıyla kullanılacaktır. Nitrocelluloz membranın Ponceau boyaması burada gösterilmiştir.

Boyama tüm örneklerde homojendir ve bu durum tüm örneklerin eşit miktarda yüklendiğini göstermektedir. Nitrocellüloz membranın florografi sonuçları, her bir noktadaki radyolojik olarak işaretli fosfohistidinle ilgili göreceli düzeyi göstermektedir. Dördüncü ve sekizinci sıralar, fazla ATP'nin nitrocellüloz membrandan yıkandığını kanıtlayan negatif kontrollerdir.

Histidin kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesine ilişkin temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. Bu veriler, membrandan kesilip alınan her bir noktanın sintilasyon sayımıyla elde edilmiştir. Burada gösterilen, pikomol ATP başına dakika başına sayım miktarını içeren standart eğri de sintilasyon sayımıyla oluşturulmuştur ve her örnekte bulunan fosfohistidin pikomollerini hesaplamak için kullanılır.

Bu prosedürün ardından, bu katkı maddelerinin kinaz aktivitesi üzerindeki etkisi gibi ek soruları yanıtlamak için, kognat uyaranların veya kinaz aktivitesini modüle ettiği varsayılan proteinlerin eklenmesi gibi diğer yöntemler deneyle birleştirilebilir. Radyoaktivite ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirirken, uygun radyasyon güvenliği eğitimi ile kişisel koruyucu ekipman ve zırhlama kullanımı gibi önlemler her zaman alınmalıdır.