bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

Bu protokolün genel amacı, saflaştırılmış bakteriyel histidin kinazların otofosforilasyonunu ölçmektir. Bu yöntem, iki bileşenli sinyalizasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Protein-protein etkileşimlerindeki akraba uyaranların histidin kinazların otofosforilasyonu üzerindeki etkisi gibi.

Bu tekniğin temel avantajları, oluşan fosfohistadin pikomollerini doğru bir şekilde tespit etmek ve histidin kinazlar için kinetik parametreler elde etmek için kullanılabilen yüksek verimli bir yöntem olmasıdır. Doktora sonrası bir araştırmacı olarak, proteine bağlı radyoaktif ligandları ölçmek için nitroselüloz membranlar üzerinde filtrasyon kullanıyorum. Sonuç olarak, bakteriyel histidin kinazlarda histidin fosforilasyonunu ölçmek için benzer bir teknik geliştirmek mantıklıydı.

Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanmasıyla başlayın. 96 kuyulu nokta grafiği aparatını kurmak için, sekiz santimetreye 12 santimetrelik bir nitroselüloz membran parçası kesin. Nitroselülozu nokta grafiği aparatına yerleştirin.

Membranın, aparatın sızdırmaz hale getirileceği ve tüm kuyucukların tamamen membran tarafından kaplanacağı şekilde oturduğundan emin olun. Filtratı toplamak için, aparatı ikincil bir yan kol şişesine bağlayın. Valf gövdesinden, aparatın ikincil şişeyi devirmeden rahatça kullanılmasını sağlamak için yeterli boruyu bağlayın.

Ardından, ikincil yan kol şişesini bir aspiratör vakum kaynağına bağlayın. Aparata bir vakum uygulayarak aparatın tamamen sızdırmaz olduğunu test edin. Cihaz doğru bir şekilde monte edilirse, tüm kuyucuklarda güçlü bir vakum bulunacaktır.

Tüm boru bağlantıları, sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için Parafilm veya Saran sargısına sarılabilir. Başlatmadan önce, dört reaksiyon bileşeninin tümünü metin protokolünde açıklandığı gibi dört X stok çözeltisi olarak hazırlayın. Eşit hacimlerde reaksiyon tamponu, histidin kinaz ve çift damıtılmış suyu karıştırın.

Bu reaksiyon bileşenlerinin kısa bir süre için oda sıcaklığında dengelenmesine izin verin. Reaksiyonu başlatmak için bir hacim gama-32 P ATP çözeltisi ekleyin ve yukarı ve aşağı pippetleyerek karıştırın. Geçen reaksiyon süresini bir zamanlayıcı ile takip edin ve reaksiyonun istenen süre boyunca ilerlemesine izin verin.

Reaksiyonu söndürün. 325 milimolar fosforik aside reaksiyonun bir alikotunu ekleyin. Tüm reaksiyonlar sona erene kadar söndürülmüş reaksiyonları hemen buzun üzerine yerleştirin.

Önceden monte edilmiş 96 kuyulu nokta grafiği aparatını ikincil bir kaba yerleştirin. Bu kap, kullanımdan sonra cihaz ve zar radyoaktif olacağından, aparatın kolayca sökülebileceği kadar büyük olmalıdır. 96 kuyulu nokta grafiği aparatına bir vakum uygulayın.

Cihaz vakum altına girdikten sonra, söndürülmüş reaksiyonu doğrudan her bir kuyucuktaki nitroselüloz membrana dikkatlice pipetleyin. Tüm reaksiyonlar membran üzerine yüklenene kadar bu işlemi tekrarlayın. Nitroselülozun bağlanma kapasitesi, benekli histidin kinaz miktarından daha büyük olduğundan, kinazın neredeyse tamamının doğru şekilde yüklendiğinde zara bağlandığı varsayılabilir.

Kullanılan aparata bağlı olarak nitroselülozu delmemeye dikkat edin. Reaksiyonun tamamının nitroselüloz ile temas ettiğini gözlemleyin. Reaksiyonun bir kısmının kuyu duvarlarına yapışması kolaydır.

Kuyuları 100 mikrolitre buz gibi soğuk 25 milimolar fosforik asitle yıkayın. Bu, kuyuda sıkışmış olabilecek herhangi bir reaksiyon hacminin zara ulaşmasına izin verecek ve tüm reaksiyonların tam olarak yüklenmesini sağlayacaktır. Tüm hacmin zardan akmasına izin verin.

Vakumu kapatmadan önce cihazı dikkatlice sökün. Şu anda hem aparatın hem de nitroselüloz membranın radyoaktif olduğunu unutmayın. İkincil kaptan herhangi bir aparat bileşenini çıkarmayın.

Forseps ile, nitroselüloz zarı aparattan yaklaşık 200 mililitre 25 milimolar buz gibi soğuk fosforik asit içeren bir kaba dikkatlice aktarın. Yıkama radyoaktif olacağından bu kabın üzerine bir kapak yerleştirin. Şu anda, vakum kapatılabilir.

Yıkama membranı ile kabı bir külbütör üzerine yerleştirin. Membranın 20 dakika boyunca hafifçe sallanmasına izin verin. 20 dakika sonra, kullanılmış yıkama solüsyonunu geçici atık depolaması için kullanılacak büyük bir kovaya dikkatlice boşaltın.

Membrana 200 mililitre buz gibi 25 milimolar fosforik asit ekleyin. Membrandan arka plan gama-32 P ATP sinyalini çıkarmak için membranı bu şekilde en az üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, kullanılmış yıkama solüsyonunu bir Geiger sayacı ile radyasyon açısından test edin.

Yıkama solüsyonunda herhangi bir sinyal kalmayana kadar membranı yıkamaya devam edin. Membran yeterince yıkandıktan sonra, membranın kısa bir süre kurumasına izin verin, bu genellikle beş dakika veya daha az sürer. Nitroselülozun metin protokolünde açıklandığı gibi bir fosfor yeşiline maruz bırakılmasından sonra, Ponceau S boyama ve leke giderme için hazırlanın.

Nitroselüloz membranı bir ila iki dakika boyunca Ponceau S boyama solüsyonuna kısa bir süre daldırın. Leke çıkarmadan önce tüm zarı leke ile ıslatın. Ardından, fazla Ponceau S'yi zardan boşaltın.

Sadece histidin kinazdan gelen lekeler lekelenene kadar membranı çift damıtılmış su ile durulayın. Bu prosedürün yalnızca tüm noktalar tespit edilebilir miktarda protein içeriyorsa işe yarayacağını unutmayın. Makas kullanarak nitroselüloz membran üzerindeki her noktayı kesin.

Lekeli noktanın kenarı boyunca mükemmel bir şekilde kesmek gerekli değildir. Membran yeterince yıkanmışsa, değişen boyuttaki kesme noktalarından dolayı arka plan ihmal edilebilir düzeydedir. Her reaksiyon için sadece tüm noktayı kesmek önemlidir.

Forseps kullanarak, her noktayı dikkatlice parıldama şişelerine aktarın. Fosfor 32, Cherenkov radyasyonu ile kolayca tespit edilebildiği için sintilasyon kokteyli gerekli değildir. Daha sonra, gama-32 P ATP çözeltisinin birkaç seyreltmesini bir santimetre ila bir santimetre kare nitroselüloz üzerine yerleştirin.

Forseps kullanarak, her kareyi dikkatlice parıldama şişelerine parıldama kokteyli olmadan aktarın. Bu numuneler, ATP çözeltisinin pikomole başına dakika başına sayımlarını belirlemek için standart bir eğri oluşturmak için kullanılacaktır. Nitroselüloz membranın Ponceau boyaması burada gösterilmiştir.

Boyama, tüm numuneler boyunca aynıdır, bu da tüm numunelerin eşit şekilde yüklendiğini gösterir. Nitroselüloz membranın florografi sonuçları, her bir noktada radyoaktif işaretli fosfohistidin nispi seviyesini gösterir. Dördüncü ve sekizinci sıra, fazla ATP'nin nitroselüloz membrandan yıkandığını gösteren negatif kontrollerdir.

Histidin kinaz otofosforilasyonunun miktar tayininin temsili sonuçları burada gösterilmiştir. Bu veriler, zardan kesilen her noktanın parıldama sayımından üretilir. Burada gösterilen ATP'nin pikomole başına dakikadaki standart sayım eğrisi de sintilasyon sayımından üretilir ve her numunede bulunan fosfohistidin pikomollerini hesaplamak için kullanılır.

Bu prosedürü takiben, bu katkı maddelerinin kinaz aktivitesi üzerindeki etkisi gibi ek soruları yanıtlamak için deneye, kinaz aktivitesini modüle ettiği varsayılan akraba uyaranların veya proteinlerin eklenmesi gibi diğer yöntemler eklenebilir. Radyoaktivite ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedür gerçekleştirilirken uygun radyasyon güvenliği eğitimi ve kişisel koruyucu ekipman ve kalkan kullanımı gibi önlemler her zaman alınmalıdır.