Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli numune tiplerinde düşük frekanslı somatik mutasyonları tespit etmektir. Bu metodoloji, çok düşük frekanslı mutasyonların tespitini kolaylaştırarak somatik mutasyon testindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Burada kemik iliği örneklerinde myd88 genindeki mutasyonları arayacağız.

Bu tekniğin temel avantajı, çok az sayıda neoplastik hücrede bile somatik mutasyonların varlığı hakkında son derece doğru ve hassas bilgiler sağlamasıdır. Bu vahşi tip bloke edici PCR tabanlı dizileme testi, myd88 genindeki ekzon beşin bir kısmını amplifiye etmek ve L265 sıcak noktasının kapsamını sağlamak için geliştirilmiştir. İleri ve geri primerler, ücretsiz sekanslama primerlerinin diz çökmesine izin vermek için beş asal M13 dizisi ile tasarlanmıştır.

Bloke edici oligonükleotidi yaklaşık 10 ila 15 baz uzunluğunda olacak ve mutant zenginleştirmenin istendiği vahşi tip şablonuna tamamlayıcı olacak şekilde tasarlayın. Daha kısa bir oligo, uyumsuzluk ayrımcılığını iyileştirecektir. Yüksek hedef özgüllüğü elde etmek için, çok fazla bloke edici nükleotid kullanmamak önemlidir, çünkü bu çok yapışkan oligonükleotidlere neden olacaktır.

Bloke edici oligonükleotidi tasarlamak için Oligo Tools web sitesine giderek başlayın. Oligo TM tahmin aracını seçin. Yeni bir pencere açılacaktır.

Engellenecek vahşi tip şablonun sırasını oligo dizisi kutusuna yapıştırın. İşaretlemek için engelleyici tabanların önüne bir artı işareti ekleyin. DNA bloker hibritinin yaklaşık TM'sini belirlemek için hesapla düğmesine tıklayın.

Hesaplanan erime sıcaklıkları aşağıdaki kutularda görünecektir. Blokaj oligosunu, termodöngü sırasında uzatma sıcaklığının 10 ila 15 santigrat derece üzerinde bir erime sıcaklığına sahip olacak şekilde tasarlayın. Burada uzatma sıcaklığı 72 santigrat derecedir.

Erime sıcaklığını ayarlamak için engelleme tabanları ekleyin, çıkarın veya yerine koyun. Üç ila dört blokaj C veya G tabanının uzun süre gerilmesinden kaçının. Ardından, ikincil yapı oluşumunu veya kendi kendine dimerizasyonu önlemek için Oligo Tools web sitesi ana ekranına geri dönün ve Oligo Optimizer aracını seçin.

Yeni bir pencere açılacaktır. Engellenecek vahşi tür şablonunun sırasını kutuya yapıştırın. Engelleme tabanlarını belirtmek için bir artı işareti ekleyin.

İkincil yapı ve yalnızca öz için iki kutuyu seçin ve hibridizasyon ve ikincil yapı puanlarını görmek için analiz düğmesine basın. Bu puanlar, sırasıyla öz dimerlerin ve ikincil yapıların erime sıcaklıklarının çok kaba tahminlerini temsil eder. Daha düşük puanlar optimaldir ve engelleyici engelleyici eşleştirmesini sınırlayarak elde edilebilir.

Daha düşük puanlar elde etmek için bloke edici nükleotidleri çıkarın veya yeniden konumlandırın. Burada gösterilen myd88 için optimize edilmiş bloke edici oligo nükleotid, DNA bloker hibrit erime sıcaklığı ile yeterince düşük hibridizasyon ve ikincil yapı skorları arasında bir denge kurar. Q262 ila I266 amino asitlerini kapsayacak şekilde tasarlanmıştır ve hem DNA polimeraz tarafından uzamayı hem de üç asal eksonükleaz tarafından bozunmayı inhibe etmek için üç asal ters çevrilmiş DT'ye sahiptir.

Primerler tasarlandıktan sonra, vahşi tip bloke edici PCR'yi ayarlayın ve ekteki belgede açıklandığı gibi termosiklasyon gerçekleştirin. Manyetik boncukları dört santigrat derecede depodan çıkarın ve oda sıcaklığına getirin. 10 mikrolitre PCR ürününü yeni bir PCR plakasına aktarın.

Manyetik parçacıkları tamamen yeniden süspanse etmek için manyetik boncukları kuvvetlice girdaplayın ve ardından yeni plaka üzerindeki her bir oyuğa 18 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin. Karıştırmak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra plakayı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, boncukları çözeltiden ayırmak için PCR plakasını iki dakika boyunca yan etekli mıknatıs plakasına yerleştirin. Süpernatanı aspire etmek için çok kanallı bir pipet kullanın. Boncuk peletinden kaçınmaya dikkat edin.

Daha sonra, her bir oyuğa 150 mikrolitre% 70 etanol dağıtın ve plakayı oda sıcaklığında en az 30 saniye inkübe edin. Daha sonra etanolü çok kanallı bir pipetle aspire edin ve uçları atın. Bu yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın.

20 mikrolitrelik çok kanallı bir pipet kullanarak, kalan etanolü her bir oyuktan aspire edin ve uçları atın. Plakanın kuyucuklarının kuruması için yaklaşık 10 dakika bekledikten sonra, mıknatıstan çıkarın ve her kuyucuğa 40 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Karıştırmak için 15 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Daha sonra oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. İnkübe ettikten sonra, boncukları çözeltiden ayırmak için PCR plakasını bir dakika boyunca mıknatıs plakasına geri yerleştirin. 35 mikrolitre saflaştırılmış ürünü yeni bir PCR plakasına aktarın ve ekteki belgede açıklandığı gibi çift yönlü sıralama yapın.

Dizileme ürünlerini saflaştırmak için çift yönlü dizileme yapıldıktan sonra, PH 5.2 ve% 100 etanolde 25 adet üç molar sodyum asetat çözeltisinde taze bir tane hazırlayın. Ayrıca% 70 etanol içeren taze bir çözelti hazırlayın. Hem ileri hem de geri sıralama plakalarının her bir oyuğuna% 100 etanol içinde 30 mikrolitre sodyum asetat ekleyin ve karıştırmak için beş kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Sonra plakayı tekrar kapatın ve karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 20 dakika geçtikten sonra, plakayı 15 dakika boyunca 2.250 kez G'de santrifüjleyin. Sıkma işleminden sonra, plaka kapatıcıyı çıkarın ve plakayı bir atık kabının üzerine bir kez ters çevirin.

Plaka birden çok kez ters çevrilirse, peletler kuyu diplerinden gevşeyebilir. Ters çevrilmiş plakayı temiz bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve bir dakika boyunca 150 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, her bir oyuğa 150 mikrolitre% 70 etanol ekleyin ve plakayı tekrar kapatın.

Beş dakika boyunca 2.250 kez G'de döndürün. Ardından plaka kapatıcıyı çıkarma ve plakayı ters çevirme işlemini tekrarlayın. Kuyular tamamen kuru değilse, oda sıcaklığında kurumaya bırakın.

Numunelerin ışıktan korunduğundan emin olun. Kuyucuklar tamamen kuruduktan sonra, her bir oyuğa 10 mikrolitre formamid ekleyin ve karıştırmak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Plakayı tekrar kapatın.

Üç dakika boyunca 95 santigrat derecede bir termo döngüleyici kullanarak denatüre edin, ardından beş dakika boyunca dört santigrat derece. Denatüre ettikten sonra, plaka kapatıcıyı bir septa ile değiştirin ve üreticinin talimatlarına göre bir sıralama platformunda sıralayın. Dizi analizi yazılımını kullanarak izleri görselleştirin ve dizileri uygun referans dizilerine hizalayın.

myd88'i NCBI referans dizisi NM002468 hizalayın. Mutasyonu olan ve olmayan hastalardan alınan genomik DNA'ya hem konvansiyonel hem de vahşi tip bloke edici PCR uygulandı ve elde edilen PCR ürünleri daha sonra dizilendi. Burada görülebileceği gibi, vahşi tip bloke edici PCR yapıldığında mutant alel zenginleştirildi ve vahşi tip DNA'da yanlış pozitifler görülmedi.

Burada gösterildiği gibi sinyal yoğunluğunda karakteristik bir düşüş, genellikle çok yüksek bir bloker konsantrasyonu kullanılırsa veya PCR saflaştırması sonrası çift yönlü dizilemeden önce bloker çıkarılamazsa görülür. Bu, manyetik boncuk saflaştırması yerine enzimatik saflaştırma yapıldığında meydana gelir. Mutant aleller için zenginleştirme yapan herhangi bir PCR bazlı test, düşük frekanslı artefaktları tespit edecektir.

Bu izler, sitozin veya metillenmiş sitozin, sırasıyla urasil veya tiamine formal infiksasyon yoluyla deamine edildiğinde, FFPE dokusundaki TA artefaktlarına göre CG dizileme artefaktlarında bir artış gösterir. Urasil DNA glikozilaz veya UDG, vahşi tip bloke edici PCR'den önce urasili eksize edebilir ve dizileme artefaktlarını azaltmaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, CPG adalarında sıklıkla meydana gelen deamine beş metil sitozinden kaynaklanan tiamin, UDG tarafından eksize edilemez.

Yabani tip blokaj PCR'de kullanılan bloker konsantrasyonunun azaltılması, UDG tedavisi ile düzeltilmeyen dizileme artefaktlarının oluşumunu azaltmaya yardımcı olabilir. Bu videoyu izledikten sonra, vahşi tip engelleme tekniğini kullanarak somatik mutasyonları yüksek derecede doğruluk ve hassasiyetle nasıl test edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu teknolojinin prensibi, hücrelerin küçük alt popülasyonlarındaki mutasyonların tespitine uygulanabilir.

Bu nedenle, minimal rezidüel hastalığı tespit etmede, hastaları izlemede ve çeşitli neoplazmları olan hastalarda erken nüksü tahmin etmede faydası vardır.