Morfolojik Ölçümler dayanarak büyük ölçekli yeniden düzenlemesi ve Bağımsız, Unbiased Kümelenme Seçici Populasyonlarında Nöronlar Sınıflandıran
15 Şubat 2017
Bu protokol değiştirilmiş kuduz virüsü floresan işaretlerini ifade ve bağımsız, tarafsız küme farklı nöronal alt sınıfları arasında morfolojik metrik kapsamlı karakterizasyonu olanak analizleri ile retrograd enfeksiyonu takiben etiketli seçici nöronal popülasyonlarının büyük ölçekli rekonstrüksiyon açıklar.
Bu protokolün amaçları, virüs etiketli nöronların morfolojisini yeniden yapılandırma adımlarını tanımlamak ve farklı nöronal alt sınıflar boyunca morfolojik metriklerin kapsamlı karakterizasyonunu sağlamak için etiketli nöron popülasyonları üzerinde bağımsız, tarafsız küme analizleri yapmaktır. Seçici bir nöronal popülasyon içinde morfolojik olarak benzersiz nöronal tiplerin daha kapsamlı örneklemesini ve tarafsız sınıflandırmasını kolaylaştırmak için nöroanatomik verilerin toplanması ve analiz edilmesi için yeni bir yaklaşımın ana hatlarını çiziyoruz. Bu tekniğin temel avantajı, nöronal morfolojinin büyük ölçekli analizini mümkün kılması ve farklı nöronal alt sınıfları sınıflandırmak için tarafsız yöntemler kullanmasıdır.
Morfolojik rekonstrüksiyonların en zorlu yönleri, yeniden yapılandırılacak iyi izole edilmiş nöronları seçmek, uygun z-derinliğini atamak ve bitişik doku bölümleri boyunca rekonstrüksiyonlara devam etmek için direkleri hizalamaktır. EGFP eksprese eden modifiye kuduz virüsü ile stereotaksik olarak enjekte edilmiş bir primattan lekeli 50 mikronluk bir beyin dokusu kesiti taşıyan bir slayt seçerek rekonstrüksiyona başlayın. Slaytı mikroskop slayt tutucusuna yerleştirin ve düşük büyütme objektifi kullanarak ilgilenilen tek bir bölüme odaklanın.
Kamera deklanşörünü doğru şekilde konumlandırarak kamera görüntüsünün canlı görüntüde görünür olduğundan emin olun. Dendritik arborizasyonun kesin olarak yeniden yapılandırılmasını sağlamak için ilgilenilen beyin yapısı içinde makul bir şekilde izole edilmiş etiketli bir nöron seçin. 10x büyütmeye geçin ve alanı netleştirin.
Tercihen, hücre gövdesi tamamen tek bir bölüm içindeyse, alanını ve yuvarlaklığını doğru bir şekilde tahmin etmek için nöronları seçin. İyi lekelenmiş, iyi izole edilmiş bir nöron seçildikten sonra, hücre gövdesini içeren ana bölümü bölüm yöneticisine eklemek için yazılımdaki yeni bölüm düğmesine tıklayın. Yeniden yapılandırmaya dahil edilecek bölüm sayısını girin.
Başlamak için iki ila üç bölüm eklemenizi öneririz. 50 mikronluk bir kesit kalınlığı atayın. İki x hedefini seçin, ardından üst araç çubuğundaki kontur düğmesine tıklayın ve açılır menüden kontur türünü seçin.
Kontur boyunca noktalara tıklamak için fareyi kullanarak hedef yapının konturunu izleyin. Konturu izlemeyi bitirdiğinizde, fareye sağ tıklayın ve konturu kapatmak için menüden konturu kapat'ı seçin. Ardından, görünüm hala iki x'teyken, sol araç çubuğunda istediğiniz işaretçi sembolüne tıklayın.
Ardından, işaretçiyi yerleştirmek için hedef yapının ortasına tıklayın. Konturlar tamamlandıktan sonra, hücre gövdesinin ana hatlarını izlemek için 40x veya 60x hedefini seçin. Ardından üst araç çubuğundaki nöron izleme düğmesini seçin ve açılır menüden izlenecek nöron yapısını, bu durumda hücre gövdesini seçin.
Hücre gövdesinin en büyük bölümünün etrafındaki noktalara tıklayarak, hücre gövdesini odaklamak için z-derinliğini gerektiği gibi ayarlayarak hücre gövdesini izleyin. Ve hücre gövdesi konturunu tamamlamak için fareye sağ tıklayın. Ardından, hücre gövdesi konturunun ortasına farklı bir stil işaretçisi yerleştirin ve işaretçinin kabaca z derinliğinde merkezde olduğundan emin olun.
Z ekseni değerlerinin doğru olması için her izlemeye başlamadan önce ana bölümde ve bitişik bölümlerde doğru z derinliğini belirlemek çok önemlidir. Dendritik direkleri izlemeye başlamak için üstteki açılır menüden dendrit'i seçin.
Daha sonra hücre gövdesinden başlayarak her bir dendriti izleyin. Bir dendrit dallandığında, fareye sağ tıklayın ve bu dal noktasına bir düğüm yerleştirmek için çatallanan düğümü veya çatallanan düğümü seçin. Dendritin açısını ve yönünü doğru bir şekilde yakalamak için izleme boyunca z derinliğini ayarladığınızdan emin olun.
Bu bölümdeki dendritin sonunda, fareye sağ tıklayın ve açılır menüden bitiş'i seçin. Tüm dendritik direkler ana bölümde izlendiğinde, muhtemelen bitişik bölüme devam edecek olan dendritik uçları belirleyin. Ve bunları mikroskop görüntüsünde 20x'te uygun z-derinliğinde odak noktasına getirin.
Mikroskop görüntüsünde kan damarları veya kolayca tanınabilir dendrit desenleri veya demetleri gibi yakındaki önemli yer işaretlerini ekleyin. Ardından, bilgisayar ekranına elde taşınan bir dijital kamera kullanarak canlı görüntünün resmini çekin. Ardından mikroskop objektifini iki x'e getirin ve slayttaki bitişik bölüme geçin.
Ardından, yazılım görünümünde daha önce izlenen bölümün konturlarını yeni bölümdeki LGN ve TRN'nin sınırlarıyla hizalayın. 20x'e dönün ve yer işaretlerini kullanarak hizalayın. Ardından, daha önce izlenen bölümden dendrit uçlarının fotoğrafının yardımıyla, yeniden yapılandırmayı seçmek için önce ok aracını kullanarak dendritleri hizalamak için izlemeyi hareket ettirin.
Ardından sağ tıklayın ve açılır menüden taşı'yı seçin ve izlemeyi buna göre hareket ettirin. İzlemeyi döndürmek için sağ tıklayın ve açılır menüden döndür'ü seçin ve izlemeyi buna göre döndürün. Alternatif olarak, en üstteki araçlar açılır menüsünden eşleştirme aracını seçin ve eşleştirilecek puan sayısını seçin.
Ardından, dendritik sonları başlangıçlarla eşleştirmek için rekonstrüksiyondaki sona ve canlı görüntüdeki ilgili devam noktasına tıklayın. Önceki bölümdeki izleme, yeni bölümdeki dendritlerle aynı hizaya getirildikten sonra, daha önce olduğu gibi bölüm yöneticisine yeni bir bölüm ekleyin. Alternatif olarak, daha önce oluşturulmuş olan bitişik bölümü seçin ve z derinliğini aynı şekilde ayarlayın.
Mevcut bölüme tıklayarak bölüm yöneticisinde ilgili yeni bölümün seçili olduğundan emin olun. Ardından, büyütmeyi 40x veya 60x'e çıkardıktan sonra, oku kullanarak dendriti seçin. Önceki bölümden dendritin ucundaki fareye sağ tıklayın ve açılır menüden sona ekle'yi seçin.
Bir istem, devamın yeni bir bölümde olup olmadığını soracaktır. Evet'i tıklayın. Ardından, fareyi bir çizim aracı olarak kullanarak dendritin devamını izleyin.
Bir sonraki bölüme hizalamaya hazırlanırken sonların resimlerini çekin. Ardından, nöron için en az üç bölüm izlenene veya dendritler artık takip edilemeyecek veya bulunamayacak duruma gelene kadar dendritik izlemelere devamlar ekleyin. Nöron rekonstrüksiyon sistemi ile ilişkili bir ekstraksiyon programı kullanarak, tamamlanmış bir rekonstrüksiyon dosyasını açın.
Düzenle açılır menüsünden, tüm nesneleri seç'i seçin. Üst analiz araç çubuğundan şube yapısı analizini seçin ve ardından her sekmeye tıklayın ve her sekmede istediğiniz analiz seçeneklerini belirleyin. Analiz penceresindeki Tamam düğmesine tıklayarak istenen tüm verileri ayıklayın ve çıktı pencerelerine sağ tıklayıp daha fazla analiz için Excel'e aktar'ı seçerek bir elektronik tablo biçiminde kaydedin.
Bu fotoğraf, bir hayvanın dorsal LGN'sinden geçen tek bir koronal kesiti göstermektedir. Sitokrom oksidaz boyama, LGN katmanlarını görselleştirmek için kullanılır. Ve GFP boyama, virüs enjeksiyon bölgesini işaretler.
Ok, yoğun, retrograd olarak etiketlenmiş, talamik retiküler çekirdek nöronlarının bölgelerini gösterir. Kesit oryantasyonu, gösterilen dorsal ventral medial lateral pusulaya göredir. Ölçek çubuğu sol alt köşede gösterilmiştir.
Bu görüntü, siyah konturlarla gösterildiği gibi virüs enjeksiyonu içeren tüm bölümler için kırmızı renkte LGN'nin ve bordo renkte TRN'nin kontur ana hatlarını göstermektedir. Sarı yıldızlar enjeksiyon bölgelerinin merkezlerini gösterir. Bu görüntü, konturların ve enjeksiyon bölgesinin 3D görüntüsünü göstermektedir.
Bu, kestane renginde gösterilen tek bir agrega TRN konturu içinde küme atamasına göre renk kodlu yeniden yapılandırılmış TRN nöronlarının konumlarının bir haritasıdır. Ölçek çubuğu 500 mikronu temsil eder. Bu görüntü, TRN içindeki medial lateral konumlarına göre sıcaktan soğuğa renkli beş yeniden yapılandırılmış TRN nöronu ile siyah ve LGN'nin gri renkli toplam konturlarını göstermektedir.
Ölçek çubuğu 500 mikronu temsil eder. Bu fotoğraflar, 100 mikronu temsil eden renk uyumlu ölçek çubukları ile aynı beş TRN nöronunun detayını göstermektedir. Bu hiyerarşik dendrogram ağacı, 10 bağımsız morfolojik metriğe dayalı olarak yeniden yapılandırılmış 160 TRN nöronu arasındaki bağlantı mesafelerini gösterir ve küme analizinin genel sonuçlarını gösterir.
TRN nöronlarının üç farklı kümesi mavi, yeşil ve kırmızı renklerle gösterilmiştir. Bu nöronal rekonstrüksiyon tekniklerine hakim olduktan sonra, tek bir nöron bir ila iki saat içinde tamamen yeniden yapılandırılabilir. Nöronları yeniden yapılandırırken z-derinliğini sürekli olarak izlemek ve ayarlamak önemlidir.
Burada özetlenen protokol, geleneksel, daha önyargılı, nöroanatomik analiz yöntemlerine göre bir gelişmedir ve araştırmacıların büyük ölçekli morfolojik verilere dayanarak yeni nöron alt sınıflarını keşfetmelerini sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, bitişik doku bölümlerinden nöronların nasıl yeniden yapılandırılacağını ve daha fazla analiz için morfolojik verilerin nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, modifiye edilmiş bir kuduz virüsü ile retrograd enfeksiyon yoluyla işaretlenen nöronların morfolojisinin yeniden yapılandırılmasına yönelik bir yöntemi özetlemektedir. Protokol, morfolojik metriklere dayanarak farklı nöronal alt sınıfları karakterize etmek için tarafsız küme analizlerine vurgu yapmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Nöroanatomi
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Nöronal morfolojinin anlaşılması, nöron tiplerinin sınıflandırılması için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler, morfolojik analizlerde yanlılığa yol açabilir.
- Modifiye kuduz virüsü, spesifik nöronal popülasyonları etkili bir şekilde işaretleyebilir.
- Yanlılık içermeyen küme analizleri, nöronal alt sınıfların karakterizasyonunu geliştirir.
Çalışmanın Amacı
- Virüsle işaretlenmiş nöronların morfolojisini yeniden oluşturmak.
- İşaretlenmiş nöron popülasyonları üzerinde tarafsız küme analizleri gerçekleştirmek.
- Farklı nöronal alt sınıfların kapsamlı karakterizasyonunu kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Rekonstrüksiyon için iyi izole edilmiş nöronların seçimi.
- Doğru morfolojik temsil için uygun z-derinliğinin atanması.
- Komşu doku kesitleri boyunca arborların hizalanması.
- Boyanmış beyin dokusu kesitlerine odaklanmak için bir mikroskop kullanımı.
Temel Sonuçlar
- Nöronal morfolojinin başarılı bir şekilde büyük ölçekli analizi.
- Morfolojik olarak benzersiz nöron tiplerinin tanımlanması.
- Belirgin nöronal alt sınıfların tarafsız sınıflandırılması.
- Nöroanatomik veri toplama ve analizine dair geliştirilmiş anlayış.
Sonuçlar
- Protokol, nöronal morfoloji rekonstrüksiyonu için sağlam bir çerçeve sunmaktadır.
- Tarafsız yöntemler, nöronal alt sınıflandırmanın doğruluğunu artırır.
- Bu yaklaşım, gelecekteki nöroanatomik çalışmalara kolaylık sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu protokol, nöronal popülasyonların büyük ölçekli ve tarafsız morfolojik sınıflandırılmasını sağlayarak, nöronal alt tip tanımlamasındaki mekanistik belirsizliği azaltmak suretiyle nörobilim ilaç keşfinde hedef doğrulamasını destekler. Bu yaklaşım, nöronal devre fonksiyonuyla bağlantılı hedef hipotezlerinin riskini azaltmak için kantitatif ve tekrarlanabilir metrikler sunarak preklinik modellerdeki öngörü güvenilirliğini artırır. Morfolojik fenotiplemeyi, güçlü translasyonel sürekliliğe sahip hedefleri önceliklendirmek için ölçeklenebilir bir keşif aşaması aracı olarak konumlandırır.
Biyofarma Ar-Ge'sindeki Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Morfolojik metriklere dayalı tarafsız nöronal alt sınıflandırma yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fonksiyonel olarak farklı nöronal popülasyonları ayırt etmek için kantitatif kriterler belirleyerek biyolojik risk azaltmayı destekler.
- Öngörücü Değer: Morfolojik benzersizliği, seçici nöronal popülasyonlardaki potansiyel farklı ilaç yanıtlarıyla ilişkilendirerek hedef güvenilirliğini artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tutarlı hücresel modeller için morfolojik olarak belirgin alt sınıflar tanımlayarak, doğrulanmış nöronal sistemleri sonraki analiz geliştirme aşamalarına hazırlar.
- Operasyonel Değer: Yüksek içerikli tarama platformlarına uygun kantitatif morfolojik verilerin çıkarımı yoluyla analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Büyük ölçekli yeniden yapılandırma ve kümeleme için aktarılabilir bir iş akışı oluşturarak, platformun farklı nöronal popülasyonlar genelinde yeniden kullanılmasına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Nöropsikiyatrik bozukluk hedefleriyle ilgili primat beyin bölgelerindeki nöronal tiplerin sınıflandırılmasını sağlayarak, hastalıkla ilişkili sistem modellemesini destekler.
- Preklinik Uyum: Nöronal alt tip spesifik yolak katılımı ile korelasyon gösteren morfolojik biyobelirteçler sunarak, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını kolaylaştırır.
- Mekanistik Risk Azaltma: Hedef dışı nöronal popülasyonların kapsamlı morfolojik profillemesi yoluyla hedef seçiciliğini doğrulayarak, geç evre biyolojik riski azaltır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken hedef hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine entegre edilmekte olup, burada morfolojik sınıflandırma, hastalıkla ilgili nöronal sistemlerdeki bileşik taramasına veri sağlamaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Hastalıkla ilgili devreleri farklı şekilde modüle edebilecek nöronal alt sınıfların tarafsız bir şekilde tanımlanmasını sağlayarak hipotez testlerini ve yolakların açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: Bileşik değerlendirmesinde kullanılan nöronal modellerde tutarlılık sağlayan kantitatif morfolojik çıktılar sunarak assay hazırlık sürecini geliştirir.
- Analitik: Farklı deneysel koşullar arasındaki nöronal popülasyonların karşılaştırılmasına olanak tanıyan istatistiksel küme analizi ve morfolojik metrikler sağlar.
- Translasyonel Araştırma: İnsan beyin hedefleriyle ilgili primat nöronal sistemlerindeki morfolojik profilleme aracılığıyla keşif aşamasını preklinik doğrulamaya bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Portföy genelinde hedef doğrulaması için birden fazla nöronal popülasyon ve beyin bölgesinde uygulanabilen, yeniden kullanılabilir bir nöroanatomik profilleme kapasitesi oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nöronal alt tip sınıflandırmasındaki mekanistik belirsizliğin azaltılması yoluyla hedef doğrulamasındaki öngörü güveninin artırılması.
- Operasyonel Değer: Laboratuvarlar ve çalışmalar arasında morfolojik veri üretiminin standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Nöronal alt sınıf özgüllüğüne dayalı hedeflerin erken aşamada riskten arındırılmasını sağlayarak, geç aşama biyolojik başarısızlık riskini azaltan ve geliştirilmiş devam/durdurma kararları sunan yaklaşım.
- Portföy Etkisi: Preklinik modellerdeki nöronal popülasyonların objektif morfolojik sınıflandırması aracılığıyla, ilerleme kararlarının riskle uyumlu şekilde önceliklendirilmesi.
Uygulama Hususları
- Nöronal morfolojinin doğru şekilde yakalanması için nöroanatomik izleme, konfokal mikroskopi ve 3D rekonstrüksiyon yazılımları konusunda uzmanlık gerektirir.
- Z-kesit alma ve kalın doku kesitlerinin floresan görüntülemesini yapabilen mikroskopi altyapısının yanı sıra morfolojik çıkarım ve küme analizi için hesaplama araçlarına bağımlıdır.
- Farklı merkezler ve operatörler arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için izleme protokollerinin ve morfolojik metrik tanımlarının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Morfolojideki farklılıklar ve etiketleme verimliliği nedeniyle, yöntemin farklı nöronal popülasyonlara, beyin bölgelerine veya türlere uygulanması sırasında adaptasyon değerlendirmeleri gereklidir.
- Pratik sınırlamalar arasında, manuel izlemenin zaman alıcı doğası ile güvenilir rekonstrüksiyonlar için yüksek kaliteli viral etiketleme ve doku korumasına olan bağımlılık yer alır.
