Name: Morfolojik Ölçümler dayanarak büyük ölçekli yeniden düzenlemesi ve Bağımsız, Unbiased Kümelenme Seçici Populasyonlarında Nöronlar Sınıflandıran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Öğrenin modifiye kuduz virüsü ile etiketlenmiş nöronların morfolojisini yeniden yapılandırma ve yanıltıcı olmayan küme analizleri ile farklı nöron alt sınıflarını sınıflandırma yöntemini. Bu teknik büyük ölçekli nöroanatomik çalışmalarda kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr teşekkür etmek istiyorum. Bize önceden çalışma ve Özge Fairless ve Shiyuan Liu nöronal rekonstrüksiyon ile yardım için bir parçası olarak hazırlanan doku kullanmak için izin Ed Callaway ve Marty Usrey. ve Whitehall Vakfı: Bu çalışma NIH (EY018683 HAYIR) tarafından finanse edildi.

<ol><li>Cajal, S. R. y <a target="_blank" href="https://archive.org/details/b2129592x_0001">Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres</a>. , Maloine. (1911).</li>
<li>Seung, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+functional+connectomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toward functional connectomics.</a> Nature. 471, 170-172 (2011).</li>
<li>Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+circuit+tracing+with+neurotropic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).</li>
<li>Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+neuronal+tracing+with+a+deletion-mutant+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus.</a> Nature Methods. 4, 47-49 (2007).</li>
<li>Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+substrates+for+parallel+streams+of+corticogeniculate+feedback+originating+in+both+V1+and+V2+of+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey.</a> Neuron. 90, 388-399 (2016).</li>
<li>Cauli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+fusiform+neocortical+interneurons+based+on+unsupervised+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering.</a> PNAS. 97, 6144-6149 (2000).</li>
<li>Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+visual+sector+thalamic+reticular+neurons+in+the+macaque+monkey+sugests+retinotopically-specialized%2C+parallel+stream-mixed+input+to+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus.</a> J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/neuron/abstract/S0896-6273(11)00600-3">New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits.</a> Neuron. 71, 617-631 (2011).</li>
<li>Callaway, E. M., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+with+glycoprotein-deleted+rabies+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses.</a> Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).</li>
<li>Nhan, H. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+superior+colliculus-+and+middle+temporal+area-projecting+neurons+in+primate+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex.</a> J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thalamic+reticular+nucleus%3A+structure%2C+function+and+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept.</a> Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, e3564(2012).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Research. 171, 11-28 (1979).</li>
<li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+neuroanatomical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Basic neuroanatomical methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1(2003).</li>
<li>Thorndike, R. L. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/summary?doi=10.1.1.177.7605">Who belongs in the family?</a> Psychometrika. 18, 267-276 (1953).</li>
<li>Talebi, V., Baker, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Categorically+distinct+types+of+receptive+fields+in+early+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).</li>
<li>Helmstaedter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectomic+reconstruction+of+the+inner+plexiform+layer+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina.</a> Nature. 500, 168-174 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Nöroanatomik çalışmalar nörobilim ve connectomics ve yapı-işlev ilişkilerinin son bir ilgi ayağı seçici nöronal popülasyonlarının detaylı morfolojik karakterizasyonu için coşku yeniledi kalmıştır. Geleneksel olarak, nöroanatomik çalışmalar uzman neuroanatomists tarafından tanımlanan nöronların morfolojik farklı sınıflara nöronların nitel sınıflandırmaları yararlanmıştır. nöronlar yeniden ve morfolojik veri ayıklamak için tekniklerindeki gelişmeler sayesinde, tarafsız bir şekilde morfolojik farklı nöronal sınıfları sınıf...

Nöroanatomi &quot;connectomics&quot; in nörobilim 1 ve son faiz temellerinden biri nöronal popülasyonlarının morfolojik çeşitlilik ve belirli nöronlar 2 arasındaki bağlantıları anlamak için coşku yeniledi olduğunu. Etiketleme yöntemleri ve yeniden nöronlar büyük ölçüde genetik ve virüs aracılı devre izleme de dahil olmak üzere son yenilikler ile iyileştirilmiştir nöronal nüfus 5 daha kapsamlı morfolojik araştırmalar sağlayan, 3, 4 yaklaşır. Bireysel nöronlar etiketleme gelişmelere ek olarak, nicel veri analiz teknikleri de bu morfolojik verilerle 5, 6 dayalı farklı alt popülasyonlar halinde nöronların bağımsız ve tarafsız sınıflandırma etkinleştirmek ortaya çıkmıştır. Bu tarafsız teknikler daha Traditiona üzerine bir gelişme vardırBir asrı aşkın süredir alanında standart olmuştur l nitel sınıflandırma yöntemleri. Bu çalışmanın amacı, ana hatlarıyla adım-adım olduğunu, bir seçici nüfus içindeki nöronların virüs aracılı etiketleme kombinasyonu, bir bu nöronların kapsamlı numune ve nicel veri analizi büyük ölçekli rekonstrüksiyon ile bağımsız kümeleme dayalı İstatistiksel değerlendirme. Bu yöntemleri birleştirerek, bir selektif nöronal nüfus içinde kapsamlı örnekleme ve morfolojik eşsiz nöronal türleri tarafsız sınıflandırma kolaylaştırmak için toplama ve nöroanatomik verilerin analizi doğru yeni bir yaklaşım özetlemektedir. Bu yöntemlerin bir örneği olarak, makak maymunu talamik retiküler nükleus (TRN) tek bir sektörü içinde nöronların büyük bir nüfusun analizimizi açıklar. Bu veriler daha önceki çalışmada 7 vardır. seçici dorsal Latera projelendirme TRN nöronların etiketleme YöntemleriEGFP 4, 8 kodlayan modifiye kuduz virüsünün cerrahi enjeksiyon kullanılarak talamus (dLGN) l Dirsekli çekirdeği özetlenen (Özel Malzemeler / Ekipman, satır 2 Tablo). Bu modifiye kuduz virüsü geni, bir esas kat proteinini kodlayan virüs trans-sinaptik hareketi ortadan yoksundur. Virüs enjeksiyon yerinde akson terminalleri girdikten sonra, enfekte nöronlar 5, 9, 10, tam dendritik arborization boyunca EGFP ifade sürüş önemli yararı ile geleneksel retrograd tracer gibi davranır. Bu duruma göre, bu G-silinmiş kuduz virüs seçici bulaşabilir ve enjeksiyon ve retrograd taşıma sonraki herhangi bir nöronal popülasyonu etiket kullanılabilir. Belirli bir nöronal nüfusun geniş kapsamlı bir analizi gerçekleştirmek için, örnek için önemlidirnüfus içinde nöronların geniş bir dağılımı. Virüs-aracılı etiketleme tekniği tam hücre içi üretimi için, &quot;Golgi gibi&quot; virüs enjeksiyon yerinde akson birçok nöron doldurur, bir beyin yapısı tam kapsam dahilinde nöronların çok büyük bir örnek yeniden oluşturmak mümkündür. değiştirilmiş kuduz virüsü enfekte edilmesi ve nöron çok sayıda etiketleme de çok etkili olduğu için, ayrıca, hayvan başına nöronların yüzlerce yeniden oluşturmak mümkündür. DLGN verme TRN nöronların kapsamlı bir örnek oluşturmak için TRN 11 görsel sektör genelinde 160 nöronlar örnekleme için prosedürler özetlenmektedir. Bir mikroskop, kamera ve yeniden yazılımı içeren bir nöron rekonstrüksiyon sistemini kullanarak bireysel nöronlar yeniden süreci açıklanmıştır. Ayrıca tarif edilen (TRN içinde bu durumda) beyin yapısı içinde tek tek nöronların konumlarını belirlemek için ve virüs, enjeksiyon sit doğrulamak için yöntemlerhacimsel kontur rekonstrüksiyon kullanarak (dLGN içinde bu durumda) bir yapı içinde e hacmi ve konumu. Her bir nöron için ölçülen morfolojik ölçümlerini özetlenen morfolojik verileri dışa ve bağımsız küme gerçekleştirmek için adımlar dayalı analizleri. kümeleme yöntemleri sınırlamalar vardır ve mevcut farklı kümelenme algoritmaları çeşitli de vardır. Bu duruma göre, bu seçenekler ve daha yaygın olarak kullanılan algoritmalar bazı avantajları açıklanmaktadır. kümeleme analizi kümeleri tekliği istatistiksel doğrulama sağlamaz. Bu nedenle, ek adımlar optimum kümelenme yanı sıra içinde ve gruplar arasında morfolojik veriler arasındaki ilişkileri doğrulamak için özetlenmiştir. Bu TRN nöronlar onaylamak için TRN veri kümesi için kümeleri değerlendirmek için istatistiksel yöntemler tarif edilmiştir 10 bağımsız morfolojik metriklere dayalı üç benzersiz kümeler halinde gruplandırılmış. Böylece, seçici etiketleme için adımları özetleyerek, Yeniden ve belirli bir nöronal nüfus morfolojik verilerini analiz, bir popülasyon içindeki nöronlar arasındaki morfolojik farklılıklar ölçülmesi için yöntemler açıklanmaktadır. makak maymunu TRN&#39;nin görsel sektöründe farklı nöron tiplerinin önceki bulguları ayrı istatistiksel değerlendirme yöntemleri ile teyit edilir. Birlikte, bu teknikler, nöroanatomik veri kümelerine geniş uygulanabilir ve beyin üzerinden nöronal nüfus çeşitliliği kantitatif sınıflandırma kurmak yardımcı olacağını umuyoruz.

<table><tbody><tr><td>SAD ve Delta; G-EGFP</td><td>E.M. Callaway Laboratuvarı, Salk Enstitüsü</td><td></td><td>Dr. F. Osakada tarafından hazırlanmıştır. Salk Enstitüsü Viral Çekirdek Kayıt elektrodu aracılığıyla temin edilebilen G-silinmiş kuduz virüsü</td></tr><tr><td>: platin / iridyum veya tungsten</td><td>FHC</td><td>UEPSGGSE1N2M</td><td>Alternatif sipariş özellikleri için web sitesini (www.fh-co.com) ziyaret edin</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummod Scientific</td><td>3-000-204, 110V</td><td>Alternatifler: picospritzer, Hamilton şırınga</td></tr><tr><td>Dondurucu mikrotom</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5905-50TAB</td><td>3,3'-Diaminobenzidin tetrahidroklorür, tablet, tablet başına 10 mg substrat. Dikkat: kanserojen - atılmadan önce ağartılmalıdır</td></tr><tr><td>Sitokrom C</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2037-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>Sigma-Aldich</td><td>C9322-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-GFP</td><td>Yaşam Teknolojileri / Thermo Fisher</td><td>#A-11122&nbsp;</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>Biyotinile keçi anti-tavşan</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>#BA-1000</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Neurolucida System&nbsp;</td><td>Nöron izleme ve analizi için</td> <td>MicroBrightField</td><td></td> Yazılımı. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida</tr><tr><td>Neurolucida Explorer</td><td>MicroBrightField</td><td></td><td>Veri dışa aktarma yazılımı</td></tr><tr><td>Microfire Camera&nbsp;</td><td>Optronics</td><td></td><td>2 Megapiksel gerçek renkli mikroskop kamera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf</td></tr><tr><td>Nikon E800 Mikroskop</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>Biyolojik araştırma mikroskobu. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Matris tabanlı hesaplamalı matematik yazılımı. http://www.mathworks.com</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Elektronik Tablo programı</td></tr></tbody></table>

morfolojik Ölçümler dayanarak büyük ölçekli yeniden düzenlemesi ve bağımsız, unbiased kümelenme seçici populasyonlarında nöronlar sınıflandıran

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

Bu protokol, bağımsız ve tarafsız kümelenme kullanımı ile birlikte nöronların büyük ölçekli rekonstrüksiyon seçici nöronal nüfus arasında gözlenen morfolojik özelliklerinin kapsamlı bir anket oluşturmak için analiz özetliyor. Bu tekniklerin kombinasyonu Nöroanatomik verilerin toplanması ve analiz için yeni bir yaklaşım oluşturmaktadır. Birlikte, bu teknikler büyük ölçekli etkinleştirmek ve selektif nöronal popülasyonlarının dolayısıyla daha kapsamlı, örnekleme ve bir nüfus içinde morfolojik benzersiz nöronal sınıfları tanımlamak için tarafsız nicel yöntemler kurmak. protokol seçici nöronlar etiketlemek için modifiye kuduz virüsünün kullanımını özetliyor. ilgi hedef beyin yapısına stereotaksik enjeksiyonu takiben retrograd tracer gibi kuduz virüsü eylemleri G-silinmiş ve nöronlarda EGFP teslimat ve ifade için bir araç olarak hizmet vermektedir. nöronların çok sayıda bu kullanarak enfekteteknik ve bireysel nöronların &quot;Golgi gibi&quot; tam doldurur üreten, kendi dendritler boyunca GFP ifade eder. Buna göre, virüs aracılı retrograd izleme yöntemi tam hücre içi dolgular üreterek geleneksel boya bazlı retrograd izleme teknikleri geliştirir. çalışılan beyin bölgesi tüm bölgelerini kapsayan bireysel iyi izole edilmiş nöronları temsili bir örneği elde etmek için yeniden için seçilir. protokol hücre gövdeleri yeniden ve çoklu doku bölümleri kapsayan etiketli nöronların dendritik arborization kalıplarını tamamlamak için prosedürler sıralanıyor. Beyin yapısı içinde her bir nöronun pozisyonları da dahil olmak üzere morfolojik veriler, daha fazla analiz için ayıklanır. Standart programlama fonksiyonları bağımsız küme analizleri ve morfolojik metriklere dayanan küme değerlendirmelerini gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Bir kümeleme analizi perfo bu analizlerin programı, istatistiksel değerlendirme doğrulamak içinmakak maymunu talamus (TRN) talamik retiküler çekirdeğinde yeniden 160 nöronlar üzerinde rmed yapıldı. Orijinal kümeleme analizi ve burada yapılan istatistiksel değerlendirmeler, hem TRN nöronlar üç alt popülasyonlar, benzersiz morfolojik özelliklere sahip her ayrılır olduğunu göstermektedir.

Bir seçici nüfus içinde nöronların büyük ölçekli rekonstrüksiyonlar dLGN 5 modifiye kuduz virüsünün mümkün enjeksiyonu takiben olduğunu göstermiştik. Son zamanlarda, aynı doku TRN görsel sektörde 160 nöronların yeniden kullanılmıştır (Bragg ve arkadaşları, yorumda,. Şekil 2A-B), yukarıda tarif edilen ayrıntılı metodolojik aşağıdaki basamakları. TRN çalışmasında, TRN nöron üç benzersiz kümeleri bağımsız 10 morfolojik metrik küme analizine dayanarak bel...

Bu protokol değiştirilmiş kuduz virüsü floresan işaretlerini ifade ve bağımsız, tarafsız küme farklı nöronal alt sınıfları arasında morfolojik metrik kapsamlı karakterizasyonu olanak analizleri ile retrograd enfeksiyonu takiben etiketli seçici nöronal popülasyonlarının büyük ölçekli rekonstrüksiyon açıklar.

Morfolojik Ölçümler dayanarak büyük ölçekli yeniden düzenlemesi ve Bağımsız, Unbiased Kümelenme Seçici Populasyonlarında Nöronlar Sınıflandıran

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

Bu protokolün amaçları, virüsle etiketlenmiş nöronların morfolojisinin yeniden yapılandırılmasına yönelik adımları tanımlamak ve farklı nöronal alt sınıflar boyunca morfolojik metriklerin kapsamlı karakterizasyonuna olanak sağlamak için etiketli nöron popülasyonları üzerinde bağımsız, tarafsız küme analizleri gerçekleştirmektir. Seçici bir nöronal popülasyon içindeki morfolojik olarak benzersiz nöronal tiplerin daha kapsamlı örneklenmesini ve tarafsız sınıflandırılmasını kolaylaştırmak için nöroanatomik verilerin toplanması ve analiz edilmesi amacıyla yeni bir yaklaşım sunuyoruz. Bu tekniğin temel avantajı, nöronal morfolojinin büyük ölçekli analizine imkan tanıması ve belirgin nöronal alt sınıfları sınıflandırmak için tarafsız yöntemler kullanmasıdır.Morfolojik rekonstrüksiyonların en zorlayıcı yönleri, rekonstrükte edilecek iyi izole edilmiş nöronların seçilmesi, uygun z-derinliğinin atanması ve bitişik doku kesitleri boyunca rekonstrüksiyonları sürdürmek için arborların hizalanmasıdır. Rekonstrüksiyona, EGFP eksprese eden modifiye kuduz virüsü stereotaksik olarak enjekte edilmiş bir primattan alınan, boyanmış 50 mikronluk bir beyin doku kesiti içeren bir lam seçerek başlayın. Lamı mikroskop lam tutucuya yerleştirin ve düşük büyütmeli bir objektif kullanarak ilgilenilen tek bir kesite odaklanın.Kamera kapağını uygun şekilde konumlandırarak kamera görüntüsünün canlı görüntüde görünür olduğundan emin olun. Dendritik arborizasyonun net bir şekilde yeniden yapılandırılabilmesi için, ilgilenilen beyin yapısı içerisinde yeterince izole edilmiş, etiketli bir nöron seçin. 10x büyütmeye geçin ve alanı odaklayın.Hücre gövdesinin alanını ve yuvarlaklığını doğru bir şekilde tahmin edebilmek için, hücre gövdesi tamamen tek bir kesit içinde yer alan nöronları öncelikli olarak seçin. İyi boyanmış ve iyi izole edilmiş bir nöron seçildiğinde, hücre gövdesini içeren ana kesiti kesit yöneticisine eklemek için yazılımdaki yeni kesit butonuna tıklayın. Rekonstrüksiyona dahil edilecek kesit sayısını girin.Başlangıç için iki ila üç kesit eklemeniz önerilir. Kesit kalınlığını 50 mikron olarak ayarlayın. 2x objektifini seçin, ardından üst araç çubuğundaki kontur düğmesine tıklayın ve açılır menüden kontur tipini seçin.Fareyi kullanarak kontur boyunca noktalara tıklayarak hedef yapının konturunu çizin. Konturu çizmeyi bitirdiğinizde, fareyle sağ tıklayın ve konturu kapatmak için menüden konturu kapat'ı seçin. Ardından, görünüm hâlâ iki x iken, sol araç çubuğunda yer alan istenen işaretçi sembolüne tıklayın.Ardından, işaretçiyi yerleştirmek için hedef yapının merkezine tıklayın. Konturlar tamamlandığında, hücre gövdesinin dış hattını çizmek için 40x veya 60x objektifi seçin. Daha sonra üst araç çubuğundaki nöron çizim düğmesini seçin ve açılır menüden çizilecek nöron yapısını (bu durumda hücre gövdesini) seçin.Hücre gövdesini, hücre gövdesinin en geniş alanı boyunca noktalara tıklayarak takip edin ve hücre gövdesini odak noktasına getirmek için gerektiğinde z-derinliğini ayarlayın. Hücre gövdesi konturunu tamamlamak için fareyle sağ tıklayın. Ardından, hücre gövdesi konturunun merkezine, işaretçinin z-derinliğinde yaklaşık olarak merkezde olduğundan emin olarak farklı stilde bir işaretçi yerleştirin.Z-ekseni değerlerinin doğru olması için, her izleme işlemine başlamadan önce hem ana bölümde hem de komşu bölümlerde doğru z-derinliğinin belirlenmesi kritiktir. Dendritik dallanmaları izlemeye başlamak için üstteki açılır menüden dendrite seçeneğini seçin.Ardından, hücre gövdesinden başlayarak her bir dendriti takip edin. Bir dendrit dallandığında, fareyle sağ tıklayın ve bu dallanma noktasına bir düğüm yerleştirmek için bifurkasyon düğümü veya trifurkasyon düğümünü seçin. Dendritin açısını ve yönünü doğru şekilde yakalamak için takip işlemi boyunca z-derinliğini ayarladığınızdan emin olun.Bu bölümdeki dendritin sonunda fareye sağ tıklayın ve açılır menüden "ending" (sonlandırma) seçeneğini belirleyin. Ana bölümdeki tüm dendritik ağaçlar izlendiğinde, bitişik bölüme devam etmesi muhtemel olan dendritik uçları tanımlayın. Ardından, mikroskop görüntüsünde 20x büyütmede uygun z-derinliğinde bu uçları odağa getirin.Mikroskop görüntüsüne kan damarları veya kolayca tanınabilen dendrit yapıları veya demetleri gibi yakınlardaki önemli belirleyici noktaları dahil edin. Ardından, bilgisayar ekranına tutulan bir dijital kamera kullanarak canlı görüntünün fotoğrafını çekin. Daha sonra mikroskop objektifini 2x'e getirin ve slayttaki bitişik kesite geçin.Ardından, yazılım görünümündeki önceden çizilmiş kesitin konturlarını, yeni kesitteki LGN ve TRN sınırlarıyla hizalayın. 20x büyütmeye geri dönün ve belirleyici noktaları kullanarak hizalayın. Daha sonra, önceden çizilmiş kesitten alınan dendrit uçlarının fotoğrafından yararlanarak, önce yeniden yapılandırmayı seçmek için ok aracını kullanın ve dendritleri hizalamak için çizimi taşıyın.Ardından sağ tıklayın, açılır menüden taşıma seçeneğini belirleyin ve izleme kaydını buna göre taşıyın. İzleme kaydını döndürmek için sağ tıklayın, açılır menüden döndürme seçeneğini belirleyin ve izleme kaydını buna göre döndürün. Alternatif olarak, üstteki araçlar açılır menüsünden eşleştirme aracını seçin ve eşleştirilecek nokta sayısını belirleyin.Ardından, dendritik uçları başlangıçlarla eşleştirmek için rekonstrüksiyondaki uç noktaya ve canlı görüntüdeki karşılık gelen devam noktasına tıklayın. Önceki bölümden gelen izleme, yeni bölümdeki dendritlerle hizalandığında, daha önce yapıldığı gibi bölüm yöneticisine yeni bir bölüm ekleyin. Alternatif olarak, daha önce oluşturulmuş olan komşu bölümü seçin ve z-derinliğini aynı şekilde ayarlayın.Güncel bölüme tıklayarak, bölüm yöneticisinde ilgili yeni bölümün seçili olduğundan emin olun. Ardından, büyütmeyi 40x veya 60x'e artırıp oku kullanarak dendriti seçin. Fareyle dendritin önceki bölümden gelen ucuna sağ tıklayın ve açılır menüden sona ekle seçeneğini belirleyin.Bir istem, devamın yeni bir bölümde olup olmadığını soracaktır. Evet'e tıklayın. Ardından, fareyi bir çizim aracı olarak kullanarak dendritin devamını takip edin.Bir sonraki kesit ile hizalama hazırlığı yapmak amacıyla uçların görüntülerini alın. Ardından, nöron için en az üç kesit izlenene kadar veya dendritler artık takip edilemeyene veya bulunamayana kadar dendritik izlemelere devam eklemeleri yapın. Nöron rekonstrüksiyon sistemiyle ilişkili bir ekstraksiyon programı kullanarak, tamamlanmış bir rekonstrüksiyon dosyasını açın.Düzenleme açılır menüsünden tüm nesneleri seç seçeneğini belirleyin. Üst analiz araç çubuğundan dal yapısı analizini seçin, ardından her bir sekmeye tıklayarak her sekmedeki istenen analiz seçeneklerini belirleyin. Analiz penceresindeki Tamam düğmesine tıklayarak istenen tüm verileri çıkarın ve daha sonra analiz yapmak üzere çıktı pencerelerine sağ tıklayıp Excel'e aktar seçeneğini belirleyerek verileri bir hesap tablosu formatında kaydedin.Bu fotoğraf, bir hayvanın dorsal LGN'sinden alınan tek bir koronal kesiti göstermektedir. LGN katmanlarını görselleştirmek için sitokrom oksidaz boyaması kullanılmıştır. GFP boyaması ise virüs enjeksiyon bölgesini işaretlemektedir.Ok, yoğun şekilde retrograd olarak işaretlenmiş talamik retiküler nüklüs nöronlarının bölgelerini göstermektedir. Kesit yönelimi, gösterilen dorsal ventral medial lateral pusulaya göredir. Ölçek çubuğu sol alt köşede gösterilmiştir.Bu görüntü, siyah konturlarla belirtilen virüs enjeksiyonunu içeren tüm kesitler için LGN'nin kırmızı ve TRN'nin bordo renkli kontur hatlarını göstermektedir. Sarı yıldızlar, enjeksiyon bölgelerinin merkezlerini belirtir. Bu görüntü, konturların ve enjeksiyon bölgesinin 3D render görüntüsünü göstermektedir.Bu, bordo ile gösterilen tek bir toplam TRN konturu içindeki küme atamasına göre renk kodlanmış, yeniden oluşturulmuş TRN nöronlarının konumlarının haritasıdır. Ölçek çubuğu 500 mikronu temsil etmektedir. Bu görüntü, TRN'in toplam konturlarını siyahla, LGN'yi ise griyle göstermekte olup beş yeniden oluşturulmuş TRN nöronu, TRN içindeki medial lateral konumlarına göre sıcaktan soğuğa doğru renklendirilmiştir.Ölçek çubuğu 500 mikronu temsil etmektedir. Bu fotoğraflar, 100 mikronu temsil eden renk uyumlu ölçek çubuklarıyla aynı beş TRN nöronunun detaylarını göstermektedir. Bu hiyerarşik dendrogram ağacı, 10 bağımsız morfolojik metriğe dayalı olarak yeniden yapılandırılmış 160 TRN nöronu arasındaki bağlantı mesafelerini betimlemekte ve kümeleme analizinin genel sonuçlarını göstermektedir.TRN nöronlarının üç farklı kümesi mavi, yeşil ve kırmızı ile gösterilmiştir. Bu nöronal rekonstrüksiyon tekniklerinde uzmanlaşıldığında, tek bir nöron bir ila iki saat içinde tamamen rekonstrükt edilebilmektedir. Nöronlar rekonstrükt edilirken z-derinliğinin sürekli izlenmesi ve ayarlanması önemlidir.Burada ana hatları verilen protokol, geleneksel ve daha yanlı nöroanatomik analiz yöntemlerinin geliştirilmiş bir versiyonudur ve araştırmacıların geniş ölçekli morfolojik verilere dayanarak yeni nöron alt sınıflarını keşfetmelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, bitişik doku kesitleri aracılığıyla nöronların nasıl yeniden yapılandırılacağı ve ileri analizler için morfolojik verilerin nasıl çıkarılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

large-scale-reconstructions-independent-unbiased-clustering-based-on

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz nöron morfolojisi analiz etmek için bir bilgisayar programı geliştirdik. Mevcut iki açık kaynak kodlu analiz araçları ile birlikte, program Sholl analiz yapar ve neurites, şube noktaları ve neurite ipuçları sayısını belirler. Analizler neurite morfolojisi yerel değişiklikler görülebilir şekilde yapılmaktadır.

Çoklu Ölçeklerde Sayısallaştırılmış Nöronal Morfoloji Otomatik Sholl Analizi

Burada, sütunlar ve katmanlar halinde Drosophila medulla nöronların dendritik yönlendirmesini nasıl analiz edileceğini göstermektir. iş akışı, izleme referans sütun dizisine dendritik milleri tescili için ve 3 boyutlu uzayda dendritik yapıların analizi için görüntü kalitesi ve hesaplama araçlarını geliştirmek için bir çift görünümü görüntüleme tekniği içerir.

Sütunlar ve Katmanlar dendritik Morfoloji Analizi

Burada biz bir doku takas, floresan etiketleme ve büyük ölçekli görüntüleme sağlayan, böylece, görselleştirme yeni korteksimiz hücre tiplerinin üç boyutlu kuruluşun fare beyin dokusunun açıklayınız.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Burada, sağlıklı ve patolojik hücreleri üzerinde 3 boyutlu onların şekil alarak tanımlamasını sağlayan bir iş akışı sağlar. İncelenen hücre olasılığını tarafsız kümeleme sağlayacak bir Self-Organizing harita eğitmek için 3B yüzeyler üzerinde temel 2D projeksiyon anahatları kullanma işlemi açıklanmaktadır.

Sağlıklı ve patolojik arasında ayrım morfoloji tabanlı kullanarak Fourier dönüşümleri ve kendi kendini düzenleyen haritalar hücreleri

Burada özetlenen protokolünü ayirt analizi, biocytin kurtarma ve hücre içi elektrofizyolojik kayıtlar in vitro nöron izin takip hipokampal CA2 interneurons yüksek kaliteli rekonstrüksiyonlar açıklar karakterizasyonu ve belirlenmesi için sonuçta iyi nöronal anatomisi.

Biocytin kurtarma ve dolgulu hipokampal CA2 Interneurons 3D rekonstrüksiyonu

Açıklanan boru hattı, gigabaytlardan daha büyük elektron mikroskobu veri kümelerinin tüm hücre morfolojilerini ayıklamak için segmentasyonu için tasarlanmıştır. Hücreler 3B olarak yeniden oluşturulduktan sonra, bireysel ihtiyaçlar etrafında tasarlanmış özelleştirilmiş yazılım, görüntüleme tıkanıklığının üstesinden gelmek için sanal gerçekliği kullanarak doğrudan 3D olarak nitel ve nicel bir analiz yapmak için kullanılabilir.

Glial ve Nöronal Hücrelerin 3D Rekonstrüksiyonu ve Sanal Gerçeklik Analizi Için Bir Yöntem

Sunulan, 2D floresan görüntülerden nöronal dendritik dalların yönelimlerinin basit ve doğrudan otomatik olarak ölçülmasını sağlayan bir hesaplama aracıdır.

Dendritik Dalların Otomatik Tanımlanması ve Oryantasyonları

Protokol, bir doku temizleme yöntemi olan ScaleSF kullanılarak beyin diliminde ayrıntılı bir nöronal görüntüleme yöntemi sağlar. Protokol, beyin dokusu hazırlama, doku berraklaştırma, temizlenmiş dilimlerin işlenmesi ve nöronal yapıların mezoskopikten mikroskobik seviyelere kadar konfokal lazer taramalı mikroskopi görüntülemesini içerir.

Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

Bu protokol, iDISCO + kullanarak bozulmamış fare beyinlerinin manyetik rezonans görüntüleme, temizleme ve immünoetiketleme yöntemlerini açıklar, ardından ışık tabakası mikroskobu kullanılarak görüntülemenin ayrıntılı bir açıklaması ve NuMorph kullanılarak aşağı akış analizleri yapılır.

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Nörit büyüme testleri, rejeneratif nöronal süreçler hakkında nicel bir değer sağlar. Bu yarı otomatik yazılımın avantajı, bir maske oluşturarak hücre gövdelerini ve nöritleri ayrı ayrı bölümlere ayırması ve nörit uzunluğu, dal noktası sayısı, hücre-gövde küme alanı ve hücre kümesi sayısı gibi çeşitli parametreleri ölçmesidir.

Nörit büyüme ölçümü için yeni bir yarı otomatik yazılımın standardizasyonu 

Öğrenin modifiye kuduz virüsü ile etiketlenmiş nöronların morfolojisini yeniden yapılandırma ve yanıltıcı olmayan küme analizleri ile farklı nöron alt sınıflarını sınıflandırma yöntemini. Bu teknik büyük ölçekli nöroanatomik çalışmalarda kullanılır.

Morfolojik Ölçümler dayanarak büyük ölçekli yeniden düzenlemesi ve Bağımsız, Unbiased Kümelenme Seçici Populasyonlarında Nöronlar Sınıflandıran (Video) | JoVE Journal

Morfolojik Ölçümler dayanarak büyük ölçekli yeniden düzenlemesi ve Bağımsız, Unbiased Kümelenme Seçici Populasyonlarında Nöronlar Sınıflandıran

Daha fazla video keşfet