Morfolojik Ölçümler dayanarak büyük ölçekli yeniden düzenlemesi ve Bağımsız, Unbiased Kümelenme Seçici Populasyonlarında Nöronlar Sınıflandıran

Bu protokolün amaçları, virüsle etiketlenmiş nöronların morfolojisinin yeniden yapılandırılmasına yönelik adımları tanımlamak ve farklı nöronal alt sınıflar boyunca morfolojik metriklerin kapsamlı karakterizasyonuna olanak sağlamak için etiketli nöron popülasyonları üzerinde bağımsız, tarafsız küme analizleri gerçekleştirmektir. Seçici bir nöronal popülasyon içindeki morfolojik olarak benzersiz nöronal tiplerin daha kapsamlı örneklenmesini ve tarafsız sınıflandırılmasını kolaylaştırmak için nöroanatomik verilerin toplanması ve analiz edilmesi amacıyla yeni bir yaklaşım sunuyoruz. Bu tekniğin temel avantajı, nöronal morfolojinin büyük ölçekli analizine imkan tanıması ve belirgin nöronal alt sınıfları sınıflandırmak için tarafsız yöntemler kullanmasıdır.

Morfolojik rekonstrüksiyonların en zorlayıcı yönleri, rekonstrükte edilecek iyi izole edilmiş nöronların seçilmesi, uygun z-derinliğinin atanması ve bitişik doku kesitleri boyunca rekonstrüksiyonları sürdürmek için arborların hizalanmasıdır. Rekonstrüksiyona, EGFP eksprese eden modifiye kuduz virüsü stereotaksik olarak enjekte edilmiş bir primattan alınan, boyanmış 50 mikronluk bir beyin doku kesiti içeren bir lam seçerek başlayın. Lamı mikroskop lam tutucuya yerleştirin ve düşük büyütmeli bir objektif kullanarak ilgilenilen tek bir kesite odaklanın.

Kamera kapağını uygun şekilde konumlandırarak kamera görüntüsünün canlı görüntüde görünür olduğundan emin olun. Dendritik arborizasyonun net bir şekilde yeniden yapılandırılabilmesi için, ilgilenilen beyin yapısı içerisinde yeterince izole edilmiş, etiketli bir nöron seçin. 10x büyütmeye geçin ve alanı odaklayın.

Hücre gövdesinin alanını ve yuvarlaklığını doğru bir şekilde tahmin edebilmek için, hücre gövdesi tamamen tek bir kesit içinde yer alan nöronları öncelikli olarak seçin. İyi boyanmış ve iyi izole edilmiş bir nöron seçildiğinde, hücre gövdesini içeren ana kesiti kesit yöneticisine eklemek için yazılımdaki yeni kesit butonuna tıklayın. Rekonstrüksiyona dahil edilecek kesit sayısını girin.

Başlangıç için iki ila üç kesit eklemeniz önerilir. Kesit kalınlığını 50 mikron olarak ayarlayın. 2x objektifini seçin, ardından üst araç çubuğundaki kontur düğmesine tıklayın ve açılır menüden kontur tipini seçin.

Fareyi kullanarak kontur boyunca noktalara tıklayarak hedef yapının konturunu çizin. Konturu çizmeyi bitirdiğinizde, fareyle sağ tıklayın ve konturu kapatmak için menüden konturu kapat'ı seçin. Ardından, görünüm hâlâ iki x iken, sol araç çubuğunda yer alan istenen işaretçi sembolüne tıklayın.

Ardından, işaretçiyi yerleştirmek için hedef yapının merkezine tıklayın. Konturlar tamamlandığında, hücre gövdesinin dış hattını çizmek için 40x veya 60x objektifi seçin. Daha sonra üst araç çubuğundaki nöron çizim düğmesini seçin ve açılır menüden çizilecek nöron yapısını (bu durumda hücre gövdesini) seçin.

Hücre gövdesini, hücre gövdesinin en geniş alanı boyunca noktalara tıklayarak takip edin ve hücre gövdesini odak noktasına getirmek için gerektiğinde z-derinliğini ayarlayın. Hücre gövdesi konturunu tamamlamak için fareyle sağ tıklayın. Ardından, hücre gövdesi konturunun merkezine, işaretçinin z-derinliğinde yaklaşık olarak merkezde olduğundan emin olarak farklı stilde bir işaretçi yerleştirin.

Z-ekseni değerlerinin doğru olması için, her izleme işlemine başlamadan önce hem ana bölümde hem de komşu bölümlerde doğru z-derinliğinin belirlenmesi kritiktir. Dendritik dallanmaları izlemeye başlamak için üstteki açılır menüden dendrite seçeneğini seçin.

Ardından, hücre gövdesinden başlayarak her bir dendriti takip edin. Bir dendrit dallandığında, fareyle sağ tıklayın ve bu dallanma noktasına bir düğüm yerleştirmek için bifurkasyon düğümü veya trifurkasyon düğümünü seçin. Dendritin açısını ve yönünü doğru şekilde yakalamak için takip işlemi boyunca z-derinliğini ayarladığınızdan emin olun.

Bu bölümdeki dendritin sonunda fareye sağ tıklayın ve açılır menüden "ending" (sonlandırma) seçeneğini belirleyin. Ana bölümdeki tüm dendritik ağaçlar izlendiğinde, bitişik bölüme devam etmesi muhtemel olan dendritik uçları tanımlayın. Ardından, mikroskop görüntüsünde 20x büyütmede uygun z-derinliğinde bu uçları odağa getirin.

Mikroskop görüntüsüne kan damarları veya kolayca tanınabilen dendrit yapıları veya demetleri gibi yakınlardaki önemli belirleyici noktaları dahil edin. Ardından, bilgisayar ekranına tutulan bir dijital kamera kullanarak canlı görüntünün fotoğrafını çekin. Daha sonra mikroskop objektifini 2x'e getirin ve slayttaki bitişik kesite geçin.

Ardından, yazılım görünümündeki önceden çizilmiş kesitin konturlarını, yeni kesitteki LGN ve TRN sınırlarıyla hizalayın. 20x büyütmeye geri dönün ve belirleyici noktaları kullanarak hizalayın. Daha sonra, önceden çizilmiş kesitten alınan dendrit uçlarının fotoğrafından yararlanarak, önce yeniden yapılandırmayı seçmek için ok aracını kullanın ve dendritleri hizalamak için çizimi taşıyın.

Ardından sağ tıklayın, açılır menüden taşıma seçeneğini belirleyin ve izleme kaydını buna göre taşıyın. İzleme kaydını döndürmek için sağ tıklayın, açılır menüden döndürme seçeneğini belirleyin ve izleme kaydını buna göre döndürün. Alternatif olarak, üstteki araçlar açılır menüsünden eşleştirme aracını seçin ve eşleştirilecek nokta sayısını belirleyin.

Ardından, dendritik uçları başlangıçlarla eşleştirmek için rekonstrüksiyondaki uç noktaya ve canlı görüntüdeki karşılık gelen devam noktasına tıklayın. Önceki bölümden gelen izleme, yeni bölümdeki dendritlerle hizalandığında, daha önce yapıldığı gibi bölüm yöneticisine yeni bir bölüm ekleyin. Alternatif olarak, daha önce oluşturulmuş olan komşu bölümü seçin ve z-derinliğini aynı şekilde ayarlayın.

Güncel bölüme tıklayarak, bölüm yöneticisinde ilgili yeni bölümün seçili olduğundan emin olun. Ardından, büyütmeyi 40x veya 60x'e artırıp oku kullanarak dendriti seçin. Fareyle dendritin önceki bölümden gelen ucuna sağ tıklayın ve açılır menüden sona ekle seçeneğini belirleyin.

Bir istem, devamın yeni bir bölümde olup olmadığını soracaktır. Evet'e tıklayın. Ardından, fareyi bir çizim aracı olarak kullanarak dendritin devamını takip edin.

Bir sonraki kesit ile hizalama hazırlığı yapmak amacıyla uçların görüntülerini alın. Ardından, nöron için en az üç kesit izlenene kadar veya dendritler artık takip edilemeyene veya bulunamayana kadar dendritik izlemelere devam eklemeleri yapın. Nöron rekonstrüksiyon sistemiyle ilişkili bir ekstraksiyon programı kullanarak, tamamlanmış bir rekonstrüksiyon dosyasını açın.

Düzenleme açılır menüsünden tüm nesneleri seç seçeneğini belirleyin. Üst analiz araç çubuğundan dal yapısı analizini seçin, ardından her bir sekmeye tıklayarak her sekmedeki istenen analiz seçeneklerini belirleyin. Analiz penceresindeki Tamam düğmesine tıklayarak istenen tüm verileri çıkarın ve daha sonra analiz yapmak üzere çıktı pencerelerine sağ tıklayıp Excel'e aktar seçeneğini belirleyerek verileri bir hesap tablosu formatında kaydedin.

Bu fotoğraf, bir hayvanın dorsal LGN'sinden alınan tek bir koronal kesiti göstermektedir. LGN katmanlarını görselleştirmek için sitokrom oksidaz boyaması kullanılmıştır. GFP boyaması ise virüs enjeksiyon bölgesini işaretlemektedir.

Ok, yoğun şekilde retrograd olarak işaretlenmiş talamik retiküler nüklüs nöronlarının bölgelerini göstermektedir. Kesit yönelimi, gösterilen dorsal ventral medial lateral pusulaya göredir. Ölçek çubuğu sol alt köşede gösterilmiştir.

Bu görüntü, siyah konturlarla belirtilen virüs enjeksiyonunu içeren tüm kesitler için LGN'nin kırmızı ve TRN'nin bordo renkli kontur hatlarını göstermektedir. Sarı yıldızlar, enjeksiyon bölgelerinin merkezlerini belirtir. Bu görüntü, konturların ve enjeksiyon bölgesinin 3D render görüntüsünü göstermektedir.

Bu, bordo ile gösterilen tek bir toplam TRN konturu içindeki küme atamasına göre renk kodlanmış, yeniden oluşturulmuş TRN nöronlarının konumlarının haritasıdır. Ölçek çubuğu 500 mikronu temsil etmektedir. Bu görüntü, TRN'in toplam konturlarını siyahla, LGN'yi ise griyle göstermekte olup beş yeniden oluşturulmuş TRN nöronu, TRN içindeki medial lateral konumlarına göre sıcaktan soğuğa doğru renklendirilmiştir.

Ölçek çubuğu 500 mikronu temsil etmektedir. Bu fotoğraflar, 100 mikronu temsil eden renk uyumlu ölçek çubuklarıyla aynı beş TRN nöronunun detaylarını göstermektedir. Bu hiyerarşik dendrogram ağacı, 10 bağımsız morfolojik metriğe dayalı olarak yeniden yapılandırılmış 160 TRN nöronu arasındaki bağlantı mesafelerini betimlemekte ve kümeleme analizinin genel sonuçlarını göstermektedir.

TRN nöronlarının üç farklı kümesi mavi, yeşil ve kırmızı ile gösterilmiştir. Bu nöronal rekonstrüksiyon tekniklerinde uzmanlaşıldığında, tek bir nöron bir ila iki saat içinde tamamen rekonstrükt edilebilmektedir. Nöronlar rekonstrükt edilirken z-derinliğinin sürekli izlenmesi ve ayarlanması önemlidir.

Burada ana hatları verilen protokol, geleneksel ve daha yanlı nöroanatomik analiz yöntemlerinin geliştirilmiş bir versiyonudur ve araştırmacıların geniş ölçekli morfolojik verilere dayanarak yeni nöron alt sınıflarını keşfetmelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, bitişik doku kesitleri aracılığıyla nöronların nasıl yeniden yapılandırılacağı ve ileri analizler için morfolojik verilerin nasıl çıkarılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.