Name: Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Öğrenin kortikal nöronların yapısal bağlantısını ve uyarılabilirliğini in utero elektroporasyon ile karakterize etme yöntemini. Bu teknik, gelişimsel nörobiyolojide bilişsel bozuklukların biyolojisini anlamak için değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz onların mükemmel teknik yardım ve düzenleme için LA Weiss R. Gutiérrez ve A. Morales minnettarız. CGB İspanyol Ministerio de Ciencia e INNOVACIÓN (MICINN), FPI-BES-2012-056011 tarafından finanse edilmektedir. Bu çalışma, M. Navarrete BBVA Vakfı ve SAF2014-58598-Jin (MINECO) bir hibe ile ve Ramón Areces Vakfı ve hibe SAF2014-52119-R ve (MINECO itibaren) BFU2014-55738-REDT için bir hibe ile finanse edildi M. Nieto.

<ol><li>Dehorter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+fast-spiking+interneuron+properties+by+an+activity-dependent+transcriptional+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch.</a> Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).</li>
<li>Rodriguez-Tornos, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cux1+Enables+Interhemispheric+Connections+of+Layer+II%2FIII+Neurons+by+Regulating+Kv1-Dependent+Firing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing.</a> Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+postnatal+electroporation+and+time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+mouse+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices.</a> J Vis Exp. (81), (2013).</li>
<li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortex-%2C+Hippocampus-%2C+Thalamus-%2C+Hypothalamus-%2CLateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+Utero+Electroporation+in+the+C57BL%2F6+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Woodworth, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip1+Regulates+the+Balance+between+Specification+of+Distinct+Projection+Neuron+Subtypes+in+Deep+Cortical+Layers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers.</a> Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).</li>
<li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transportable%2C+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Dev Growth Differ. , (2015).</li>
<li>Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+I.+A+quantitative+study+of+Golgi-impregnated+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons.</a> J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).</li>
<li>Miller, M., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+II.+A+combined+Golgi-electron+microscope+study+of+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).</li>
<li>Cubelos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cux-2+controls+the+proliferation+of+neuronal+intermediate+precursors+of+the+cortical+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone.</a> Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).</li>
<li>Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Control+of+a+Neuronal+Protein+Using+a+Genetically+Encoded+Unnatural+Amino+Acid+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intrinsic+properties+and+excitability+of+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+during+a+critical+period+for+sensory+maps+in+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex.</a> J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.

Bu protokol onların bağlantı ve heyecanlanma analiz etmek amacıyla C75BL / 6 farelerinin somatosensoriyel korteks nöronları etiketlemek için nasıl ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Mevcut yöntemlere göre, bu tür nöron başına aksonal şube sayısı, bunların kesin topografya ve anatomik konumu gibi bağlantı ayrımcı yönlerini görüntüler. Elektrotların pozisyonlarını değiştirerek, tür singulat korteks gibi diğer nöron popülasyonları, hedef (elektrotlar ve beyin arasındaki aynı açıyı tutmak, ancak kutupların yönünü değiştirmek...

dendritik ve aksonal yapıların geliştirilmesi serebral korteks olmak üzere, sinir sisteminde devre düzenleme önemli bir yönüdür. Bu farklı nöronal alt popülasyonlar seçici kablolama sırasında kritik bir rol oynamaktadır. son raporlar bir dizi bağlantının yanı sıra, sinir hücrelerinin molekül çeşitliliği ateşleme oldukça spesifik modları satın tarafından yansıtılır, göstermiştir. Ancak, gelişim sırasında farklı nöron alt tipleri heyecanlanma ve bağlantı belirleyen mekanizmaları yanı sıra koordinasyon dereceleri, hala tam, 2 1 anlaşılmaktadır. Vivo kaybı: ve kazanç fonksiyon-ifadesi spesifik genlerin düzeyi ve devrenin gelişimindeki etkisi arasındaki ilişkinin incelenmesi için izin analiz eder. Utero elektroporasyon (İEÜ) yaygın incelemek için kullanılan bir tekniktirspesifik sinir hücresi popülasyonlarını daki bir genin işlevi ve bunların bağlantı biçimin çalışma. Bununla birlikte, canlı farelerde kortikal katmanları aksonların ve dendritlerin morfolojik özelliklerini belirlemek için, seyrek nöronlar etiketlemek için gereklidir. İEÜ ile birleştirilmiş Cre rekombinasyon sistemi tespit kortikal laminaların tek tek hücreler tarafından yayılan projeksiyonları çözmek için yeterince düşük bir yoğunlukta nöronların seyrek popülasyonu işaretlemek için de kullanılabilir. Bu yöntem, elektroporasyona beyinleri (Şekil 1) arasında uygun sayılar analiz sonra niceliksel veri elde etmek için korteks başına nöronların yeterli sayıda etiket. Bu yazıda bağlantı, örneğin ince analizi için bir yöntem sunulur. Bu durum, ayrı deneylerde analiz etmek için benzer bir strateji sunulur, yeşil floresan proteini (GFP) üzerine akım kelepçe kayıtları gerçekleştirerek nöronların elektriksel özellikleri, akut korteks dilimlerinin hücreleri -electroporated. bu proprotokollere‖ kayıpları ve fonksiyon kazancı İEÜ sırasında ek plazmidlerle dahil edildikleri nöronların zamanda çok yönlü ve WT ve transjenik hayvanların nöronların uyarılabilirliğinin ve bağlantı çalışma uygulanabilir ve. Bu protokol, embriyonik gün (E) 15.5 farelerin elektroporasyon açıklar, ancak bu teknik E9.5 3 ve doğum sonrası güne (P) 2 ile 4 arasındaki herhangi bir yaşta uygulanabilir. Erken dönemde elektroporasyon nöronlar ve talamus öncülerini ve korteksin derin katmanlannda daha sonra aşamalı elektroporasyon işaretleri daha yüzeysel tabakalar (örneğin, E15.5 IUE hedefleri tabaka II-III nöronlar) hedef ise. Özetle, tek hücreli morfolojik analiz ve elektrofizyoloji ile İEÜ kombinasyonu sinir sisteminde nöron muazzam yapısal ve işlevsel çeşitlilik altında yatan moleküler mekanizmaları aydınlatmak için yararlı bir araçtır.

<table><tbody><tr><td>pCAG-Cre</td><td>Addgene</td><td>13775</td><td></td></tr><tr><td>pCALNL-GFP</td><td>Addgene</td><td>13770</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>15777</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil</td><td>Carl Roth</td><td>301.1</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plazmid Maxi Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>1615 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (IsoFlo)</td><td>Abbott (Esteve)</td><td>1385 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Imalgene)</td><td>Merial</td><td>2528-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin (Ksilajezik)</td><td>Calier</td><td>0682-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Povidone İyot Meda</td><td></td><td>694109.6</td><td></td></tr><tr><td>Göz Merhemi (Lipolak)</td><td>Angelini</td><td>65.277</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Neşter Sapı # 3 - 12 cm</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Neşter Bıçakları # 10</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Adson Forseps-Tırtıklı - Düz 12 cm</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>Sertleştirilmiş İnce Makas - Düz 11 cm</td><td>İnce Bilim Aletleri</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Makas Mezenbaum-Nelson Kavisli L=14,5 cm</td><td>Teleflex</td><td>PO143281</td><td></td></tr><tr><td>İnce kavisli uçlar - Stil 7 Dumoxel</td><td>Dumont</td><td>0303-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps-Inox</td><td>Güzel Bilim Aletleri</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Mathieu İğne Tutucu - Tırtıklı</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Uygulayıcı</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>ACS&nbsp; </td><td></td>Otomatik</tr><tr><td>Yükleyici 9 mm AutoClips</td><td>MikRon Precision, Inc.</td><td></td><td></td>205016</tr><tr><td>Sütürler - Polysorb 6-0</td><td>Covidien</td><td>UL-101</td><td></td></tr><tr><td>Elektrikli Tıraş Makinesi&nbsp;</td><td>Panasonic</td><td>ER 240</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar (100 mm, 1.0/0.58 Dış/İç çap)</td><td>World Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Kalibre edilmiş mikrokılcal pipetler için aspiratör borusu tertibatları</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Gazlı Bez (Aposan)</td><td>Laboratorios Indas, S.A.U.</td><td>CN 482232.8</td><td></td></tr><tr><td>Pamuklu Çubuklar (Star Cott)</td><td>Albasa-İğne</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>25 g (BD Microlance 3)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>OCT Bileşik</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü Kabı 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>GFP Etiketi Poliklonal Antikor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11122</td><td></td></tr><tr><td>İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 eşlenik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır</td><td>Serumu Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatör ECM 830&nbsp;</td><td>BTX Harvard Aparatı</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Platin elektrotlar 650P 7 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P7</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu&nbsp; Floresan Görüntüleme için - MZ10F</td><td></td> <td>Leica-VIP</td><td></td></tr> <tr><td>3000 İzofloran Buharlaştırıcı</td> Matrx-TCS-SP5 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lazer Tarama Sistemi</td><td>Leica-Axiovert</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>200 Mikroskop</td><td>Zeiss-Kriyostat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- CM 1950</td><td>Leica-P-97</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Micropette Çektirme</td><td>Sutter Enstrüman Şirketi</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Yama kelepçesi analizi yumuşak warw (p-Clamp Clampfit 10.3)</td> <td>Moleküler</td> <td>Cihazlar-Toplama</td><td></td></tr> <tr><td>yazılımı (MultiClamp 700B Amplifikatör)</td> <td>Moleküler Cihazlar</td><td>DD1440A</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu Mikromanipülatör + Döner Taban&nbsp;</td><td>Sutter Enstrümanı</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Hava Tablası</td><td></td> <td>Newport-Minyatür</td><td></td></tr> <tr><td>Peristaltik Pompalar</td><td>WPI</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

rahimde elektroporasyon nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve tek hücreli bağlantı eğitim yaklaşımları

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

sinir sistemi farklı nöron türlerinden büyük bir aralık oluşmaktadır. Bu nöronal alt popülasyonlar diğer özellikleri, onların farklı dendritik morfolojileri, aksonal bağlantı kendi özel desenler ve bunların seçici ateşleme yanıtları arasında, ile karakterize edilir. gelişimi sırasında farklılaşma bu yönleri sorumlu moleküler ve hücresel mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, etiketleme için kombine protokolleri tanımlar ve kortikal nöronların yapısal bağlantı ve eksitabilite karakterize. Utero elektroporasyon (İEÜ) protokolünün Modifikasyon nöronların seyrek nüfus etiketleme sağlar. Bu da, dendritler ve bireysel nöronlar, aksonal projeksiyonlar laminer konumu hassas karakterizasyonu ve morfometrik analizi akson belirlenmesini ve izlenmesini sağlar. İEÜ ayrıca eksitabilite değişiklikleri araştırmak için kullanılabilirvahşi tip (WT) ya da elektroporasyon beyinleri akut kesitlerden bütün hücre kaydı ile birleştirerek genetik olarak modifiye edilmiş nöronlar. Bu iki teknik yapısal ve işlevsel bağlantı kuplajın daha iyi anlaşılmasına ve gelişme sırasında nöronal çeşitliliği kontrol eden moleküler mekanizmaların katkıda bulunur. Bu gelişimsel süreçler aksonal kablolama, nöronların fonksiyonel çeşitlilik ve bilişsel bozuklukların biyolojisi üzerinde önemli etkileri vardır.

detaylı bir şekilde ve gelişimi boyunca nöronların morfolojik değişikliklerini karakterize etmek için, seyrek nöronlar etiketlemek için gereklidir. Bu enzim dahil yalnızca nöronlar GFP (Şekil 1A) ifade için bir Cre rekombinaz seyreltildi sistemi, nöronların seyrek popülasyonunda ilgi konusu bir genin sentezlenmesi için izin verir. Bu strateji kullanılarak, tabaka II-III hedefli ve E15.5 İEÜ tarafından etiketlenmiştir. CAG-DsRed2 / ml 1 ug, CO-elektroporasyona bir kontrol...

Bu yazının tek hücre düzeyinde ve floresan etiketli nöronların eksitabilite nöronların yapısal bağlantı tanımlamak için utero elektroporasyon (İEÜ) kullanmak protokolleri sağlar. Histoloji dendritik ve aksonal projeksiyonlar karakterize etmek için kullanılır. Akut dilim tam hücreli kayıt eksitabilitesini araştırmak için kullanılır.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Bu in utero elektroporasyon yaklaşımının genel amacı, normal ve deneysel koşullar altında kortikal nöronların yapısal bağlantısallığını ve uyarılabilirliğini karakterize etmektir. Bu yöntem, beynin yapısal ve fonksiyonel bağlantısallığının çözümlenmesi ve kognitif bozuklukların biyolojisi gibi gelişimsel nörobiyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, seyrek bir nöron popülasyonunun işaretlenmesine olanak tanıması ve dendritlerin belirginleştirilerek bireysel nöronlara erişim sağlamasıdır; bu da daha verimli ve daha gerçekçi nicel analizlere olanak tanır.Enjeksiyondan önce, tek hücre işaretleme veya standart patch clamp çalışması için cerrahi başına on mikrolitre DNA karışımı hazırlayın. Ardından, telensefalonu konumlandırmak için embriyoları parmaklarınızla nazikçe hareket ettirin. Sonrasında, hazırlanmış bir borosilikat kapiler boru ağız pipetine yerleştirin.Kan damarlarından kaçınarak, iğne ucunu uterus boyunca lateral ventriküle ulaşana kadar ilerletin. Ardından, büyük mavi bir nokta gözlemlenene kadar yaklaşık bir mikrolitre Fast Green boyalı DNA çözeltisini yavaşça enjekte edin. Bu prosedürdeki kritik adım DNA'nın enjekte edilmesidir.Bu işlem mümkün olduğunca nazikçe yapılmalıdır. Şimdi, yedi milimetrelik platin elektrotları bir embriyonun başının yan kısımlarına yerleştirin ve platin elektrotlar aracılığıyla voltaj uygulayın. Bu prosedürde, sabitlenmiş beyinleri, çökecekleri zamana kadar bir ila iki gün boyunca dört derece Celsius'ta, PBS içindeki 10 mL %30 sükrozda kriyoprotekte edin.Ardından bir santimetreküp boyutunda alüminyum folyo küpler hazırlayın ve küpleri 2/3 oranında OCT ile doldurun. Sonrasında beyinleri küplere yerleştirin ve kuru buz üzerinde dondurun. Daha sonra dondurulmuş beyinleri 80 °C'de saklayın.Beyinleri kriyostatla kesmek için, örnek diskinin yüzeyine bir damla OCT damlatın. Histoloji bloğundaki alüminyum folyoyu soyun ve bloğu, sıvı OCT'nin üzerine istenen yönde yerleştirin. Histoloji bloğu sabitlenene kadar kuvvetle bastırın.Ardından, numune diskini kriyostatın numune başlığına yerleştirin ve numuneyi kesim için yönlendirin. Daha sonra 50-100 µm kalınlığında kesitler alın ve yüzen kriyokesitleri ince bir fırça yardımıyla PBS'ye aktarın. Sonrasında, kesitleri oda sıcaklığında, 0,5% Triton X-100 içeren PBS içindeki %5 fetal bovine serum ile bir saat boyunca bloke edin.Ardından, örnekleri bloke edici çözelti ile seyreltilmiş 1:500 oranındaki primer antikor ile dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kesitleri üç kez PBS ile yıkayın. Bloke edici çözelti ile seyreltilmiş 1:500 oranındaki sekonder antikoru ekleyin ve kesitleri oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Ardından kesitleri üç kez PBS ile yıkayın. Sonrasında kesitleri, %0,5 Triton X-100 içeren PBS içindeki dapE ile on dakika boyunca karşı boyayın. Kesitleri PBS ile durulayın ve kapatma medyumu ile lam üzerine sabitleyin.Nöronları yeniden yapılandırmak için, beyin kesitlerinin görüntülerini yüksek büyütme ve yüksek çözünürlükle edinin. Ardından, tüm dendritleri ve aksonal uzantıları kapsayacak şekilde, ilgi alanını taramak için görüntüleme yazılımında Tile Scan seçeneğini belirleyin. Bilgi kaybını önlemek için Z ekseninde yeterli sayıda istif (stack) edinin.Ardından, görüntüyü açın ve menüden segmented line seçeneğini seçin. Nöronun yapısını takip eden bir çizgi çizin. Sonrasında Analyze, Tools ve ardından ROI manager adımlarını izleyerek çizgiyi kaydetmek için Add seçeneğine tıklayın.Bu işlemi analiz edilen nöronun her bir aksonu veya dendriti için tekrarlayın. ROI Manager menüsünde, uzunluğu elde etmek için Measure düğmesine basın. Ölçümleri analiz için bir metin dosyasına veya hesap tablosuna aktarın.GFP elektropore edilmiş bir fareden GFP eksprese eden nöron kaydı gerçekleştirmek için, beyni soğutulmuş bir kültür kabına yerleştirin. Küçük bir makasla serebellumu kesin. Ardından beyni bir spatula ile alın ve kağıt havlu üzerinde kurulayın.Beynin ventral kaudal düzlemini bir Vibratome tutucuya yapıştırın. Tutucuyu, buz gibi soğuk ACSF ile doldurulmuş bir Vibratome üzerine yerleştirin ve Vibratome haznesinde sürekli karbogenasyon olduğundan emin olun. Ardından, 15 dakika içinde 300 mikrometre kalınlığında koronal kesitler alarak akut dilimler elde edin.Ardından, akut kesitleri karbogen ile havalandırılan ACSF içerisinde, 25 °C'de en az 60 dakika boyunca inkübe edin. 60 dakika sonra, bir Pasteur pipeti veya küçük bir fırça kullanarak bir kesiti kayıt haznesine aktarın. Kesiti bir harp ile sabitleyin ve 2 mL/dk hızında ACSF ile perfüze edin.GFP pozitif bir nöronu patchlemek için, mikroskop altında 10x objektif ile ilgilenilen bölgeyi belirleyin. Ardından 60x objektif kullanarak GFP pozitif bir hücre bulun. Sonrasında, kayıt elektrodunu hücre içi solüsyon ile doldurun.Ardından, bir cam pipeti pipet tutucuya yerleştirin. Daha sonra, pipet ucunu banyoya daldırın ve uca odaklanın. Pipet banyoya yerleştirildiğinde, geri basınç kontrol sistemi aracılığıyla pozitif basınç uygulayın.Pipette içindeki geri basıncı korurken, görsel rehberlik altında ilgilenilen hücreye yaklaşın. Hücre yüzeyinde küçük bir çöküntü oluştuğunda basıncı serbest bırakın. Bu noktada, bir giga-ohm'dan daha büyük bir dirence sahip sıkı bir sızdırmazlık (seal) oluşabilir.Aksi takdirde, işlemi kolaylaştırmak için hafif bir negatif basınç uygulayın. Mühür oluşurken, tutma voltaj klembini 60 milivolta getirin. Giga-ohm mühür oluştuktan sonra, hücre membranını yırtmak ve tüm hücre moduna geçmek için bir vakum darbesi uygulayın.Tüm hücre (whole cell) moduna geçildiğinde, voltaj klempten akım klemp moduna geçiş yapın ve kayıt almaya başlayın. Bu görüntüler, embriyonik 15,5. günde utero electroporation ile katman 2/3 nöronlarına vektörlerin iletilmesini göstermektedir ve koronal kesitler postnatal 16. günde hazırlanmıştır. Kontrol olarak CAG DsRed2 vektörü birlikte transfekte edilmiştir.GFP, yalnızca cre'yi de bünyesine katan nöronlarda eksprese edilerek CALNL GFP vektöründeki LoxP bölgelerinin rekombinasyonuna olanak tanır. Burada, seyrek olarak etiketlenmiş başka bir GFP nöronunun dendritik ağaçlarının yüksek büyütmeli konfokal görüntüsü yer almaktadır. Bu, parlak alan ve yeşil floresan koşulları altında gözlemlenen, GFP ile elektropore edilmiş bir piramidal nörondur.İşte katman 2/3'te bulunan, CAG-GFP ile elektropore edilmiş kontrol nöronun tipik, düzenli bir spike yanıtı. Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde in utero elektroporasyonlar için 30 dakikada, patch clamp kaydı için ise yarım günde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, annenin stresini azaltmak ve yavruların hayatta kalma şansını artırmak için cerrahi işlemin mümkün olduğunca hızlı yapılması gerektiğini unutmamak önemlidir.Bu prosedürü takiben, belirli genlerin ekspresyonu ile bunların sürrogat gelişimindeki etkileri arasındaki ilişki gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla ekspresyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, gelişimsel nörobilim alanındaki araştırmacıların farelerde nöronların bağlantılarını ve morfolojisini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, tek hücre düzeyinde nöronların yapısını ve bağlantılarını ve floresanla işaretlenmiş nöronların eksitabilitesini tanımlamak için utero operasyonun nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

in-utero-electroporation-approaches-to-study-excitability-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Somatik kök hücre genişleme kontrolü kendi çalışma ve tedavide kullanımı engelleyen önemli bir faktördür. Burada geçici olarak fare beyin üretilen nöron sayısını artırmak için kullanılabilir geliştirme ve yetişkinlik döneminde nöral kök hücrelerinin genişlemesi, kontrol etmek için bir sistemi tanımlamak.

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Bu makalede ayrıntılı olarak utero serebral korteks ve farelerde E14.5 de hipokampus electroporate bir protokol tanımlamaktadır. Biz de bu bu iki beyin bölgelerinde dendrit ve dikenler incelemek için değerli bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Video, bir tam hücre yama akım kelepçesi kullanarak floresan proteini eksprese eden nöronal hücrelerin uyarılabilirliğini incelemek için bir yöntemi göstermektedir. Akım kelepçesi modunda, nöronal uyarılabilirliği gösteren aksiyon potansiyelleri üretilir.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Kullanarak Floresan Nöronların Uyarılabilirliğinin İncelenmesi

Bu protokol içerir geliştirilmiş bir eksplant yordam...

Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi

Bu prosedür, in utero elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan fare ön beynindeki internöronların nasıl hedefleneceğini gösterir. Bu teknik, korteksin yüzeysel katmanlarına yönelik internöron alt tiplerinde seçici gen ekspresyonu elde etmek için özellikle etkiliydi.

Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Uteros elektroporasyonda çift mekansal ve zamansal olarak ayrılmış hücre popülasyonları hedefleme sağlar. Bu teknik, bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimleri normal koşullarda floresan proteinler ihsallaştırmak için değil, aynı zamanda fonksiyonel deneylerden sonra ilgi genlerini tedirgin etmek için görselleştirmek için yararlıdır.

Geçici ve Mekansal Olarak Ayrılmış Hücre Popülasyonlarını Hedef lemek için Utero Elektroporasyonunda Çift

Öğrenin kortikal nöronların yapısal bağlantısını ve uyarılabilirliğini in utero elektroporasyon ile karakterize etme yöntemini. Bu teknik, gelişimsel nörobiyolojide bilişsel bozuklukların biyolojisini anlamak için değerli bilgiler sunar.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

Daha fazla video keşfet