Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

Bu yazının tek hücre düzeyinde ve floresan etiketli nöronların eksitabilite nöronların yapısal bağlantı tanımlamak için utero elektroporasyon (İEÜ) kullanmak protokolleri sağlar. Histoloji dendritik ve aksonal projeksiyonlar karakterize etmek için kullanılır. Akut dilim tam hücreli kayıt eksitabilitesini araştırmak için kullanılır.

Bu in utero elektroporasyon yaklaşımının genel amacı, normal ve deneysel koşullar altında kortikal nöronların yapısal bağlantısını ve uyarılabilirliğini karakterize etmektir. Bu yöntem, beynin yapısını ve işlevsel bağlantısını ve bilişsel bozuklukların biyolojisini incelemek gibi gelişimsel nörobiyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, seyrek bir nöron popülasyonunun işaretlenmesine izin vermesi ve dendritleri giydirmenize ve tek tek nöronlara erişmenize izin vermesidir, bu da daha verimli, daha fimetik kantitatif analize yol açar.

Enjeksiyondan önce, tek hücre etiketleme veya standart yama kelepçesi çalışması için ameliyat başına on mikrolitre DNA karışımı hazırlayın. Ardından, telensefalonu bulmak için embriyoları parmaklarınızla nazikçe manipüle edin. Ardından, hazırlanmış bir borosilikat kılcal damarı bir ağız pipetine yerleştirin.

İğnenin ucunu, lateral ventriküle ulaşana kadar kan damarlarından kaçınarak uterustan geçirin. Bundan sonra, büyük bir mavi nokta görülene kadar yaklaşık bir mikrolitre Fast Green renkli DNA solüsyonunu yavaşça enjekte edin. Bu prosedürdeki kritik bir adım, DNA'nın enjeksiyonudur.

Bu mümkün olduğunca nazikçe yapılmalıdır. Şimdi, yedi milimetre platin elektrotları bir embriyonun başına yanal olarak yerleştirin ve platin elektrotlar aracılığıyla voltaj uygulayın. Bu prosedürde, sabit beyinleri, batana kadar bir ila iki gün boyunca dört santigrat derecede PBS'de on mililitre% 30 sükroz içinde kriyoprotektif edin.

Daha sonra bir küp küp alüminyum folyo küp hazırlayın ve küpleri 2/3 veya şekilde OCT ile doldurun. Daha sonra beyinleri küplerin içine koyun ve kuru buz üzerinde dondurun. Daha sonra donmuş beyinleri 80 santigrat derecede saklayın.

Kriyostattaki beyinleri bölümlere ayırmak için, numune diskinin yüzeyine bir damla OCT yerleştirin. Alüminyum folyoyu histoloji bloğundan soyun ve bloğu sıvı OCT'nin üzerine istenen yönde yerleştirin. Histolojik blok sabitlenene kadar sıkı bir basınç uygulayın.

Daha sonra numune diskini kriyostatın numune kafasına yerleştirin ve numuneyi kesit almak için yönlendirin. Daha sonra 50-100 mikrometre kalınlığında kesitler dilimleyin ve yüzen kriyoseksiyonları ince bir fırça kullanarak PBS'ye aktarın. Daha sonra,% 0.5 Triton X-100 içeren PBS'de% 5 fetal sığır serumu ile bölümleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin.

Daha sonra, bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş 1:500 primer antikor ile gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, bölümleri PBS'de üç kez yıkayın. Bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş 1:500 ikincil antikor ekleyin ve bölümleri oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Ardından bölümleri PBS'de üç kez yıkayın. Daha sonra, bölümleri on dakika boyunca% 0.5 Triton X-100 içeren PBS'de dapE ile boyayın. Bölümleri PBS ile durulayın ve montaj ortamı ile monte edin.

Nöronları yeniden yapılandırmak için, yüksek büyütme ve yüksek çözünürlüklü beyin bölümlerinin görüntülerini elde edin. Ardından, tüm dendritleri ve aksonal süreçleri kapsayan ilgi alanını kapsayacak şekilde edinme yazılımında Tile Scan'i seçin. Bilgi kaybını önlemek için Z ekseninde yeterli sayıda yığın elde edin.

Bundan sonra, görüntüyü açın ve menüden segmentli çizgi seçeneğini seçin. Nöronun yapısını takip eden bir çizgi çizin. Ardından, Analiz Et, Araçlar, ardından ROI yöneticisi'ne ve ardından satırı kaydetmek için Ekle'ye gidin.

Analiz edilen nöronun her akson veya dendriti için bu işlemi tekrarlayın. ROI Yöneticisi menüsünde, uzunluğu almak için Ölç'e basın. Ölçümleri analiz için bir metin dosyasına veya elektronik tabloya aktarın.

GFP elektroporasyonlu bir fareden GFP eksprese edilen nöronun kaydını yapmak için beyni soğutulmuş bir kültür kabına yerleştirin. Beyincikleri küçük bir makasla kesin. Sonra beyni bir spatula ile alın ve bir kağıt havlu üzerinde kurulayın.

Beynin ventral kaudal düzlemini bir Vibratom tutucusuna yapıştırın. Tutucuyu buz gibi ACSF ile doldurulmuş bir Vibratom üzerine yerleştirin ve Vibratom odasının sürekli karbojenasyona sahip olduğundan emin olun. Bunu takiben 15 dakika içinde 300 mikrometre koronal kesitler keserek akut dilimler elde edin.

Daha sonra, akut dilimleri 25 santigrat derecede ACSF'de en az 60 dakika inkübe ederken karbojen ile köpürtün. 60 dakika sonra, bir Pasteur pipeti veya küçük bir fırça kullanarak bir dilimi kayıt odasına aktarın. Dilimi bir arp ile basılı tutun ve dakikada iki mililitre hızında ACSF ile doldurun.

Bir GFP pozitif nöronu yamalamak için, ilgilenilen alanı mikroskop aracılığıyla 10x'te bulun. Ardından 60x objektifini kullanarak bir GFP pozitif hücre bulun. Ardından, kayıt elektrodunu hücre içi çözelti ile doldurun.

Ardından, pipet tutucusuna bir cam pipet yerleştirin. Daha sonra pipet ucunu banyoya yerleştirin ve uca odaklanın. Pipet banyoya girdikten sonra, geri basınç kontrol sisteminden pozitif basınç uygulayın.

Pipetteki geri basıncı korurken görsel rehberlik altında ilgilendiğiniz hücreye yaklaşın. Hücrenin yüzeyinde küçük bir çukur ortaya çıktığında, basıncı serbest bırakın. Bu noktada, bir giga-ohm'dan daha büyük bir dirence sahip sıkı bir sızdırmazlık oluşturulabilir.

Aksi takdirde, kolaylaştırmak için hafif bir negatif basınç uygulayın. Conta oluşturulurken, tutma voltajı kelepçesini 60 milivolta getirin. Giga-ohm contası oluşturulduktan sonra, hücre zarını yırtmak ve tüm hücre moduna geçmek için bir emme darbesi uygulayın.

Tüm hücre moduna girdikten sonra, voltaj kelepçesinden akım kelepçesi moduna geçin ve kayda başlayın. Bu görüntüler, embriyonik 15.5. günde in utero elektroporasyon ile vektörlerin katman 2/3 nöronlara verildiğini ve koronal kesitlerin doğum sonrası 16. günde hazırlandığını göstermektedir. CAG DsRed2 vektörü bir kontrol olarak birlikte transfekte edildi.

GFP, yalnızca cre içeren nöronlarda eksprese edilir ve CALNL GFP vektöründeki LoxP bölgelerinin rekombinasyonuna izin verir. İşte seyrek olarak etiketlenmiş başka bir GFP nöronunun dendritik direklerinin yüksek büyütmeli konfokal görüntüsü. Bu, parlak alanlar ve yeşil floresan koşulları altında gözlemlenen GFP ile elektroporasyonlu piramidal bir nörondur.

Burada, katman 2/3'te bir CAG-GFP elektroporasyonlu kontrol nöronunun tipik, düzenli bir sivri tepkisi verilmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik utero elektroporasyonlar için 30 dakika içinde ve uygun şekilde yapılırsa yama klemp kaydı için yarım gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, annenin stresini azaltmak ve yavruların hayatta kalma şansını artırmak için ameliyatı mümkün olduğunca hızlı yapmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, belirli genlerin ekspresyonu ile vekilin gelişimindeki etkileri arasındaki ilişki gibi ek soruları yanıtlamak için ekspresyon gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, gelişimsel sinirbilim alanındaki araştırmacıların farelerdeki nöronların bağlantısını ve morfolojisini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, tek hücre düzeyinde nöronların yapısını ve bağlantısını ve floresan etiketli nöronların uyarılabilirliğini tanımlamak için utero operasyonunda nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.