Name: Pluripotent Kök Hücre Miyokard Onarım Kardiyak Hücreleri Türetilmiş (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Keşfedin, insan çok potansiyelili kök hücrelerini kardiyomiyosit, endotel ve düz kas hücrelerine farklılaştırma yöntemini. Yama aracılığıyla sitokin iletimi kullanarak hücre yerleşimini iyileştirme tekniğini öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, ABD Halk Sağlığı Servisi'nin NIH RO1'leri HL67828, HL95077, HL114120 ve UO1 HL100407-proje 4 (JZ'ye), Amerikan Kalp Derneği Bilim İnsanı Geliştirme Hibesi (16SDG30410018) ve Birmingham Klinik ve Translasyonel Bilim Merkezi'ndeki Alabama Üniversitesi'nden (WZ'ye) bir Araştırma Kuponu Ödülü ile desteklenmiştir.

Tüm deney prosedürleri Birmingham Alabama Üniversitesi Hayvan Rehberine uygun olarak yapılmaktadır. 1. hiPSC-CM&#39;ler içine hiPSCs Farklılaşan <ol><li> Kaplayın, gece boyunca 4 ° C&#39;de önceden soğutulmuş büyüme faktörü azaltılmış jelatinimsi bir protein karışımı ile 6 delikli bir plakanın deliklerine. Kullanmadan önce, jelatinimsi protein karışımı aspire. % 5 CO2 ve 10 uM ROCK inhibitörü ile 37 ° C mTeSR1 orta ek hücreleri (oyuk başına 1 x 10 5 hücre) önceden kaplanmış plakalar üzerine hiPSCs tohum, ve kültür. </li><li> Hücreler% 90 izdiham ulaşana kadar her gün orta yenile; Daha sonra,% 5 CO2 ve 37 ° C&#39;de iki gün süre ile ortam (0.5 mg, jelatinimsi Protein 6-çukurlu plaka başına karışımı, oyuk başına 2 ml&#39;lik ortam) ve kültür hücreleri büyüme faktörü azaltılmış jelatinimsi bir protein karışımı ekleyin. <ol><li> orta değiştirmek için, yavaşça vakum yoluyla petri ile gelen orta dışarı emmekdışarı hücrelerin dokunmadan, ve bir transfer pipet kullanarak yeni orta ekleyin. </li></ol></li><li> ile desteklenmiş RPMI1640 ortam maddesi ile ortamının değiştirilmesiyle farklılık başlatın insülin olmadan jelatinimsi protein karışımı, B27 Büyüme faktörü indirgenmiş ve 100 ng / ml Aktivin A; Kültür% 5 CO2 ve 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de hücre. </li><li> , RPMI1640 insülin olmayan B27 ile takviye edilmiş ortam, 10 ng / ml olan kemik morfojenik protein 4 (BMP-4), ve 10 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile orta yerine Kültür% 5 CO2 ve 96 saat boyunca 37 ° C&#39;de hücre. </li><li> B27 ile takviye edilmiş RPMI1640 ortam maddesi ile orta takın ve% 5 CO2 ve 37 ° C &#39;de kültür hücreleri devam etmektedir; her 3 günde bir orta yenileyin. </li><li> farklılaşma başlatarak 3 gün sonra ~ mikroskop altında hücrelerin yakalanma kümeleri gözlemleyin. ~ 7 gün ilk kasılmaları gözlemledikten sonra kümeleri toplayın ve Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi yıkayın. <ol><li> hafifçe çalkalanarak 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 100 U / ml kolajenaz IV ihtiva eden Hanks tamponu içerisinde onları kuluçka plaka kümelenmiş-hücreleri ayırmak; Daha sonra, 5 dakika boyunca etilendiamintetraasetik asit (EDTA),% 0.25 tripsin ekleyin. </li><li> RPMI / B27 ortamında% 10 fetal bovin serumu ile enzim çözeltisi nötralize ve RPMI / B27 ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> hemasitometre hücrelerinin sayısını. Kültür olmayan kardiyomiyosit hücreler kültür kaplarına yüzeyine yapışır sağlayacak% 5 CO2 ve en az 3 saat 37 ° C&#39;de en az 10 cm yemekleri hücreleri. </li></ol></li><li> HiPSC-CMS içeren hücre süspansiyonu, toplamak ve jelatinli protein karışımı -kaplı yüzeye kültürleme yoluyla (10 cm çanak başına 6 ila 10 x 1 civarında hücreleri) hücreleri korumak. </li></ol> 2. hiPSC-EC içine hiPSCs Farklılaşan <ol><li> th inkübe edilerek tek hücre içine hiPSC popülasyonu ayrıştırmaları% 5 CO2 ve 5 dakika için 37 ° C &#39;de maddesi kenetleme em. Taze mTeSR1 ortamı içeren 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarın. </li><li> 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. 10 uM ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş ortam içinde mTeSR1 tekrar süspansiyon hücreleri. Bir hemasitometre ile hücre yoğunluğu belirlemek. </li><li> 24 oyuklu plakanın bir oyuğuna 20 NIH birim / ml trombin çözeltisi 250 ul ekle. </li><li> 12.5 mg / ml fibrinojen çözeltisi 250 ul 1 x 10 6 hiPSCs ekleyin. Ve trombin yüklü de hücre-ihtiva eden fibrinojen çözeltisi 250 ul ilave edin. Karışım dakika içinde bir hiPSC içeren fibrin iskele oluşturacak şekilde katılaşmaya gözlemleyin. </li><li> cam kapak forseps ile bir 6-yuvalı plaka oyuklarına katılaştırılmış hücre içeren iskele aktarın ve insülin olmadan% 2 B27 ile takviye 2 mi EBM2 ortamında iskeleleri kültürlenmesiyle farklılaşma başlatılması, aktivin-A (50 ng / mi) çözündürüldü, ve BMP-4, 24 saat için (25 ng / ml),% 5 CO de <sUB&gt; 2 37 ° C. <ol><li> nazikçe hücreleri dokunmadan vakum yoluyla eski orta emerek orta değiştirin. İnsülin olmadan B27 ile takviye edilmiş yeni EBM2 orta, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF, 50 ng / ml), eritropoietin (EPO, 100 ng / ml), ve transforme edici büyüme faktörü ß1 (TGFβ1, 10 ng / ml) ve kültür ekleme % 5 iskeleleri CO2 ve 48 saat boyunca 37 ° C. </li><li> Orta ve kültür% 5 CO2 ve başka bir 48 saat süre ile 37 ° C &#39;de iskeleleri yenile; Daha sonra, orta 200 U kollajenaz IV (100 U / ml) eklenerek iskele hücreleri bırakın. </li><li> Sonra yayımlanmış hücreleri aşağı doğru döndürün. B27, VEGF-A (50 ng / ml) ve SB-431542 (10 uM)% 2 ile takviye edilmiş 2 mi EGM2-OG ortamı orta yerine; iki günde orta yenileyin. </li><li> 100 U / ml kolajenaz IV hücreleri ayırmak yaklaşık 10 gün sonra (~ farklılaşma başlatıldıktan sonra 14. günde, yani, h) izoleAkış sitometrisi ile farklılaşmış hücre popülasyonundan iPSC-EC AT özel markör proteinlerin ekspresyonu için analiz (örneğin, CD31, CD144) 3. </li><li> Kurulmuş bir protokole 3 yoluyla izole hiPSC-ECS genişletin. </li></ol></li></ol> 3. hiPSC-SMC&#39;ler içine hiPSCs Farklılaşan <ol><li> Jelatinimsi protein karışımı ile kaplanmış plakalar üzerine hiPSCs tohum, kültür mTeSR1 ortamı içinde hücreler,% 5 CO2 ve 37 ° C&#39;de, gün ortam değişiklikleri ile, birbirine karışana kadar (yaklaşık 2 gün). </li><li> 3 gün RPMI1640 ortam maddesi ve% 2 B27 artı insülin CHIR99021 (5 uM) ve BMP-4 (10 ng / ml) ile hücreleri kültürleyerek mezodermal soyundan hücreler içine farklılaşmasını başlatın. </li><li> Ağırlıklı sentetik fenotip hiPSC-SMC&#39;ler üretmek için: <ol><li> Kültür, VEGF-A (25 ng / ml), RPMI1640 me fibroblast büyüme faktörü p (FGFβ, 5 ng / ml) ile hücrelerin<html> dium ve% 2 B27 eksi insülin,% 5 CO2 ve 4 gün boyunca 37 ° C. </li><li> Kültür, VEGF-A, hücreler (25 ng / ml), FGFβ% 5 CO2 ve 37 ° C&#39;de RPMI-1640 ortamı içinde (5 ng / ml) ve% 2 B27 artı insülin 2 gün ° C. </li><li> Kültür trombosit türevli büyüme faktörü p (PDGFβ, 10 ng / ml), TGFβ% 5 CO2 ve 37 ° RPMI1640 (3 ng / ml) ve% 2 B27 artı insülin hücreler 4 gün boyunca ° C. </li></ol></li><li> Ağırlıklı kasılma fenotip hiPSC-SMC&#39;ler üretmek için: <ol><li> Kültür 4 RPMI1640 VEGF-A ile günde (25 ng / ml) ve FGFβ (5 ng / ml) ve% 2 B27 eksi insülin hücreleri. </li><li> Kültür RPMI1640 ve% 2 B27 artı insülin PDGFβ (5 ng / ml) ve TGFβ (2.5 ng / ml) ile 7 gün hücreler. </li></ol></li><li> ~ 6 gün RPMI1640 metabolik ortam içeren laktat (4 mM) içinde kültürlenmesi ile son hiPSC-SMC popülasyonları arındırın. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. IGF-içeren Mikroküreler oluşturma <ol><li> Isı Zeytin yağı bir su banyosu içinde 45 ° C arasındadır. </li><li> Isı 50 ° C&#39;ye% 10 jelatin çözeltisi 5 mi. </li><li> zeytin yağı, karışmaya jelatin ekleyin ve bir su banyosu buz ilave edilerek 5 ° C&#39;ye kadar hızlı bir şekilde soğutulur. </li><li> Yirmi beş dakika sonra, mikro küre oluşumunu uyarmak için, zeytin yağı soğutulmuş (4 ° C) aseton ilave edin. </li><li> 5 de sıcaklığını muhafaza 1 saat boyunca ° C; daha sonra, zeytin yağı çıkarmak için önceden soğutulmuş asetonla onları 5 kez yıkayın, mikro küreler toplamak ve 4 ° C&#39;de kurumaya izin verin. </li><li> çapraz bağlama uyarılması için gece boyunca 4 ° C &#39;de% 70 etanol ve% 0.25 glutaraldehid çözeltisi içinde küreler tekrar süspansiyon ve daha sonra 100 mM glisin Karışımı nötralize. </li><li> Saat 30 dakika boyunca 5 ug IGF ve% 0.1 sığır serum albümini ihtiva eden 2 O damıtılmış 15 ul 5 mg mikro-küreler karıştırılarak mikrosferler olarak yüklenebilir IGF. </li></ol> 5. Hücre Yaralanma Sitesi üzerinde yama oluşturma ve enjekte <ol><li> 1 ml Minimum Essential Medium (MEM) birlikte hiPSC kaynaklı SMC&#39;lere (1 milyon dolar) CMS (2 milyon), ve ECS (1 milyon dolar) Askıya. </li><li> 1 mi fibrinojen çözeltisi (25 mg / ml) içinde mikro-5 mg süspanse edin. </li><li> Hücre-içeren çözelti, fibrinojen / mikro küre çözeltisi ile bir şırınga ve trombin çözeltisinin 1 ml&#39;si ile üçüncü bir şırınga ile bir şırınga doldurun (80 NIH birim / mi, 2 ul 400 mM CaCl2, 200 mM ε-aminokaproik ile desteklenmiş asit). </li><li> Cerrahi 2 daha önce açıklandığı gibi inen koroner arter sol ön ligasyonu yoluyla domuz kalbinde miyokard enfarktüsü neden olur. NOT: Kısa, dişi Yorkshire domuz olarak (~ 13 kg, yaş 45 gün) Telazol / Xylazine (4.4 mg / kg) kas içi enjeksiyon ile sedasyon edilir ve izofluran (% 0.5-5) ile genel anestezi altında entübe. Bir 4. IntercOstal torakotomi ve maruz kaldığı inen koroner arter anterior bırakılır. koroner arter 60 dakika boyunca bağlanması ile tıkanır ve daha sonra bağ kaldırılır. Hemen elektriksel defibrilasyon ventriküler fibrilasyon durumunda gerçekleştirilir. </li><li> domuz kalplerin infarkt bölgenin epikarda bir steril plastik halka (~ 2.5 cm) yerleştirin ve sonra aynı anda ringe kürecik / fibrinojen ve trombin çözümleri enjekte edin. </li><li> Karışım (~ 30 sn) kuvvetlendirmek için izin ve sonra hücrelerin infarkt miyokard içine katılaşmış karışımın içinden hücre içeren şırınga iğne takın ve enjekte. 3-0 ya da 2-0 monocryl sütür hayvan boyutuna bağlı olarak kas katmanları, deri altı dokusu ve göğüs duvarı kapatın. Buprenorfin 0.01-0.02 mg / kg kas içi enjeksiyon her 8 saatte bir ameliyat sonrası ilk 3 gün ağrıyı kontrol etmek için kullanılır. </li><li> kardiyak manyetik rezonans kardiyak fonksiyonu değerlendirmekcerrahi işlem, bir hafta ve cerrahi işlem 2, 3, 4 sonraki dört hafta önce görüntüleme (MRG). Son MRG çalışmalarından sonra, hayvan kurban ve histoloji ve moleküler analiz 2, 3, 4 için kalpleri işlemek. </li></ol>

<ol><li>Qiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+and+proliferation+time+course+of+stem+cells+transplanted+in+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium.</a> Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+a+spatiotemporal+3D+environment+on+endothelial+cell+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Induced-Pluripotent+Stem+Cells+into+Smooth-Muscle+Cells%3A+Two+Novel+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols.</a> PLoS One. 11 (1), e0147155(2016).</li>
<li>Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+characteristics+of+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Neth+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.</a> Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).</li>
<li>Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+bodies%3A+a+novel+culture+method+for+enrichment+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).</li>
<li>Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+enrichment+of+cardiomyocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells.</a> Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).</li>
<li>Huber, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+selection+of+cardiomyocytes+during+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation.</a> FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).</li>
<li>Kita-Matsuo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+and+protocols+for+creation+of+stable+hESC+lines+for+fluorescent+tracking+and+drug+resistance+selection+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes.</a> PLoS One. 4 (4), e5046(2009).</li>
<li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+and+endothelial+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).</li>
<li>Woll, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+promotes+hematoendothelial+cell+development+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (1), 122-131 (2008).</li>
<li>Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+expression+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-+and+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).</li>
<li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+derived+from+human+iPSCS+increase+capillary+density+and+improve+perfusion+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).</li>
<li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li>
<li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+approaches+to+improve+cell+survival+in+myoblast+transfer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).</li>
<li>Tang, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+administration+of+cardiac+progenitor+cells+alleviates+left+ventricular+dysfunction+in+rats+with+a+30-day-old+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction.</a> Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).</li>
<li>Zeng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+and+functional+consequences+of+bone+marrow-derived+multipotent+progenitor+cell+transplantation+in+hearts+with+postinfarction+left+ventricular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling.</a> Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).</li>
<li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+myocardial+insulin-like+growth+factor+1+%28IGF-1%29+delivery+with+biotinylated+peptide+nanofibers+improves+cell+therapy+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+insulin-like+growth+factor-1+in+mice+protects+from+myocyte+death+after+infarction%2C+attenuating+ventricular+dilation%2C+wall+stress%2C+and+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy.</a> J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).</li>
<li>Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cardiomyocyte+apoptotic+signaling+by+insulin-like+growth+factor+I%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I.</a> Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).</li>
<li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).</li>
</ol>

hiPSC-CM&#39;ler gelişmiş Verim / Saflık CM&#39;ler içine insan kök hücreleri farklılaştırarak için geleneksel protokoller genellikle düşük verim ve saflık ile sınırlıdır; Örneğin, hESC CM&#39;ler sadece 35-66% yavaş miyozin ağır zincir ya da cTnT 6 dile Percoll ayrılması ve kardiyak vücut oluşumu yoluyla elde edilmiştir. Ayırt hiPSC-CM popülasyonlarının saflığı esasen promotere işlevsel olarak bağlanmış olan bir raportör geninin sentezlenmesi için seçilerek arttırılabil...

onlar hastanın bağışıklık sistemi tarafından reddedilmesi olmayan hücrelerin bir potansiyel olarak sınırsız aralığı ve miktar içine ayırt edilebilir, çünkü insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) rejeneratif hücre tedavisi için en umut verici ajanlar arasında yer almaktadır. (SMC&#39;lere Bununla birlikte, kendi kendine replikasyon ve farklılaşması için kendi kapasitesi, tümör oluşumuna neden olabilir ve bunun sonucunda, hiPSCs tamamen bu kardiyomiyositlerde (CMS), endotel hücreleri (EC), ve düz kas hücreleri gibi özel hücre tipleri, ayırt edilmesi gereken ), uygulamadan önce. Hücre yönetiminin en basit ve en yaygın yöntemlerden biri direkt intramiyokardiyal enjeksiyon, ancak yerli miyokard dokusu ile aşılanan nakledilen hücrelerin sayısı son derece azdır. Bu yıpratma çok iskemik doku sitotoksik ortamına bağlanabilir; Ancak, fare embriyonik kök hücreler (EKH) iken yaralanmamış kalplerin, myokarddan içine doğrudan enjekte ouygulanan hücrelerin önemli bir bölümünün onlar esnasında üretilen yüksek basınçlar tarafından iğne izi aracılığıyla sıkılmış, belki de yönetim sitesine çıkıldı düşündürmektedir 3-5 saat 1 için tutuldu teslim 5 milyon hücre nly ~ 40% miyokard kasılma. Burada, hiPSC türetilmiş kardiyomiyositlerde (hiPSC CMS) 2, endotel hücrelerinin (hiPSC-EC) 3 ve düz kas hücreleri (SMC&#39;lere) 4 oluşturmak için yeni ve büyük ölçüde daha etkili yöntemler sunar. Özellikle, bu hiPSC-SMC protokol ağırlıklı sentetik veya kontraktil SMC fenotip doğru hücreleri yönlendirerek somatik DKH&#39;lerde 5 gözlenen morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinin geniş taklit etmek ilk. Ayrıca, bir sitokin içeren fibrin s oluşturarak enjekte edilen hücrelerin melezleşmesi hızını artırır, hücre dağıtım için bir yöntem sağlarEnjeksiyon sitesi üzerinden atch. Yama, en az üç günlük bir süre boyunca insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) serbest bırakarak, miyokard çıkan hücreler önlemek için iğne parça, ve hücre yaşamını mühürlenerek, her iki hücre tutmanın geliştirilmesi görünmektedir.

<table><tbody><tr><td>Protokol Bölüm 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 ortamı</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Büyüme faktörü azaltılmış matrigel</td><td>Corning lifescience</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi, serum içermez</td><td>Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Aktivin A Ar-Ge</td><td> D</td><td>338-AC-010</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>Ar-Ge D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Ar-Ge D</td><td>232-FA-025</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz IV</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0217889</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (Dekstroz, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 susuz)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14175079</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Fisher Scientific</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Corning Lifescience</td><td>356721</td><td></td></tr><tr><td>10 cm çanak</td><td>Corning Lifescience</td><td>354732</td><td></td></tr><tr><td>Hücre inkübatörü</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Bölüm 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinojen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5g</td><td></td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7009-1KU</td><td></td></tr><tr><td>EMB2 orta</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>ProSpec-Tany</td><td>CYT-241</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>PHC9431</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&#946;</td><td>Peprotech</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>EGM2-MV orta</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Selleckchem</td><td>S1067</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB555445</td><td></td></tr><tr><td>CD144</td><td>BD Bioscience</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>15 ml santrifüj tüpü</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565269</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorff Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Protokol Bölüm 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Kök hücre teknolojileri</td><td>720542</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-&#946;</td><td>Prospec</td><td>CYT-501-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Protokol Bölüm 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeytinyağı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1514</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>IGF</td><td>R& D</td><td>291-G1-01M</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Fisher Scientific</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma plakası</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88850200</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10Q</td><td></td></tr><tr><td>Protokol Bölüm 5</td>CaCl<<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sub>2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>&#949;-aminokaproik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0420000</td><td></td></tr><tr><td>MEM ortamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482748</td><td></td></tr><tr><td>Anestezi ventilatörü</td><td>Datex-Ohmeda</td><td>47810</td><td></td></tr><tr><td>Anestezi ventilatörü</td><td>Ohio Medical</td><td>V5A</td><td></td></tr><tr><td>Defibrilatör</td><td>Fizyol Kontrolü</td><td>LIFEPAK 15</td><td></td></tr><tr><td>1.5 T MRG</td><td>General Electric</td><td>Signa Horizon LX</td><td></td></tr><tr><td>7 T MRG</td><td>Siemens</td><td>10018532</td><td></td></tr><tr><td>Gadolinyum Kontrast Maddesi (Magnevist)</td><td>Berlex</td><td>50419-188-02</td><td></td></tr><tr><td>2-0 ipek sütür</td><td>Ethilon</td><td>685H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 ipek sütür</td><td>Ethilon</td><td>622H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 monofilament sütür</td><td>Ethilon</td><td>627H</td><td></td></tr></tbody></table>

pluripotent kök hücre miyokard onarım kardiyak hücreleri türetilmiş

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (hiPSCs) tamamen kardiyomiyositlerde (hiPSC-CMS), endotel hücreleri (hiPSC-EC), ve düz kas hücreleri (SMC&#39;lere) içine hiPSCs ayrıştırılması için uygulamadan önce, özel hücre tipleri, fakat geleneksel protokolleri ayırt edilmelidir genellikle düşük verim, saflık ve / veya zayıf fenotipik stabilitesi ile sınırlıdır. Burada, yeni hiPSC CMS, -ECs üretilmesi için protokoller ve -SMCs esas itibarıyla geleneksel yöntemlere göre daha verimli, hem de uygulama alanı üzerine oluşturulan bir sitokin içerikli bir flaster ile hücre enjeksiyonu birleştirmek için bir yöntem sunulmaktadır. Yama uzun bir süre boyunca insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) serbest bırakarak, miyokard sıkılmış olan hücreler önlemek için iğne parça, ve hücre yaşamını mühürlenerek, enjekte edilen hücrelerin tutma hem de arttırır. miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarının domuz modelinde olarak bütünleşme oranı daha yüksek, iki kat daha fazla olduğunuHücreler hücreleri ve yama hem sitokin içeren yama olmadan hücrelere kıyasla yama ve tedavi ile uygulanmıştır, fakat tek başına hücreleri ile, kalp fonksiyonu ve infarkt önemli iyileşmeler ile ilişkilidir.

Farklılaştırılmış hiPSC-CM&#39;ler, -ECs ve -SMCs karakterizasyonu HiPSCs ayırıcı kapasitesi, 4, 2 3 değerlendirildi. Sitometri son hiPSC-CM nüfusun saflık% 90 (Şekil 1A, 1B, panel B1) aşabilir düşündürmektedir kardiyak troponin T (cTnT) ifade analizleri Akış. Hemen hemen bütün hücre yavaş miyozin ağır z...

Biz kardiyomiyositlerde, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri ve yama-aracılı sitokin teslimat hücre enjeksiyon birleştirerek nakledilen hücrelerin bütünleşmesini geliştiren bir dağıtım yöntemi, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt etmek için, üç yeni ve daha etkin protokollere sunuyoruz.

Pluripotent Kök Hücre Miyokard Onarım Kardiyak Hücreleri Türetilmiş

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Bu videonun genel amacı, insan plüripoten kök hücrelerinin kardiyomyositlere farklılaştırılmasına yönelik bir tekniği tanıtmak ve bu hücrelerin iskemi reperfüzyon yaralanması sonrası miyokardiyal onarımı incelemek için kullanımını göstermektir. Bu yöntem, miyokardiyal onarım için insan iPS hücrelerinden türetilen kardiyak hücrelerle kalp dokusu mühendisliğine dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedürün temel avantajı, bilim insanlarının saflaştırılmış kardiyomyositler, düz kas hücreleri ve endotel hücreleri toplamasını ve bu progenitör hücrelerle kalp dokusu üretmesini sağlamasıdır.Ling Gao, UAB'de Doktor Zhang'ın kendi laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıdır ve Greg Walcott, UAB hastanesinde bir kardiyologdur. Trina, UAB hastanesinde bir MRI uzmanıdır. Pluripotent kök hücreleri kardiyomiyositlere dönüştürmek için, öncelikle altı kuyucuklu bir plakadaki kuyucukları 4 degrees Celsius'e soğutulmuş büyüme faktörü azaltılmış jelatinöz protein karışımı ile kaplayın.Ardından, plakayı 4 °C'de gece boyunca soğutun. Ertesi gün, jelatinimsi protein karışımını aspire edin ve plakaların her kuyucuğuna 100 milyon kök hücre ekleyin. Kök hücreleri inkübatör dışında

pluripotent-stem-cell-derived-cardiac-cells-for-myocardial-repair

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Hizalanmış miyokard doku nesil klinik açıdan yararlı amaçlar için kök hücre biyolojisi ile ilgili güncel gelişmeleri adapte için önemli bir gerekliliktir. Bu yazıda hücre şekli ve fonksiyonu hassas kontrolü için mikrokontak baskı yaklaşımı açıklar. Kardiyak progenitörler türetilmiş embriyonik kök hücre son derece saf popülasyonlarının kullanarak, biz sonra anizotropik fonksiyonel miyokard doku oluşturur.

Mikrokontak baskı sayesinde Bağlantısızlar Fonksiyonel Miyokard Doku Üretimi

Hipertansiyon ya da miyokart enfarktüsü gibi kalp-damar hastalıkları, kemirgen modellerinde intramiyokardiyal hücre dağıtım yaygın rejeneratif çalışmalarda farklı hücre tiplerinin terapötik potansiyelini test etmek için kullanılır. Bu nedenle, ayrıntılı bir açıklama ve bu cerrahi işlemin açık bir görselleştirme küçük kemirgenler kardiyovasküler hücre tedavi analizlerin sınırlarını ve avantajlarını tanımlamak için yardımcı olacaktır.

Intramiyokardiyal Hücre Teslimat: Mürin Hearts Gözlemler

Bu protokolde, hem fare hem de insan embriyonik kök hücrelerinden kardiyak progenitör hücrelerin türetilmesi gösterilecektir. Bu protokoldeki ana strateji, embriyonik kök hücre hatlarına tasarlanmış floresan raportörler kullanarak kardiyak progenitör hücreleri akış sitometrisi ile zenginleştirmektir.

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Burada, fonksiyonel, sözleşme, cardiomyocyte benzeri hücreler üretmek için kardiyak farklılaşma potansiyeli insan Mezenkimal kök hücrelerin genç kaynaklarının verimli koşum için bir yöntem mevcut tüp bebek.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Burada birincil embriyonik fibroblastlar içine fonksiyonel cardiomyocytes overexpression GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 ve miR-133, TGF-β sinyal inhibisyon yanında (GHMT2m) aracılığıyla yeniden programlamak için sağlam bir yöntem mevcut. Bizim iletişim kuralı dayak cardiomyocytes 7 gün sonrası iletim % 60 ile olduğu kadar erken oluşturur verimlilik.

Pro-fibrotik sinyal bastırma faktörü-aracılı fare embriyonik fibroblastlar indüklenen Cardiomyocytes yeniden programlama Potentiates

Bu iletişim kuralı bir endotel farklılaşma tekniği kalp progenitör hücreler için açıklar. Bu özellikle serum konsantrasyonu ve hücre tohum yoğunluğu endotel farklılaşma potansiyeli etkilemesi üzerinde duruluyor.

İndüksiyon düşük Serum koşullar altında kalp Progenitor hücreler endotel farklılaşma

Burada, bir analiz DNA bütünlük içinde kök hücre hücre transplantasyonu önce değerlendirme için deneysel bir kurulumuna ilişkin ayrıntılı bir açıklama sağlamak.

Kardiyak hücre tedavisi için kök hücre DNA bütünlük değerlendirilmesi

Bu protokol, kalp hastalıkları için hücre implantasyon tedavisinin araştırılmasına olanak sağlamak için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden elde edilen kardiyovasküler hücreleri içeren mesh şeklinde tasarlanmış kardiyak dokular üreder.

In Vivo Miyokardiyal Onarım için İnsan iPS Hücrelerinden Elde Edilen Örgü Şekilli Mühendislik Kardiyak Dokuların Hazırlanması

Burada, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini sağlam bir şekilde üretmek ve genişletmek için bir protokol sunuyoruz.

Hasta Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden İnsan Kardiyomiyositlerinin Üretimi ve Genişlemesi

Farelerde miyokard enfarktüsü bölgesi etrafında ultrason rehberliğinde hücre dağıtımı, hücre nakli için güvenli, etkili ve uygun bir yoldur.

Miyokard Enfarktüslü Farelerde Ultrason Rehberliğinde İndüklenen Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit İmplantasyonu

Keşfedin, insan çok potansiyelili kök hücrelerini kardiyomiyosit, endotel ve düz kas hücrelerine farklılaştırma yöntemini. Yama aracılığıyla sitokin iletimi kullanarak hücre yerleşimini iyileştirme tekniğini öğrenin.

Pluripotent Kök Hücre Miyokard Onarım Kardiyak Hücreleri Türetilmiş

Daha fazla video keşfet