Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Bu prosedürün genel amacı, tek hücrelerde megabaz ölçeğinde DNA kopya sayısı değişikliklerini tanımlamaktır. Hücre popülasyonlarında genomik heterojenliği kategorize etmek için, tek hücre çözünürlüğünde genomik değişiklikleri tanımlamak gerekir. Geleneksel olarak, bu sitolojik yaklaşımlar kullanılarak elde edildi, ancak bu yöntemler duyarlılıkları ve özgüllükleri açısından sınırlıydı.

Tek hücreli dizileme, önceki yaklaşımlara göre gelişmiş duyarlılık ve özgüllük ile çeşitli genomik değişiklikleri tespit edebilir, ancak yalnızca dikkatli bir şekilde yürütüldüğünde. Burada, tek hücrelerdeki megabaz ölçeğinde kopya sayısı değişikliklerini güvenilir bir şekilde tespit etmek için tek hücre dizilemesinin nasıl kullanılacağını açıklıyoruz. Mikro aspiratörü monte etmek için, şeffaf plastik ucu aspiratör borusu tertibatından çıkararak başlayın ve dar ucu, 3/16 inç iç çapa sahip bir fit uzunluğunda PVC borunun bir ucuna yerleştirin.

0.2 mikrometrelik bir şırınga filtresinin çıkışını, 3/16 inç iç çapa sahip bir ayak uzunluğundaki PVC borunun diğer ucuna yerleştirin. Ardından, 0.2 mikrometre şırınga filtresinin girişini, 5/16 inç iç çapa sahip altı inç uzunluğunda bir PVC borunun bir ucuna yerleştirin. Bir mililitre derecesinde beş mililitrelik bir plastik serolojik pipeti kırın ve kırık ucu 5/16 inç iç çapa sahip PVC borunun açık ucuna yerleştirin.

Ardından, beş mililitrelik plastik serolojik pipetin çıkışını bir aspiratör tüpü tertibatının esnek ucuna yerleştirin, ardından saklama için tüp tertibatının kırmızı ağızlığını kapatmak için steril bir plastik tüp kullanın. Tüpün ortasını bir alevin yakınına yerleştirerek ve tüpün her iki ucuna gerilim uygulayarak 10-30 mikrometre iç çapa kadar bir cam kılcal tüp çizin. İki potansiyel aspiratör iğnesi oluşturmak için çekilen boruyu ikiye bölün.

Tek hücreleri toplamak için uygun bir iç çapa sahip yeterli iğnenin hazırlandığından emin olmak için bu adımı birkaç tüple tekrarlayın. İnsan fibroblast hücre hatları gibi yapışma hücrelerini hazırlamak, hücreleri tripsinizasyon ile toplamak ve hücreleri uygun ortamı içeren konik bir tüpe aktarmak. Başlığın yüzeyine, pipet ucu kutularına ve pipet uçlarına püskürtmek için %10 çamaşır suyu kullanarak tüm genom amplifikasyonu için bir başlık oluşturun.

Ardından, %70 etanol ile yıkamayı tekrarlamadan önce hepsini silmek için bir kağıt havlu kullanın. Tüm Genom Amplifikasyonu veya WGA kitinden sekiz mikrolitre suyu tek tek kuyucuklara 96 oyuklu bir PCR plakasına ekleyin. Daha sonra 96 oyuklu PCR plakasını 96 oyuklu bir doku kültürü plakasından bir kapakla kapatın ve plakayı buzun üzerine yerleştirin.

Daha sonra, 15 santimetrelik bir Petri kabında 10 mililitre ortama veya PBS'ye 1.000 hücre ekleyin ve hücrelerin yemeğe yapışmasını önlemek için kabı buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, hala buz üzerindeyken, Petri kabındaki hücreleri ve 96 oyuklu PCR plakasını 10X objektifli bir ışık mikroskobuna aktarın. İğnenin çekilmiş ucunu sert bir yüzeye hafifçe vurarak aspiratör iğnesinin açıklığını artırın, böylece uç kırılır.

Ardından iğnenin geniş ucunu mikro aspiratörün şeffaf ucuna yerleştirin. Ardından, hücreleri içeren Petri kabını mikroskop aşamasına yerleştirin. Aspiratörün kırmızı ağızlığını ağza yerleştirin.

Daha sonra, birini kullanırken aspiratör iğnesini hareket ettirmek, diğer elini ise Petri kabını hareket ettirmek için dizilenecek tek hücreleri tanımlamak gerekiyordu. Ağız emişini kullanarak, yaklaşık bir ila iki mikrolitre ortam veya PBS ile birlikte aspiratör iğnesine tek bir hücre çizin. Hücreyi, 96 oyuklu PCR plakasının tek bir kuyusundaki sekiz mikrolitre suya aktarın.

Tek hücre dizileme verilerinin kalitesi ve faydası, her hücrenin durumuna ve genomuna bağlıdır, bu nedenle, canlı ve apoptotik olmayan hücreleri izole etmek için hücre hazırlığı ve mikro aspirasyon sırasında dikkatli olun. Her hücreyi aspire ettikten ve PCR plakasının bir kuyusuna aktardıktan sonra, bir hücre alan kuyuyu işaretleyin. İstenen hücre sayısı için bunu tekrarlayın.

Bu arada, Tüm Genom Amplifikasyon kitinden 10X Tek Hücre Lizis Parçalanma Tamponunu çözün. Tüm genom amplifikasyonu sırasında kontaminasyonu önlemek için, tüm reaktifleri bir doku kültürü başlığının içine ekleyin. Filtreli pipet uçları kullanın ve kuyucuklar arasında pipet ucunu değiştirin.

32 hücreye kadar olan her set için, 32 mikrolitre 10X Tek Hücre Lizis ve Parçalanma Tamponu ve iki mikrolitre Proteinaz K çözeltisini bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin, ardından içeriği karıştırmak için tüpü girdaplayın. Her kuyucuğa bir mikrolitre çözelti ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Plakayı örtün ve tüm kuyucukları kapatmak için plastik film kullanın.

Daha sonra plakayı mini bir plaka döndürücüde kısa bir süre santrifüjleyin. Ardından, aşağıdaki programı kullanarak plakayı termodöngüleyiciden geçirin. Sonra plakayı buz üzerinde soğutun ve kısaca santrifüjleyin.

Tüm Genom Amplifikasyon kitinden çalışan bir kütüphane hazırlama tampon çözeltisi hazırlamak için, her hücre için iki mikrolitre 1X Tek Hücreli Kütüphane Hazırlama Tamponu ve bir mikrolitre Kütüphane Stabilizasyon Solüsyonunu birleştirin. Tüm genom amplifikasyonu sırasında yanlılığı en aza indirmek ve yüksek kaliteli dizileme kütüphanelerinin hazırlanmasını sağlamak için yeterli hücre lizisi ve tam genom fragmantasyonu kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, bu adımları tam olarak yazıldığı şekilde gerçekleştirmeye özen gösterin.

Plastik filmi tabaktan çıkarın ve her bir kuyucuğa üç mikrolitre çözelti ekleyin. Karıştırmak için kuyu içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından plastik filmi değiştirin. Plakayı kısa bir süre döndürdükten sonra, hücreleri 95 santigrat derecede iki dakika inkübe edin, ardından plakayı buz üzerinde soğutun ve plakayı tekrar kısaca santrifüjleyin.

Şimdi, plastik filmi çıkarın, her oyuğa bir mikrolitre Kütüphane Hazırlama Enzimi ekleyin ve karıştırmak için kuyu içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından plastik filmi değiştirin. Plakayı kısa bir süre döndürdükten sonra, termocycler'a yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın. Plakayı soğuttuktan ve kısa bir dönüş yaptıktan sonra, her hücre için 48.5 mikrolitre su, 7.5 mikrolitre 10X amplifikasyon ana karışımı ve 5 mikrolitre WGA DNA polimerazı birleştirerek Tüm Genom Amplifikasyon kitinden çalışan bir amplifikasyon karışımı hazırlayın.

Çalışma karışımını buz üzerinde tutun. Plastik filmi plakadan çıkarın. Her bir oyuğa 61 mikrolitre çalışma amplifikasyon karışımı ekleyin ve karıştırmak için her bir oyuğun içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından plastik filmi değiştirin.

Plakayı ve termocycle'ı aşağıdaki gibi kısaca santrifüjleyin. Örnekleri sıralayın ve metin protokolüne göre veri analizi yapın. Bu şekilde gösterildiği gibi, tüm genom amplifikasyonu başarılı olursa, numune bir agaroz jeli üzerinde bir leke olarak görünecektir.

Soluk veya eksik bir smear, başarısız bir amplifikasyon reaksiyonunu gösterir ve numune sıralanmamalıdır. Burada gösterildiği gibi, parça boyutlarının analizi, bir parça analizörü üzerinde kapiler elektroforez kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Başarılı bir şekilde hazırlanmış kütüphaneler, 150 ila 900 baz çifti arasında parça boyutlarının oldukça eşit bir dağılımına sahip olacaktır.

Başarısız kitaplık hazırlığı, çarpık bir parça boyutu dağılımına neden olur ve bu tür kitaplıklar sıralanmamalıdır. Gizli Markov modeli ve dairesel ikili segmentasyon kullanılarak, her hücrenin genomu tahmini kopya sayısının segmentlerine ayrıştırıldı. Bu tablo, tek bir hücreden örtüşen sonuçları gösterir ve kromozom 10'da 67 ila 130 megabazdan bir kazanç ve kromozom 19'da 0'dan 20 megabaza kadar bir kazanç ortaya koymaktadır.

Tek hücrelerin izolasyonu ve tüm genom amplifikasyonu tek bir günde yapılabilir ve yapılmalıdır. Dizileme kütüphanelerinin hazırlanması, tüm genom dizilimi ve veri analizi daha sonra esnek bir programla gerçekleştirilebilir. Hücre izolasyonu ve tüm genom amplifikasyonu düzgün bir şekilde gerçekleştirildiğinde ve veri analizi tarif edildiği gibi titizlikle gerçekleştirildiğinde, beş megabazı aşan kopya sayısı değişiklikleri yüksek hassasiyet ve özgüllük ile tespit edilebilir.

Protokolümüz, kopya sayısı değişikliklerinin tespiti için tek hücre dizilemesinin kullanımını özel olarak tanımlasa da, bu protokolün tek hücre izolasyonu ve kütüphane hazırlığı gibi yönleri, diğer genomik değişiklikleri tespit etmek için uygulanabilir.