Name: Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Öğrenin tek hücre sıralama yöntemiyle megabaz ölçeğinde DNA kopya sayısı değişmelerini tespit etmeyi. Bu protokol, genomik heterojeniteyi anlamak için geleneksel sitolojik yöntemlere göre artırılmış duyarlılık ve özgüllük sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz bu yazının yorumları için Stuart Levine teşekkür ederiz. Bu çalışma Sağlık Hibe GM056800 National Institutes ve Angelika Amon için Kathy ve Curt Mermer Kanser Araştırma Fonu tarafından ve Koch Enstitüsü Destek Hibe P30-CA14051 tarafından kısmen desteklenmiştir. Angelika Amon da Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve Biyomedikal Araştırma Glenn Vakfı&#39;nın bir araştırmacı. KAK NIGMS Eğitim Hibe T32GM007753 tarafından desteklenmektedir.

1. Tek Hücreleri İzolasyon <ol><li> microaspirator hazırlayın <ol><li> aspiratör tüp montajı net plastik ucunu çıkarın ve 3/16 &quot;iç çaplı bir 1 metrelik PVC boru bir ucunu dar ucunu. </li><li> 3/6 &quot;iç çapı 1 metrelik PVC boru diğer ucunu bir 0.2 mikron şırınga filtresi çıkışını takın. </li><li> 5/16 &quot;iç çapa sahip bir 6 inç uzunluğunda PVC boru donanımının bir ucuna 0.2 mikron bir şırınga filtreden girişini yerleştirin. </li><li> İsteğe bağlı: yarısında 5/16 &quot;iç çapı 6 inç uzunluğunda PVC boru kesin ve iki yarısı arasında bir in-line su tuzağı yerleştirin. </li><li> 1 ml mezuniyet 5 ml plastik serolojik pipet kırmak ve 5/16 &quot;iç çapı ile PVC boru açık ucunu kırık ucunu. </li><li> Bir aspiratör borusu düzeneğinin esnek ucunda (şeffaf plastik uç içine 5 ml plastik serolojik pipet çıkışını takın) Çıkarmıştı. </li><li> depolama için, steril bir plastik tüp ile aspiratör boru montaj kırmızı ağızlık kapsamaktadır. </li><li> Bir Bunsen beki alev yakınında tüp orta getiren ve tüpün iki ucundaki gerilim uygulayarak 10-30 mikron iç çapı bir cam kılcal tüp dışarı çizin. iki potansiyel aspiratör iğneler oluşturmak için ortada çizilen tüp kırın. sadece bazı tüpler tek hücre toplamak için uygun bir iç çapı ile sona erecek birkaç tüpleri ile bu adımı yineleyin. </li><li> depolama için, bir 15 cm&#39;lik Petri kabındaki modelleme kil iki şeritler yerleştirin ve şeritler arasında aspiratör iğne sabitleyin. </li></ol></li><li> hücreleri seç <ol><li> Hücre tipine ve deney için uygun tek bir hücre süspansiyonu hazırlanır. Örneğin, bu gibi uygun bir ortam ihtiva eden bir konik tüp tripsinizasyon ve transfer hücreler tarafından insan fibroblast hücre hatları hasat hücreler olarak yapışmış olan hücrelerin hazırlanması için. </li><li> Önce, sırasında ya dafter tek bir hücre süspansiyonu (o tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak için ne kadar sürer bağlı olarak), kurulum tüm genom amplifikasyonu için kaput hazırlanıyor. <ol><li> % 10 çamaşır suyu ile kaput, pipet kutuları ve pipet uçları yüzeyini aşağı Sprey ve bir kağıt havlu ile silin. % 70 etanol ile bu adımı yineleyin. </li><li> 96 oyuklu bir PCR plaka, tek tek oyuklara tüm genom amplifikasyonu (WGA) kit su 8 uL ekleyin, her bir hücre için bir de sekanslanacak olan. Buz üzerinde 96 oyuklu bir doku kültür plakasının ve bir yerden bir kapakla 96 gözlü PCR plakası kapatılır. </li></ol></li><li> 15 cm&#39;lik bir Petri kabı içinde 10 ml ortamı veya fosfat tamponlu tuz (PBS) 1000 hücreleri ekleyin ve kabına yapışan hücreler önlemek için buz üzerinde çanak yerleştirin. </li><li> 10X objektif bir ışık mikroskobu buz kapak ile Petri kabındaki hücrelere ve 96 PCR plaka getirin. </li><li> yavaşça th çizilmiş ucunu hafifçe vurarak aspiratör iğne açılmasını artırmaksert bir yüzeye e aspiratör iğne ucu kırılır şekilde. microaspirator açık ucunu aspiratör iğne geniş ucunu takın. </li><li> mikroskop sahnede hücreleri içeren Petri kabı yerleştirin. Ağızda aspiratör kırmızı ağızlık yerleştirin. hücreleri içeren Petri kabı taşımak için aspiratör iğne ve diğer yandan taşımak için tek bir elinizi kullanın. Tek hücreleri tanımlamak sekanslanacak olan. </li><li> ağız emme kullanarak, ortam veya PBS ~ 1-2 mcL ile birlikte aspiratör iğne içine tek bir hücreyi çizin. 96 gözlü PCR plaka tek bir kuyu içine su 8 uL hücreyi aktarın. hücreyi aktarırken kabarcıkları tanıtan kaçının. </li><li> Hücrelerin istediğiniz sayı izole edilene kadar adımı tekrarlayın 1.2.7. buz üzerinde PCR plaka tutun ve toplama hücreleri arasındaki kapak ile örtülü. Hücreleri almış kuyu işaretleyin. <ol><li> tek hücre toplama ederken, bütün g 10X tek hücre parçalama ve parçalanma tampon çözülmeenome amplifikasyon kiti. hücrelerin istenilen sayıda toplama sonra, tüm genom amplifikasyonu hemen geçin. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Tüm Genom Büyütme <ol><li> , Tüm genom amplifikasyonu sırasında kirlenmesini önlemek bir doku kültürü kaput içinde tüm reaktifler ekleyin filtreleri ile pipet uçları kullanın ve kuyularda arasında pipet değiştirmek için. </li><li> tüm genom amplifikasyonu (WGA) kiti bir çalışma parçalama ve parçalanma tampon çözeltisi hazırlayın. En fazla 32 hücrelerinin her biri için, bir mikrosantrifüj tüpü içinde, proteinaz K çözeltisi 10x tek hücre lisis ve parçalanma tamponu, 2 uL 32 uL birleştirir. çözümler karıştırmak için tüp Vortex. </li><li> her oyuğa lizis ve parçalanma tampon çözeltisi çalışma 1 mcL ekleyin ve yukarı pipet ve aşağı karıştırın. </li><li> plaka Kapak ve bir plastik filmle tüm kuyuları mühür. Kısaca mini plaka spinner tabak santrifüj. </li><li> foll olarak Termal döngüakımları: 50 ° C, 1 saat ve 99 ° C, 4 dakika. </li><li> buz üzerinde plaka soğutun ve kısaca mini plaka spinner tabak santrifüj. </li><li> tüm genom amplifikasyon kiti çalışan bir kütüphane hazırlık tampon çözeltisi hazırlayın. her bir hücre için, 1 x tek hücre kütüphanesi hazırlanması tamponu, 2 ul ve mikrosantrifüj tüpü içinde bir kütüphane sabitleme çözeltisi 1 uL birleştirir. Aynı mikrosantrifüj tüpü içinde birçok hücreler için çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> plastik filmi çıkarın ve her bir kütüphane hazırlanması tampon çözeltisi çalışma 3 uL ekleyin. karıştırmak için iyi yukarı ve aşağı içeriğini pipetle. plastik film değiştirin. Not: Wells filmde delikler başlayana dek plastik film tüm genom amplifikasyonu süreci boyunca yeniden kullanılabilir. Bu durumda, yeni bir plastik film geçin. </li><li> Kısaca, bir mini plaka spinner plaka santrifüj 2 dakika boyunca 95 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> buz ve kısaca plaka soğutunmini plaka spinner plaka santrifüj. </li><li> Plastik filmi çıkarın her kuyuya 1 ul kütüphane hazırlık enzim ekleyin ve yukarı iyi içeriğini pipet ve aşağı karıştırın. buz üzerinde veya bu adımı boyunca soğuk bir blokta kütüphane hazırlık enzim tutun. plastik film değiştirin. </li><li> 16 ° C, 20 dakika, 24 ° C, 20 dakika, 37 ° C, 20 dakika, 75 ° C, 5 dakika, 4 ° C &#39;de sabit: Kısaca aşağıdaki mini plakası döndürücü ve termal döngüsü içinde plaka santrifüj. </li><li> buz üzerinde plaka soğutun ve kısaca mini plaka spinner tabak santrifüj. </li><li> tüm genom amplifikasyon kiti bir çalışma amplifikasyon karışımı hazırlayın. Her hücre için, 48.5 ul su, 7.5 ul 10x büyütme ana karışımı ve bir mikrosantrifüj tüp içinde 5 uL WGA DNA polimeraz birleştirir. Aynı mikrosantrifüj tüp içinde birkaç hücreler için çalışma karışımı hazırlayın. buz üzerinde çalışan karışımı tutun. </li><li> Plastik filmi çıkarın amplifikasyon karışımı çalışan 61 mcLde yukarı ve aşağı her sıra ve pipet içeriğine karıştırın. buz üzerinde veya bu adımı boyunca soğuk bir blokta çalışan amplifikasyon karışımı tutun. plastik film değiştirin. </li><li> 95 ° C, 3 dakika, 94 ° C&#39;de 25 döngü, 30 saniye 65 ° C, 5 dak, 4 ° C &#39;de sabit: Kısaca şu şekilde mini plaka spinner plaka ve termal döngüsü santrifüj. </li><li> 3. adımda kullanılmak üzere, 20 ° C - ayrı bir mikrosantrifüj tüpü ve saklamak için, her numune devri 60 uL. </li><li> Her numune (örnek 15 uL, yani 3 uL 6x DNA yükleme boyası) geri kalan hacim DNA yükleme boyası ekleyin ve bir% 1 agaroz jeli üzerinde Her reaksiyondan 5 uL çalıştırın. NOT: başarıyla 250 ila 1,000 bp bir smear olarak görünür güçlendirilmiş hücreler. bir karalama göstermek veya sadece bir soluk smear görünmüyor numuneler yararlı sıralama verilerini elde etmek olası değildir. </li></ol> 3. Sıralama <ol><li> paramanyetik boncuklar ile örnekleri arındırın. <ol><li> ThaBuz üzerinde ağırlık DNA örnekleri. Çözelti homojen olması ve en az 30 dakika oda sıcaklığında inkübe boncuk Vortex para-manyetik boncuk kadar. </li><li> Temiz bir mikrosantrifüj tüpü içine, her bir DNA numunesi 20 uL aktarın. Numunenin geri kalan kısmı, -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Her DNA örneği ve karıştırmak için vorteks paramanyetik boncuk 30 mcL (1.5x) ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Aşama 3.4 kullanılmak için oda sıcaklığında boncuk stok solüsyonu bırakın. </li><li> 2 dakika süreyle manyetik tüp şerit üzerinde tüpler yerleştirin veya boncuk bir pelet oluşturur ve kadar süpernatant açıktır. </li><li> P200 pipet kullanarak, boncuk bozmadan mümkün olduğunca süpernatant kadar kaldırın. </li><li> DNA boncuk karışımı% 80 etanol içinde 180 uL ekleyin. boruları etanol çözeltisi ile boncuk &quot;durulama&quot; mıknatıs göre birkaç kez çevirin. </li><li> P200 pipet kullanarak, çekmenin, aslında etanol yıkama kadar kaldırınboncuk bozmadan ble. </li><li> 3.1.6 ve 3.1.7 tekrarlayın. </li><li> Hava yaklaşık olarak 10 dakika ya da daha fazla etanol görünene kadar boncuk kurutun. boncuklar kırık görünür bir sonraki adıma geçin ya da tüpün duvarı düşmek. </li><li> manyetik şerit örnekleri çıkarın. boncuklardan DNA elüte boncuk tekrar süspansiyon örnekleri girdaba 10 mM Tris pH 8.0, 40 uL ekleyin. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Kısaca tüpün altındaki sıvı toplama ve en az iki dakika için bir manyetik şerit üzerinde boru tüpleri örnekleri santrifüj. boncuk bozmadan temiz mikrosantrifüj tüpler içine eluent aktarın. </li></ol></li><li> örnek normalleştirme <ol><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, her bir numune konsantrasyonunu belirlemek. konsantrasyonları 10 ile 30 ng / ml aralığında olmalıdır. </li><li> 10 mM Tris pH 8.0 kullanılarak 0.2 ng / ml, her örnek seyreltilir. Aşağıdaki adımlar asgari i gerektirirBu seyreltme 5 uL Temel giriş. </li></ol></li><li> Kütüphane hazırlanması <ol><li> Kütüphane hazırlık seti 13 yönergeleri izleyerek sıralama kütüphaneleri hazırlayın. </li></ol></li><li> nihai temizleme <ol><li> Adım 3.1 göre örnekleri temizleyin. 50 bp, 75 bp, ya da 150 bp okuma uzunlukları sırasıyla 1.5x, 1x veya 0.6x hacmini örnek boncuk oranını kullanın. 10 mM Tris pH 8.0 15 ul ile elüte. </li><li> Kütüphanede 14 boyutu dağılımını kontrol etmek için bir parçası analizörü örnekleri çalıştırın. boyut dağılımı eşit 150 900 bp yayılmalıdır. </li></ol></li><li> qPCR kullanarak örnekleri sayısal olarak <ol><li> Kütüphane Niceleme Kiti kullanılarak, kit talimatlarına 15&#39;e göre bir qPCR reaksiyon ayarlayın. Pozitif standartları (kit DNA standartları) ve negatif standartları (su veya başka boş çözelti) eklemek için bir sütun boş bırakın. </li><li> fol olarak Termal döngüdüşükler: 95 ° C, 5 dakika (4.8 ° C / saniyenin altındaki bir rampa) ile 95 ° C, 30 saniye (4.8 ° C / saniyenin altındaki bir rampa) ve 2.5, 60 ° C, 45 saniye (rampa 35 döngü ° C / sn). </li></ol></li><li> havuzu <ol><li> akış hücresi üzerinde birçok şerit ihtiyaç vardır nasıl belirleyin ve hat başına bir grup ile, gruplar halinde örnekleri bölün. </li><li> Numunelerin her bir grup için, aşama 3.5.2 arasında qPCR verilere dayanarak düşük konsantrasyon ile örnek seçmek ve 10 mM Tris pH 8.0 kullanılarak bu konsantrasyona kadar bu gruptaki tüm örnekleri normalleştirmek. </li><li> birlikte, her grup örnekleri havuz. </li></ol></li><li> Ardışık <ol><li> Standart prosedürler 16 aşağıdaki nesil dizileme makinede yük havuzları. </li></ol></li></ol> 4. Veri Analizi NOT: Unix tabanlı ortamda bu bölümde programları ve komut dosyalarını çalıştırmak için gereklidir. onların in aşağıdaki protokolde belirtilen yazılımı yükleyin<html> enstalasyonda kılavuzları. Tüm komut https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/ bulunabilir. <ol><li> FASTX-Toolkit sürüm 0.0.13 17&#39;den fastx_trimmer kullanarak 40-nt okur Trim. fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq </li><li> Varsayılan seçenekleri 18 ile BWA sürüm 0.6.1 kullanarak uygun referans genomu (fare için MM9, insana hg19) okur hizalayın. bwa aln mm9.fa example.trim.fastq&gt; example.sai bwa Samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq&gt; example.sam </li><li> Daha sonra sıralamak ve endeks elde edilen BAM dosya SAMTools sürümü 0.1.19 19 kullanılarak, chrM ve rastgele kromozomlarına hizalamalarını çıkarın. grep -v -w chrM example.sam | grep -v rasgele&gt; example.filtered.sam | Samtools -uSh example.filtered.sam görmek samtools sıralama - example.filtered samtools endeksi example.filtered.bam </li><li> CNVs tespit HMMcopy başlat= &quot;Xref&quot;&gt; 20 <ol><li> genomu için GC yüzdesi referans dosyası oluşturmak için HMMcopy içinde gcCounter kullanın. pencere boyutunu belirlemek için &quot;500000 -w&quot; seçeneğini kullanın. Adım 4.2 kullanılan Fasta referans dosyası aynı sürümünü kullanın, ancak emin chrM yapmak ve rastgele kromozomlar Fasta dosyadan kaldırılır. gcCounter -w 500000 mm9.fa&gt; mm9_gc.wig </li><li> mappability için kıpırdatmak dosyası oluşturmak için HMMcopy içinde generateMap.pl kullanın. uzunluğu okumak belirtmek için &quot;40 -w&quot; seçeneğini kullanın. Adım 4.4.1 kullanılan aynı Fasta referans dosyasını kullanın. generateMap.pl -b mm9.fa generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig </li><li> genomu için bir mappability referans dosyası oluşturmak için HMMcopy içinde mapCounter kullanın. pencere boyutunu belirlemek için &quot;500000 -w&quot; seçeneğini kullanın. mapCounter -w 500000 mm9.bigwig&gt; mm9_map.wig </li><li> Her BAM dosyası için bir kıpırdatmak dosyası oluşturmak için HMMcopy içinde readCounter kullanın. readCounter 500000 example.filtered.bam&gt; input.wig -w </li&gt; <li> R komut dosyalarında referans dosyalarına yollarını değiştirmek (run_hmmcopy.mm9.r veya run_hmmcopy.hg19.r), 4.4.1 (örneğin, mm9_gc.wig) ve 4.4.3 (örneğin, mm9_map yukarıda oluşturulan dosyaları kullanabilirsiniz. sırasıyla, GC yüzdesi referans dosyası ve mappability referans dosyasına bakın değişkenler gfile ve MFILE için peruk). Sonra sağlanan R komut &quot;run_hmmcopy.mm9.r&quot; ya da &quot;run_hmmcopy.hg19.r&quot; çalıştırın. R CMD TOPLU run_hmmcopy.mm9.r veya R CMD TOPLU run_hmmcopy.hg19.r </li><li> BAM dosyaları bir dizi toplu işlem için, (VS) segmentleri arama ve değişkenlik puanları hesaplamak için paketinde sağlanan komut &quot;HMMpipe.pl&quot; tek bir klasörde BAM dosyaları koymak ve çalıştırın. biçimi uygulayın: Perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles mm9 </li></ol></li><li> CNVs 21 tespit etmek için DNAcopy çalıştırın. <ol><li> benzersiz her BAM dosyasından okur eşlenen ayıklamak için SAMtools sürüm 0.1.19 kullanın. samtools görüntülemek -h -F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i &quot;^ @ | XT A: U&quot; | samtools -Shu görünümü -&gt; example.mapped.bam </li><li> BAM PCR çiftleri 22 dosya işaretlemek için Picard sürüm 1.94 yılında MarkDuplicates kullanın. MarkDuplicates.jar GİRİŞİ jar java = example.mapped.bam ÇIKIŞ = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true </li><li> Sürüm 2.17.0 eşlenen sayısı için bedtools olarak coveragebed kullanımı sağlanmıştır YATAK dosyası &quot;mm9.500k.dynamic.win.bed&quot; ya da &quot;hg19.500k.dynamic.win.bed&quot; 23 önceden tanımlanmış dinamik 500kb eşlenebilir pencerelerinin her okur . coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | sıralama -k1,1 -k2,2n&gt; example.nondup.counts </li><li> sağlanan GC içeriği referans dosyası &quot;mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt&quot; ya da &quot;hg19.500k.dynamic.win.fa dayalı okuma sayar normalleştirmek için sağlanan Perl betiği&quot; normalizeGC.pl &quot;kullanın. gc.txt &quot;. perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts&gt; example.bam.norm.counts </li><li> segmentleri aramak için sağlanan R komut &quot;dnacopy.r&quot; kullanın. R CMD TOPLU dnacopy.r </li></ol></li><li> CNVs tespit <ol><li> 4.4.6 hesaplanan VS 0.26 aştığı için hücreleri hariç. </li><li> Hangi medyan günlük 2 oranı fazla 0.4 (farazi kazanç) ya da daha az -0.35 (varsayılan kayıp) sadece bu içerecek şekilde 4.4.6 HMMcopy tarafından çağrılan segmentleri Filtre. </li><li> segmenti ortalama 0.6 daha fazla 1.32 veya daha az sadece bu hangi eklemek 4.5.5 yılında DNAcopy tarafından çağrılan segmentleri Filtre. </li><li> Sadece HMMcopy ve DNAcopy hem farazi kazanç veya varsayılan kaybı tespit bölgelerde CNVs çağırarak, 4.6.2 ve 4.6.3 segmentleri örtüşüyor. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kahlem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+Level+Alterations+Reflect+Gene+Dosage+Effects+Across+Multiple+Tissues+in+a+Mouse+Model+of+Down+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Transcript Level Alterations Reflect Gene Dosage Effects Across Multiple Tissues in a Mouse Model of Down Syndrome.</a> Genome Res. 14 (7), 1258-1267 (2004).</li>
<li>Torres, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Aneuploidy+on+Cellular+Physiology+and+Cell+Division+in+Haploid+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast.</a> Science. 317 (5840), 916-924 (2007).</li>
<li>Itsara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+Analysis+of+Large+Copy+Number+Variants+and+Hotspots+of+Human+Genetic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Human+Gen%22%5BJournal%5D)">Population Analysis of Large Copy Number Variants and Hotspots of Human Genetic Disease.</a> Am. J. Human Gen. 84 (2), 148-161 (2009).</li>
<li>Sudmant, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+diversity%2C+population+stratification%2C+and+selection+of+human+copy-number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global diversity, population stratification, and selection of human copy-number variation.</a> Science. 349 (6253), aab3761(2015).</li>
<li>Navin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+tumor+progression+from+genomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Inferring tumor progression from genomic heterogeneity.</a> Genome Res. 20 (1), 68-80 (2010).</li>
<li>Torres, L., Ribeiro, F. R., Pandis, N., Andersen, J. A., Heim, S., Teixeira, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+genomic+heterogeneity+in+breast+cancer+with+clonal+divergence+between+primary+carcinomas+and+lymph+node+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+cancer+res+and+treat%22%5BJournal%5D)">Intratumor genomic heterogeneity in breast cancer with clonal divergence between primary carcinomas and lymph node metastases.</a> Breast cancer res and treat. 102 (2), 143-155 (2007).</li>
<li>Yates, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclonal+diversification+of+primary+breast+cancer+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing.</a> Nat. Med. 21 (7), 751-759 (2015).</li>
<li>Forsberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+somatic+structural+changes+in+the+nuclear+genome+of+human+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Human+Gen%22%5BJournal%5D)">Age-related somatic structural changes in the nuclear genome of human blood cells.</a> Am. J. Human Gen. 90 (2), 217-228 (2012).</li>
<li>Laurie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detectable+clonal+mosaicism+from+birth+to+old+age+and+its+relationship+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Gen%22%5BJournal%5D)">Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer.</a> Nat. Gen. 44 (6), 642-650 (2012).</li>
<li>Jacobs, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detectable+clonal+mosaicism+and+its+relationship+to+aging+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Gen%22%5BJournal%5D)">Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer.</a> Nat. Gen. 44 (6), 651-658 (2012).</li>
<li>Knouse, K. A., Wu, J., Whittaker, C. A., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+low+levels+of+aneuploidy+across+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals low levels of aneuploidy across mammalian tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (37), 13409-13414 (2014).</li>
<li>Knouse, K. A., Wu, J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+megabase-scale+somatic+copy+number+variation+using+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of megabase-scale somatic copy number variation using single-cell sequencing.</a> Genome Res. 26 (3), 376-384 (2016).</li>
<li>Nextera XT DNA Library Preparation Kit. at. , at: 
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html</a> (2016).</li>
<li>Advanced Analytical Fragment Analyzer. , at: 
 <a target="_blank" href="http://aati-us.com/product/fragment-analyzer">http://aati-us.com/product/fragment-analyzer</a> (2016).</li>
<li>KAPA Library Quantification Kit. , at: 
 <a target="_blank" href="https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/">https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/</a> (2016).</li>
<li>Illumina HiSeq 2000. , at: 
 <a target="_blank" href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_instruments/hiseq_2000.html">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_instruments/hiseq_2000.html</a> (2016).</li>
<li>FASTX-Toolkit. , at: 
 <a target="_blank" href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> (2016).</li>
<li>Burrows-Wheeler Aligner. , at: 
 <a target="_blank" href="http://bio-bwa.sourceforge.net/">http://bio-bwa.sourceforge.net/</a> (2016).</li>
<li>SAMTools. , at: 
 <a target="_blank" href="http://samtools.sourceforge.net/">http://samtools.sourceforge.net/</a> (2016).</li>
<li>HMMcopy. , at: 
 <a target="_blank" href="http://compbio.bccrc.ca/software/hmmcopy/">http://compbio.bccrc.ca/software/hmmcopy/</a> (2016).</li>
<li>DNAcopy. , at: 
 <a target="_blank" href="https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html">https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html</a> (2016).</li>
<li>Picard. , at: 
 <a target="_blank" href="http://broadinstitute.github.io/picard/">http://broadinstitute.github.io/picard/</a> (2016).</li>
<li>bedtools. , at: 
 <a target="_blank" href="http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/">http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</a> (2016).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li>
<li>Navin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li>
<li>Szulwach, K. E., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Genetic+Analysis+Using+Automated+Microfluidics+to+Resolve+Somatic+Mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Genetic Analysis Using Automated Microfluidics to Resolve Somatic Mosaicism.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135007(2015).</li>
<li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Detection+of+Single-Nucleotide+and+Copy-Number+Variations+of+a+Single+Human+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+breast+cancer+revealed+by+single+nucleus+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing.</a> Nature. 512 (7513), 155-160 (2014).</li>
<li>Zhang, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromothripsis+from+DNA+damage+in+micronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromothripsis from DNA damage in micronuclei.</a> Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).</li>
<li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Genomics%3A+Advances+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives.</a> PLoS Genetics. 10 (1), e1004126(2014).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gen%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nat. Rev. Gen. , 1-14 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Geleneksel olarak, bu tür FISH ve SKY olarak sitolojik yöntemler gerekli tek hücre düzeyinde CNVs ve anöploidi belirlenmesi. Şimdi, tek bir hücre sıralama bu tür sorulara için alternatif bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. bu genom ve yüksek çözünürlüklü hem olduğu gibi tek hücreli sıralama FISH ve SKY üzerinde avantajlara sahiptir. Uygun kalite kontrol yöntemleri uygulandığında bu FISH ve SKY doğasında melezleme ve yayma eserler duyarlı değildir Dahası, tek hücre sıralama daha güvenilir bir CNVs değerlendirilmesini ve anöploidi sağlayabilir. Ancak, tek bir hücre sıralama son uygulamaların birçok yöntem kapsamlı duyarlılık değerlendirilmesi ve özgünlüğü ile doğrulanmış ve analizler edilmemiştir. Gerçekten de, diğer çalışmalarda kullanılan analitik yaklaşımlar bazı yanlış pozitif KNV 12 çağrıları yüksek frekanslarda (&gt;% 50) ile ilişkilidir. biz tarif yaklaşım titizlikle kn hücreleri kullanılarak test edilmiştirKNV tespiti 12 duyarlılık ve özgüllüğünü doğru ve yanlış keşif oranlarını belirlemek ve optimize etmek için kendi CNV yükü. 10 Mb aşan kalite kontrol ve bu protokolü açıklanan analitik yaklaşımlar, 5 Mb kazançlarının yaklaşık% 20, 5 Mb kayıplarının% 75&#39;i ve tüm CNVs kullanılarak tespit edilebilir. Tek hücre sıralama yanlış keşif oranının belirlenmesinde zor olsa da, biz% 25 daha az olduğu tahmin var. Bu protokol, çeşitli kaynaklardan gelen hücrelere uygulanabilir, komut KNV algılama çözünürlüğünü ayarlamak için değiştirilebilir, ve protokol genomik değişiklikler diğer türleri tanımlamak için adapte edilebilir. Orada tek hücre içine taze dokuları ayrışan araçlarının çeşitli ve birçok yayın cilt 24 ve beyin 25 gibi belirli dokular için optimize prosedürleri açıklanmaktadır. o fo verdiğinden Biz Mikroaspirasyon tarafından tek hücrelerin izole tercih<html> Her bir hücrenin R görsel değerlendirme sekanslanacak olan. Bununla birlikte, floresans ile aktive edilen hücre sıralama (FACS) 26 ve mikroakışkan cihazlar 27 tarafından tek hücrelerin izole edilmesi de mümkündür. Tek hücre izolasyonu ve tüm genom amplifikasyonu elle gerçekleştirilir, izole etmek ve tek bir seferde kırk hücrelere kadar yükseltmek için uygun olur. Yüksek kaliteli tek hücre sıralama verileri elde etmek için, tek bir hücre genomlarının amplifikasyonu düzgün ve tam olması çok önemlidir. Bu liziz ve amplifikasyon verimi hem de izole edilmiş tek hücrelerin kalitesi dizi verinin kalitesi üzerinde önemli bir etkisi olduğunu belirledik. Bu nedenle, hücreleri hücreler izole hemen sonra başlamalı hemen önce izolasyonu ve tüm genom amplifikasyonu için kendi doğal ortamından hasat edilmelidir. adım 2.3-2.6 de tarif edildiği gibi, ayrıca, parçalama ve parçalanma adımı tam olarak izlenmelidir. &quot;&gt; Algoritmalar duyarlılık ve özgüllük 12 üzerindeki etkilerinin karşıt, KNV algılama çözünürlüğünü değiştirmek için ayarlanabilir. Tetraploidi 11 ayar tam kromozom anöploidi tespit eşikleri ayarlamak da mümkündür. Ancak, biz bulmak tüm genom amplifikasyonu esnasında katılan gürültü küçük varyantları 12 tespitini zorlaştırmaktadır olarak yaklaşım CNVs 5&#39;inden Mb tespit edebilir. tüm genom amplifikasyonu yaklaşımlar ileri geliştirmeler, sonuçta tek bir hücre sıralama kullanılarak KNV algılama çözünürlüğünü arttırmak gerekir. Tek hücre sıralaması sadece kopya sayısı değişikliklerinin araştırılması hem de tek nükleotid değişimleri 28, 29 ve bir yapısal versiyonunun 30 sağlar. tek bir hücre izolasyonu için protokol bu que cevap uygulanabilirparagrafındaki. Bununla birlikte, tüm genom amplifikasyonu yönteminin seçimi, belirli uygulamaya bağlıdır. Polimeraz zincir reaksiyonu dayanan bu protokol, tarif edilen yöntem, bu amplifikasyon önyargı 32 daha düşük seviyeleri ile ilişkili olduğu için kopya sayısı değişiklikleri tespit etmek için uygundur. Bu tür tek nükleotid polimorfizm genomik değişiklikler, diğer türde araştırmak için, tüm genom amplifikasyonu için diğer yöntemler 31, 32 daha uygun olduğuna inanılmaktadır.

DNA kopya sayısı değişiklikler birkaç baz çifti büyüklükleri değişebilir tüm kromozomlar (anöploidi) ila (CNVs) (kopya sayısı varyantları). Genomun büyük bölgeleri etkileyen kopya sayısı değişiklikleri kadar genler 1, 2 binlerce ifadesini değiştirerek önemli fenotipik sonuçlar doğurabilir. Toplu dizileme veya mikroarray bazlı yöntemler, 3, 4 ile tespit edilebilen bir nüfusun bütün hücrelerde bulunur CNVs. Ancak, popülasyonlar da nüfus ya da hatta tek hücrelerinin bir alt kümesi mevcut CNVs ile, genetik olarak heterojen olabilir. Genetik heterojenite bilinmiyor sonucu 5, 6, 7, 8, 9, aynı zamanda normal dokularda da tümör gelişimini sürücü, kanser yaygındır ve <sup&gt; 10. Geleneksel olarak, genetik heterojenite sitolojik yaklaşımlar veya dökme sıralama yoluyla değerlendirildi. Böyle situ hibridizasyon (FISH), kromozom yayılır ve spektral karyotipleme (SKY) floresan olarak sitoloji yaklaşımlar, tek tek hücrelerin içinde bulunan tanımlama değişikliklerin yarar var ama melezleme ve 11 yayılan eserler nedeniyle yüksek hata oranlarına sahiptir. Bu yaklaşımlar da kendi çözünürlük sadece açığa kopya sayısı sınırlıdır birkaç megabases kapsayan değişmektedir. Ardışık veya toplu DNA mikroarray&#39;ler, doğruluk ve çözünürlük olsa daha yüksek, daha az duyarlıdır. popülasyon bazlı yaklaşımlar ile genetik heterojenite tespit etmek için, varyantlar popülasyonunda hücre önemli bir fraksiyonunda mevcut olmalıdır. tek hücre genomik DNA&#39;yı büyütmek için yöntemler ortaya mümkün tek hücre genomunu dizilemek için yaptı. Tek hücre sequencing uygun kalite kontrol yöntemleri uygulanmaktadır yüksek çözünürlük, yüksek hassasiyet ve, yüksek doğruluk 12 avantajlara sahiptir. Burada, tek bir hücre içinde megabaz ölçekli kopya sayısı değişimleri tespit etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz, bağlayıcı adaptörü PCR kullanılarak genomik DNA yükseltmek nesil dizileme için kütüphaneler hazırlamak ve kopya numarası gizli Markov modeli ve dairesel ikili segmentasyon hem varyantları tespit, Mikroaspirasyon tarafından tek hücreleri izole.

<table><tbody><tr><td>Kalibre edilmiş mikrokılcal pipetler için aspiratör borusu tertibatları</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>PVC boru (ID 3/16", OD 5/16", ~1 ayak)</td><td>VWR</td><td>89068-500</td><td></td></tr><tr><td>PVC boru (ID 5/16", OD 7/16", ~6 inç)</td><td>VWR</td><td>89068-508</td><td></td></tr><tr><td>HT Tuffryn Membranlı Akrodisk Şırınga Filtresi (çap 25 mm, gözenek boyutu 0.2 ve mikro; m)</td> <td>VWR</td><td>28144-040</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet (5 mL)</td><td>BioExpress</td><td>P-2837-5</td><td>Herhangi bir plastik 5 mL pipet yeterli olmalıdır</td></tr><tr><td>Oksijen Kullanımı için In-Line Su Tutucu</td><td>Amazon.com</td><td>700220210813</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal Erime Noktası Tüpleri (ID 0,8-1,1 mm, 100 mm uzunluk)</td><td>VWR</td><td>34502-99</td><td></td></tr><tr><td>Modelleme kili</td><td>VWR</td><td>470156-850</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı (150 mm çap)</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>Tek hücrelerin aspirasyonunu kolaylaştırmak için yüzey yapışmamalıdır</td></tr><tr><td>Sert Kabuk&nbsp; Tam boy 96 kuyulu yarı etekli PCR&nbsp; Plakalar</td><td>Bio-Rad</td><td>HSS9601</td><td>Herhangi bir 96 oyuklu PCR plakası yeterli olmalıdır</td></tr><tr><td>96 oyuklu doku kültürü plakası</td><td>VWR</td><td>62406-081</td><td>Herhangi bir 96 oyuklu doku kültürü plakası yeterli olmalıdır</td></tr><tr><td>GenomePlex Tek Hücreli Tüm Genom Amplifikasyon Kiti</td><td>Sigma</td><td>WGA4</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'A' Film</td><td>Bio-Rad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>Mini plaka döndürücü</td><td>Thomas Scientific</td><td>1225Z37</td><td></td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096&nbsp;</td><td>Herhangi bir termal döngüleyici, 96 oyuklu bir PCR plakasını barındırabildiği sürece yeterli olmalıdır</td></tr><tr><td>Agencourt Ampure</td><td>Beads Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Mıknatıs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Benzer herhangi bir manyetik tüp şeridi yeterli olacaktır</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Kütüphanesi Hazırlama Kiti</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT İndeks Kiti</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1012</td><td></td></tr><tr><td>Komple kit (Roche LightCycler 480 için optimize edilmiştir)</td><td>Kapa Biyosistemler</td><td>KK4845&nbsp;</td><td>Bu kit, Roche LightCycler 480 gerçek zamanlı PCR cihazı için optimize edilmiştir. Farklı bir makine kullanıyorsanız, makineniz için optimize edilmiş bir kit kullanın.</td></tr></tbody></table>

tek hücre sıralama kullanarak kopya sayısı değişmeler algılama

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Tek hücre çözünürlükte genomik değişim tespiti, normal dokularda, kanser ve mikrobik popülasyonların genetik heterojenliği ve evrim karakterize edilmesi için önemlidir. Genetik heterojenite değerlendirmek için geleneksel yöntemler düşük çözünürlük, düşük hassasiyet, ve / veya düşük özgüllük ile sınırlı kalmıştır. Tek hücre sıralama uygun analiz yüksek çözünürlük, yüksek hassasiyet ve yüksek özgüllük ile genetik heterojenite tespit etmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Burada tek hücrelerin izolasyonu, tüm genom amplifikasyonu, sekanslama ve analiz için bir protokol sağlar. Bizim yaklaşım tek hücrelerde megabase ölçekli kopya sayısı varyantlarının güvenilir tanımlanması için izin verir. Bununla birlikte, bu protokol yönleri de tek hücre genetik değişikliklerin diğer tip araştırmak için uygulanabilir.

Monte aspiratör Şekil 1A benzer görünmelidir. İğne o ama çok geniş bir büyük hacimli tek bir hücre ile çizilmiş bir tek hücre karşılamak için yeterince geniş olacak şekilde çizilmelidir. 10X alan (Şekil 1B) bir ila beş hücre olduğunda tek hücre aspire en kolay yoldur. Tüm genom amplifikasyonu başarılı ise, örnek bir agaroz jeli üzerinde leke olarak gösterilir (Şekil 2, bölmeler, 1, 2, 4, 5, 6, ve 7) olacak. Bir soluk veya eksik smear başarısız amplifikasyon reaksiyonu gösterir ve örnek sıralı olmamalıdır (Şekil 2, 3 şeritleri ve 8). Kütüphane hazırlandıktan sonra, numune parçası boyutu dağılımı, bir fragmanı analizöründe kapiler elektroforez ile değerlendirilmelidir.Hazırlanabilmişse kütüphaneleri 150 900 bp fragmanı, boyutları çok daha dağılımına sahip olacaktır (Şekil 3, A, B). Başarısız bir kütüphane hazırlanması yamuk parçası boyutu dağılımına neden olur ve bu kütüphaneler (Şekil 3C) sıralanmamalıdır. gizli Markov modelinin (HMMcopy) ve dairesel ikili bölümleme (DNAcopy) üzerinden dizi verilerinin işlenmesi tahmini kopya sayısının parça halinde her bir hücrenin genomu ayrıştırma olacaktır. Bu segmentler daha sonra tek bir hücre (Tablo 1) kazanç ya da kaybı ile tutarlıdır tahmini kopyalama sayısı ile bu tespit etmek filtrelenebilir. HMMcopy ve DNAcopy Bunlar süzülmüş segmentler daha sonra yüksek güven CNVs tanımlamak için üst üste edilmelidir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig1.jpg" /> 1. Tek hücre izolasyonu rakam. (<html> A) Bir microaspirator toplandı. (B) 10X alan gösteren hücreleri (oklar) ve microaspirator iğne (sağ alt köşe) ayrışmış. 10X alanında bir ila beş hücre olduğunda tek hücre aspire en kolay yoldur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig2.jpg" /> 2. Tüm genom amplifikasyon rakam. tüm genom amplifikasyonu ürünleri 5 ul agaroz jel elektroforezi. başarılı bir şekilde 1 kb 100 bp&#39;den parlak smear görünür amplifiye Numuneler (kulvarlar 1, 2, 4, 5, 6 ve 7) ve dizilebilir. başarıyla soluk lekeleri ya da hiç smear (kulvarlar 3 ve 8) üretecek yükseltmek yoktur ve sıralı olmamalıdır örnekler.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55143/55143fig3.jpg" /> Şekil 3. kütüphane hazırlanması. Bir fragman analizörü Temsilcisi sonuçlar. grafikleri Y ekseni üzerinde X ekseninde ve bağıl floresan birimi (RFU) üzerine (bp olarak) fragmanı boyutunu gösterir. Her grafiğin sağında bir simüle jel şerit olduğunu. (A) 150 ve 900 bp arasında ve keskin zirveleri ya da bir tarafa doğru önyargısız eşit dağıtımı ile, ideal bir örnek için bulundu. Bu örnek, dizileme için kabul edilebilir. Bir boyut dağılımı ile iyi bir örnek (B) Sonuçlar, düşük değerli parçası boyutları eğilmiş. Bu en uygun olmasa da, numune hala dizilenebilmektedir. (C) ağırlıklı olarak küçük fragman boyutları ile, başarısız bir örnek bulundu. Bu büyük olasılıkla tagmentation aşaması esnasında uzun inkübasyon kaynaklanırKütüphane hazırlama. Bu örnek sıralanmamalıdır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="7"> HMMcopy </td></tr><tr><td> Numune </td><td> bölüm </td><td> Chr </td><td> Başlama </td><td> Son </td><td> Belirtmek, bildirmek </td><td> Medyan </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 23 </td><td> chr8 </td><td> 144.500.001 </td><td> 146.500.000 </td><td> 6 </td><td> 0.5008794 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 29 </td><td> chr10 </td><td> 67.000.001 </td><td> 134.500.000 </td><td> 6 </td><td> 0.4031945 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 52 </td><td> chr19 </td><td> 1 </td><td> 20000000 </td><td> 6 </td><td> 0.4616884 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 57 </td><td> chrY </td><td> 1 </td><td> 59.500.000 </td><td> 2 </td><td> -1,506532 </td></tr><tr><td colspan="8"> DNAcopy </td></tr><tr><td> Numune </td><td> krom </td><td> Başlangıç bin </td><td> bitiş bin </td><td> Başlama </td><td> Son </td><td> Seg ortalama </td><td> Seg med </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr10 </td><td> 88 </td><td> 197 </td><td> 62.612.945 </td><td> 129.971.511 </td><td> 1,4688 </td><td> 0.157 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr19 </td><td> 0 </td><td> 31 </td><td> 0 </td><td> 28.416.392 </td><td> 1,4141 </td><td> 0,1674 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chrX </td><td> 77 </td><td> 126 </td&gt; <td> 51.659.160 </td><td> 95.343.369 </td><td> 1,3548 </td><td> 0,1874 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chrY </td><td> 0 </td><td> 14 </td><td> 0 </td><td> 23.805.358 </td><td> -2,7004 </td><td> 0,3591 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Veri analizi. Tek bir hücreden HMMcopy ve DNAcopy tarafından oluşturulan Filtreli segmentler. Bu iki sonuç örtüşen 67 130 Mb gelen kromozom 10 üzerindeki bir kazanç yanı sıra 0 ila 20 Mb gelen kromozomda 19 bir kazanç ortaya koymaktadır. Biz kromozomun 19 proksimal kısmında kazançlar tek hücre sıralama 12 bir dışlayıcı olduğunu bulduk.

Tek hücre sıralama yüksek çözünürlükte genomik değişikliklerin ele almak için giderek daha popüler ve erişilebilir bir araçtır. Biz tek hücrelerde kopya sayısı değişiklikleri tanımlamak için tek bir hücre sıralama kullanan bir protokol sağlar.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Bu prosedürün genel amacı, tek hücrelerde megabaz ölçeğinde DNA kopya sayısı değişimlerini belirlemektir. Hücre popülasyonlarındaki genomik heterojenliği kategorize edebilmek için, genomik değişikliklerin tek hücre çözünürlüğünde tespit edilmesi gereklidir. Geleneksel olarak bu işlem sitolojik yaklaşımlar kullanılarak gerçekleştiriliyordu; ancak bu yöntemlerin hassasiyetleri ve özgüllükleri sınırlıydı.Tek hücreli sekanslama, ancak dikkatli bir şekilde yürütüldüğünde, önceki yaklaşımlara kıyasla artırılmış hassasiyet ve özgüllükle çeşitli genomik değişiklikleri tespit edebilir. Burada, tek hücrelerde megabase ölçeğindeki kopya sayısı değişikliklerini güvenilir bir şekilde tespit etmek için tek hücreli sekanslamanın nasıl kullanılacağını açıklıyoruz. Mikro-aspiratörü monte etmek için, önce aspiratör tüp düzeneğinin şeffaf plastik ucunu çıkarın ve dar ucu, 3/16 inç iç çapa sahip bir ayak uzunluğundaki PVC borunun bir ucuna yerleştirin.0.2 mikrometre şırınga filtresinin çıkışını, 3/16 inç iç çapındaki 30 cm uzunluğundaki PVC borunun diğer ucuna yerleştirin. Ardından, 0.2 mikrometre şırınga filtresinin girişini, 5/16 inç iç çapındaki 15 cm uzunluğundaki PVC borunun bir ucuna yerleştirin. Beş mililitrelik plastik serolojik pipeti bir mililitre derecesinden kırın ve kırılan ucu, 5/16 inç iç çapındaki PVC borunun açık ucuna yerleştirin.Ardından, beş mililitrelik plastik serolojik pipetin çıkışını bir aspiratör tüp düzeneğinin esnek ucuna yerleştirin, daha sonra saklama amacıyla düzeneğin kırmızı ağızlık kısmını kapatmak için steril bir plastik tüp kullanın. Tüpün orta kısmını bir alevin yakınına getirip tüpün her iki ucuna gerilim uygulayarak, cam bir kapiler tüpü 10-30 mikrometre iç çapa sahip olacak şekilde çekin. Çekilen tüpü ikiye bölerek iki potansiyel aspiratör iğnesi oluşturun.Tek hücre seçimi için uygun iç çapta yeterli sayıda iğne hazırlandığından emin olmak amacıyla bu adımı birkaç tüp ile tekrarlayın. İnsan fibroblast hücre hatları gibi yapışkan hücreleri hazırlamak için, hücreleri tripsinizasyon yoluyla toplayın ve hücreleri uygun besiyerinin bulunduğu konik bir tüpe aktarın. Tüm genom amplifikasyonu için, çeker ocak yüzeyini, pipet ucu kutularını ve pipet uçlarını %10 çamaşır suyu sıkarak steril bir çalışma alanı hazırlayın.Ardından, %70 etanol ile yıkama işlemini tekrarlamadan önce hepsini bir kağıt havluyla silin. Bütün Genom Amplifikasyonu (Whole Genome Amplification, WGA) kitinden sekiz µL suyu, 96 kuyucuklu bir PCR plakası üzerindeki münferit kuyucuklara ekleyin. Sonra, 96 kuyucuklu PCR plakasını 96 kuyucuklu bir doku kültürü plakasının kapağıyla kapatın ve plakayı buz üzerine yerleştirin.Ardından, 15 santimetrelik bir Petri kabındaki 10 mililitre besiyerine veya PBS'ye 1.000 hücre ekleyin ve hücrelerin kaba yapışmasını önlemek için kabı buza yerleştirin. Daha sonra, hala buz üzerindeyken, Petri kabındaki hücreleri ve 96 kuyucuklu PCR plakasını 10X objektifli bir ışık mikroskobuna taşıyın. Aspiratör iğnesinin ucunun kırılması için, iğnenin dışa doğru uzanan ucuna sert bir yüzeyde hafifçe vurarak aspiratör iğnesinin açıklığını artırın.Ardından iğnenin geniş ucunu mikro-aspiratörün şeffaf ucuna yerleştirin. Daha sonra hücreleri içeren Petri kabını mikroskop tablasına yerleştirin. Aspiratörün kırmızı ağızlık kısmını ağza yerleştirin.Ardından, bir elinizle aspiratör iğnesini, diğer elinizle Petri kabını hareket ettirerek dizilecek tek hücreleri belirleyin. Ağızla vakum uygulayarak, tek bir hücreyi yaklaşık 1-2 µL ortam veya PBS ile birlikte aspiratör iğnesinin içine çekin. Hücreyi, 96 kuyucuklu PCR plakasının tek bir kuyucuğundaki 8 µL suyun içine aktarın.Tek hücre sekanslama verilerinin kalitesi ve faydası, her bir hücrenin durumuna ve genomuna bağlıdır; bu nedenle, canlı ve apoptotik olmayan hücreleri izole etmek için hücre hazırlama ve mikro-aspirasyon sırasında dikkatli olun. Her bir hücreyi aspire edip PCR plakasının bir kuyucuğuna aktardıktan sonra, hücrenin alındığı kuyucuğu işaretleyin. Bu işlemi istenen hücre sayısı kadar tekrarlayın.Bu sırada, Whole Genome Amplification kitindeki 10X Single Cell Lysis Fragmentation Buffer'ı çözdürün. Tüm genom amplifikasyonu sırasında kontaminasyonu önlemek için tüm reaktifleri bir doku kültürü davlumbazı içerisinde ekleyin. Filtreli pipet uçları kullanın ve kuyucuklar arasında pipet ucunu değiştirin.32 hücreye kadar olan her set için, bir mikrosantrifüj tüpünde 32 µL 10X Single Cell Lysis and Fragmentation Buffer ve iki mikrolitre Proteinase K çözeltisini birleştirin, ardından içeriği karıştırmak için tüpü vorteksleyin. Her kuyucuğa çözeltiden bir mikrolitre ekleyin ve karıştırmak için pipetle aşağı yukarı hareket ettirin. Plakayı kapatın ve tüm kuyucukları mühürlemek için plastik film kullanın.Ardından plakayı bir mini plaka santrifüjünde kısa süreliğine santrifüjleyin. Sonrasında plakayı aşağıdaki programı kullanarak termosiklet cihazında çalıştırın. Daha sonra plakayı buz üzerinde soğutun ve kısa süreliğine santrifüjleyin.Tüm Genom Amplifikasyon kitinden bir çalışma kütüphane hazırlama tampon çözeltisi hazırlamak için, her bir hücre için iki mikrolitre 1X Single Cell Library Preparation Buffer ve bir mikrolitre Library Stabilization Solution'ı birleştirin. Tüm genom amplifikasyonu sırasında yanlılığı minimize etmek ve yüksek kaliteli sekanslama kütüphanelerinin hazırlanmasını sağlamak için yeterli hücre lizizi ve tam genom fragmantasyonu kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, bu adımları tam olarak yazıldığı gibi gerçekleştirmeye özen gösterin.Plakadaki plastik filmi çıkarın ve her kuyucuğa üç µL çözelti ekleyin. Karıştırmak için kuyucuk içeriğini pipetle aşağı yukarı çekin, ardından plastik filmi tekrar kapatın. Plakayı kısa süreli santrifüj ettikten sonra, hücreleri 95 °C'de iki dakika inkübe edin, ardından plağı buz üzerinde soğutun ve plağı tekrar kısa süreli santrifüj edin.Şimdi, plastik filmi çıkarın, her kuyucuğa bir mikrolitre Kütüphane Hazırlama Enzimi ekleyin ve karıştırmak için kuyucuktaki içeriği pipetle yukarı-aşağı çekin, ardından plastik filmi tekrar kapatın. Plakayı kısa süreli santrifüj ettikten sonra termosikletere yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın. Plakayı soğutup kısa bir santrifüj işleminden geçirdikten sonra, her bir hücre için 48,5 mikrolitre su, 7,5 mikrolitre 10X amplifikasyon master mix ve 5 mikrolitre WGA DNA polimerazı birleştirerek Whole Genome Amplification kitinden bir çalışma amplifikasyon karışımı hazırlayın.Çalışma karışımını buz üzerinde tutun. Plaka üzerindeki plastik filmi çıkarın. Her bir kuyucuğa 61 µL çalışma amplifikasyon karışımı ekleyin ve karıştırmak için her kuyucuğun içeriğini pipetle aşağı yukarı hareket ettirin, ardından plastik filmi yerine yerleştirin.Plakayı kısaca santrifüjleyin ve aşağıdaki şekilde termal döngüye tabi tutun. Örnekleri sekanslayın ve veri analizini metin protokolüne göre gerçekleştirin. Bu şekilde gösterildiği gibi, eğer tüm genom amplifikasyonu başarılı olursa, örnek agaroz jelde bir yayılma (smear) şeklinde görünecektir.Silik veya mevcut olmayan bir yayılma, amplifikasyon reaksiyonunun başarısız olduğunu gösterir ve örnek dizilemeye alınmamalıdır. Burada gösterildiği gibi, fragman boyutlarının analizi bir fragman analiz cihazında kapiler elektroforez kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Başarıyla hazırlanan kütüphaneler, 150 ile 900 baz çifti arasında oldukça düzgün bir fragman boyutu dağılımına sahip olacaktır.Başarısız kütüphane hazırlığı, sapmalı bir fragman boyut dağılımına yol açacaktır ve bu tür kütüphaneler sekanslanmamalıdır. Gizli Markov modeli ve dairesel ikili segmentasyon kullanılarak, her bir hücrenin genomu tahmin edilen kopya sayısı segmentlerine ayrılmıştır. Bu tablo, tek bir hücreden elde edilen örtüşen sonuçları göstermekte olup, kromozom 10'da 67 ile 130 megabase arasında ve kromozom 19'da 0 ile 20 megabase arasında bir kazanç olduğunu ortaya koymaktadır.Tek hücrelerin izolasyonu ve tüm genom amplifikasyonu aynı gün içinde gerçekleştirilebilir ve gerçekleştirilmelidir. Ardından sekanslama kütüphanelerinin hazırlanması, tüm genom sekanslaması ve veri analizi esnek bir takvimle yürütülebilir. Hücre izolasyonu ve tüm genom amplifikasyonu uygun şekilde yapıldığında ve veri analizi açıklandığı gibi titizlikle gerçekleştirildiğinde, beş megabase'i aşan kopya sayısı değişiklikleri yüksek hassasiyet ve özgüllükle tespit edilebilir.Protokolümüz özellikle kopya sayısı değişikliklerinin tespiti için tek hücre dizileme kullanımını tanımlasa da, tek hücre izolasyonu ve kütüphane hazırlama gibi bu protokolün belirli kısımları, diğer genomik değişiklikleri tespit etmek için de uygulanabilir.

detection-of-copy-number-alterations-using-single-cell-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Biz Barkodlanan DNA kütüphaneleri ve büyük ölçüde paralel "yeni nesil" dizisi ile klinik tümör numunelerinde önemli kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için olan hibridizasyon-bazlı sonraki ekson yakalama hazırlanmasını tarif etmektedir. Hedefli ekson dizileme nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık verimli, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama avantajlar sunmaktadır.

Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

Genomik kopya sayısı varyantları tespiti için Dizi CGH G-bantlı karyotip analizi yerini aldı. Bu kağıt teknolojisi ve teşhis hizmet laboratuvarında uygulanmasını açıklar.

Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array)

Burada adresli damlacık microarrays (ADM'ler), bir damlacık array tabanlı yöntemi mutlak protein bolluk içinde tek hücreleri belirlemek mümkün mevcut. Biz heterojenite tümör baskılayıcı protein p53 bir insan kanser hücre satırı ifade derecesinin ADM'ler kapasitesini göstermek.

Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Bu el yazması kopya numarası varyasyon analizi serum veya plazma DNA gerçek zamanlı PCR yaklaşımı kullanarak gerçekleştirilen açıklar. Bu yöntem için tahmin kastrasyon dayanıklı prostat kanseri hastalarda ilaç direnci uygundur, ama aynı zamanda diğer hastalıklar için bilgilendirici olabilir.

Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak

El yazması bir nadir CDH1 transkript değişken (CDH1a) taze donmuş normal ve mide kanseri olan hastalarda elde edilen tümör doku algılamak için bir çip tabanlı dijital PCR tahlil açıklar.

Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Bu makalede, belirli bir hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal değişiklikleri tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan deneyler belirli bir tümör tipine odaklansa da, yaklaşım diğer solid tümörler için genel olarak uygulanabilir.

Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi

Protokol, yarı iletken tabanlı yeni nesil dizileme platformunda anöploidi için implantasyon öncesi genetik testlerde gerekli olan genel laboratuvar içi prosedürleri sunar. Burada tüm genom amplifikasyonunun, DNA fragmanı seçiminin, kütüphane yapımının, şablon hazırlamanın ve dizileme çalışma akışının ayrıntılı adımlarını temsili sonuçlarla sunuyoruz.

Yarı İletken Tabanlı Yeni Nesil Dizileme Platformunda Anöploidi için İmplantasyon Öncesi Genetik Test

Burada, tek hücrelerde mutlak mitokondriyal (mt) DNA kopya sayısını ve mtDNA delesyon heteroplazmi seviyelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanarak Tek Hücreli Mitokondriyal DNA Kopya Sayısını ve Heteroplazmiyi Ölçme

Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokularda hedeflenebilir genomik değişiklikleri tespit etmek için otomatik, ISO15189 onaylı yeni nesil dizileme iş akışını açıklar.

Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Hedeflenebilir Değişikliklerin Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak Saptanması

Öğrenin tek hücre sıralama yöntemiyle megabaz ölçeğinde DNA kopya sayısı değişmelerini tespit etmeyi. Bu protokol, genomik heterojeniteyi anlamak için geleneksel sitolojik yöntemlere göre artırılmış duyarlılık ve özgüllük sağlar.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Daha fazla video keşfet