Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Bakteriyel efektör proteinleri başarılı enfeksiyonları kurulması için önemlidir. Bu protokol, doğal bitki konukçuda bir bakteriyel efektör proteininin proteinli bağlanma partnerleri ile deneysel tanımlanmasını açıklar. Maya iki hibrit ekranlarından yoluyla bu efektör etkileşimleri belirlenmesi moleküler patojenite stratejilerinin çözülüyor önemli bir araç haline gelmiştir.

Bu prosedürün genel amacı, bir candidatus fitoplazma malefaktör proteininin malus domestica'dan gelen konak proteinleri ile etkileşimini tanımlayarak virülan stratejileri ve konakçı patojen sistemlerini çözmektir. Bu yöntem, birçok farklı biyolojik araştırma alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve burada, Elma Proliferasyon Hastalığının gelişiminin altında yatan moleküler mekanizmaları aydınlatmak için bitki araştırmalarında kullanılmaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir patojen efektörünün binlerce potansiyel etkileşimciye karşı taranabilmesi ve bu yöntemi enfeksiyon araştırmalarında kolayca uygulanabilir bir başlangıç noktası haline getirmesidir.

Başlamak için, Elma Çoğalmasına özgü semptomları olan enfekte ağaçları belirleyin ve semptomsuz ağaçları kontrol edin. Temiz budama makası kullanarak, kök sisteminin 0,5 1 cm çapında ve yaklaşık 5 cm uzunluğunda üç farklı bölgesinden kök örnekleri kesin. Kök örneklerini yeterince etiketlenmiş plastik torbalara koyun.

Daha sonra numuneleri soğutulmuş termal paketlerle birlikte soğuk bir kutuya koyun ve daha sonraki işlemlere kadar dört santigrat derecede saklayın. Toprağı çıkarmak için kök örneklerini suyla durulayın. Daha sonra numuneleri steril bir Petri kabına aktarın ve kök epidermisi ve korteksi çıkarmak için sterilize edilmiş bir neşter kullanın.

Temiz, tüy bırakmayan bir mendille neşteri silin. Daha sonra cihazı %70 etanole batırın ve açık alev üzerinde ısıtın. floemi çizmek için neşter kullanın.

Numuneyi küçük parçalar halinde doğrayın ve parçaların 30-100 miligramını steril iki mililitrelik bir reaksiyon tüpüne alın. Numuneleri 80 santigrat derecede saklayın veya hemen DNA'yı izole etmek için kullanın, bu da efektör gen amplifikasyonu ve ardından efektörün yem vektörüne klonlanması için şablon görevi görür. Enfekte ağaçlardan fitoplazma polispesifik DNA'yı izole ettikten sonra, yem vektörlerine klonlama ve metin protokolüne göre kendi kendine aktivasyon ve ekspresyon için test edin.

Streak plex A ATP 00189 efektörü, NMY51'i yeni bir SD-trp plakasına dönüştürdü ve kırmızı koloniler görünene kadar iki ila üç gün boyunca 30 santigrat derecede kültürledi. Küçük bir çalkalama şişesinde üç mililitre SD-trp ortamını aşılamak için agar plakasından kırmızı bir koloni kullanın ve kültürü gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin ve dakikada 120-150 dönüşte çalkalayın. Ertesi gün, gece boyunca bir mililitre kültürle, 20 mililitre SD-trp'yi çalkalama şişesine aşılayın ve sekiz saat boyunca büyümesine izin verin.

Kültürü 0.2'lik bir OD600'e ayarlamak için SD-trp ortamını kullanın ve on mililitre kültürle, her biri 100 mililitre SD-trp ortamı içeren iki şişeyi aşılayın. Kültürleri gece boyunca çalkalayarak 30 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, kültürün OD600'ünü ve pelet 120 OD600 birimini ölçün.

Örneğin, 1.2'lik bir OD600 ölçülürse, 100 mililitre numuneyi döndürün, süpernatanı atın ve peleti iki çalkalayıcı şişeye yeniden süspanse etmek ve 30 santigrat derecede inkübe etmek için 800 mililitre önceden ısıtılmış 2xYPAD kullanın. Maya kültürünü 30 santigrat derecede ve dakikada 120-150 dönüşte inkübe edin. OD600'ü, 0,6'lık bir OD600'e ulaşılana kadar metin protokolüne göre yaklaşık her 1,5 saatte bir ölçün.

Metin protokolüne göre somon sperm DNA'sı, Te Lithium OAc ve PEG Lithium OAc hazırladıktan sonra, hücreleri peletlemek için 800 mililitre maya kültürünü 700 x G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peletleri toplam 200 mililitre steril çift damıtılmış su içinde yeniden süspanse edin. Sonra hücreleri tekrar pelet haline getirin ve süpernatanı atın.

Peleti 16 mililitre Te Lithium OAc karışımında yeniden süspanse edin ve numuneyi tekrar döndürün. Daha sonra süpernatanı attıktan sonra, peleti yeniden süspanse etmek için 9.6 mililitre Te Lithium OAc kullanın. Uygun büyüklükteki reaksiyon kaplarında, yedi mikrogram tepe HAC DNA kütüphane vektörü, 100 mikrolitre% 2 somon sperm DNA'sı ve 2.5 mililitre PEG Lityum OAc karışımı ile on iki şişe hazırlayın.

On iki şişenin her birine önceden hazırlanmış maya hücresi süspansiyonundan 600 mikrolitre ekleyin ve bir dakika boyunca kuvvetlice karıştırın. Daha sonra reaksiyonları 30 santigrat derecede bir su banyosunda 45 dakika boyunca inkübe edin ve her 15 dakikada bir karıştırın. Daha sonra, her şişeye 160 mikrolitre DMSO ekleyin ve kuvvetlice karıştırın.

Daha sonra şişeleri 42 santigrat derecede 20 dakika daha inkübe edin. Hücreleri peletledikten sonra, süpernatanı atın ve her bir peleti yeniden süspanse etmek için üç mililitre 2xYPAD kullanın. On iki şişenin tümündeki hücreleri 100 mililitrelik bir çalkalayıcı şişede toplayın ve mayayı 30 santigrat derecede ve dakikada 120 dönüşte 90 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, hücreleri peletledikten ve süpernatanı attıktan sonra, on mililitrelik bir serolojik pipet ve 4.5 mililitre steril %0.9 sodyum klorür kullanarak peleti dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice yeniden süspanse edin. Süspansiyonun 50 mikrolitresini çekin ve 1:10'dan 1:1000'e kadar on kat seyreltme hazırlamak için% 0.9 sodyum klorür kullanın. Daha sonra her seyreltmeden 100 mikrolitreyi SD-trp-leu agar içeren 90 milimetrelik Petri kaplarına koyun.

Seyreltilmemiş maya süspansiyonunun geri kalanını SD-trp-leu-His-ade agar ile 16x150 milimetre çapındaki Petri kaplarına yayın. Plakaları SD-trp-leu plakaları için üç gün ve SD-trp-leu-his-ade plakaları için dört gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. SD-trp-leu seçim plakaları üzerindeki farklı seri seyreltmelerin kolonilerini sayarak transfeksiyon verimliliğini belirleyin.

Koloniyi almak ve taze SD-trp-leu-his-ade seçici plakalara çizmek için steril bir pipet ucu kullanarak her klonu aktarın. Plakaları 24 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Toplam beş geçişe ulaşılana kadar klonların transferini her gün tekrarlayın.

Klonları analiz etmek için, steril bir başlık altında, her klon için bir mililitre SD-trp-leu-his-ade içeren bir steril iki mililitre reaksiyon tüpü hazırlayın. Her tüpe bir delik açmak için sıcak bir iğne kullanın ve deliği kapatmak için gaz geçirgen bir sızdırmazlık maddesi kullanın. Her şişeyi bir klondan taze koloni materyali ile aşılayın ve şişeleri 24 saat boyunca 30 santigrat derecede ve dakikada 150 dönüşte inkübe edin.

Hücreleri peletledikten ve süpernatanı attıktan sonra, peleti uygun tamponda yeniden süspanse edin ve iki mililitrelik yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın. Süspansiyona 100 mikrolitre asitle yıkanmış cam boncuk ekleyin ve tüpü beş dakika kuvvetlice karıştırın. Son olarak, plazmit DNA'sını metin protokolüne göre saflaştırın.

Kendi kendine aktivasyon testinin beklenen sonuçlarının bir özeti ve bunların yorumlanması bu tablo ve şekilde verilmiştir. Zayıf kendi kendine aktivasyon, trp-leu-his'te büyümeye yol açar, ancak trp-leu-his-ade tükenmiş seçim plakalarında değil. Maya, kendi kendini aktive eden güçlü bir yemle dönüştürülürken, besiyeri olmayan trp-leu-his-ade üzerinde büyüyecektir.

Yem ve avın başarılı bir şekilde birlikte transformasyonu, trp ve leu içermeyen seçici plakalarda büyüme ile karakterize edilir. Yem ve bir av proteininin etkileşimi, NMY51'in his ve ade oksitrofisinin tamamlanmasına yol açar Burada, bir Maya 2 Hibrit Deneyinde yem ve av arasındaki etkileşimin bir örneği gösterilmektedir. Malus domestica konak etkileşim ortakları, MdTCP24 ve MdTCP25 tanımlandı ve etkileşim, efektör ile denovo koni dönüşümü ile doğrulandı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, maya 2 hibriti, başta maya olmak üzere gerekli tüm ekipman ve malzemeler önceden uygun şekilde hazırlanırsa bir günde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, kontaminasyondan kaçınmak ve her zaman steril koşullar altında çalışmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, bulunan protein-protein etkileşimlerini doğrulamak için, örneğin bimoleküler floresan tamamlama gibi başka bir bağımsız yöntem gerçekleştirilmelidir.

Bu özellikle önemlidir, çünkü maya veya melez kendi başına yanlış pozitif sonuçlar üretmeye nispeten eğilimlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, birçok farklı araştırma alanındaki araştırmacıların, özellikle konak-patojen etkileşimlerinde protein-protein etkileşimlerini içeren moleküler prensipleri ve diğer birçok biyolojik araştırma alanını daha iyi anlamalarının yolunu açtı. Ayrıca, bu yöntemin uygulanmasının iyi donanımlı herhangi bir moleküler biyoloji laboratuvarında kolayca mümkün olduğunu anlayacaksınız.

Bazı kimyasallar, neşterler ve açık alevlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman belirli önlemleri göz önünde bulundurmanız gerekir. Bu, eldiven ve gözlük gibi kişisel güvenlik ekipmanlarınızı kullanmanız ve genel laboratuvar güvenlik ekipmanlarını kullanmanız anlamına gelir.