Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Bu prosedürün genel amacı, bir candidatus phytoplasma malefactor proteininin malus domestica konak proteinleri ile etkileşimini belirleyerek virulent stratejileri ve konak-patojen sistemlerini aydınlatmaktır. Bu yöntem, birçok farklı biyolojik araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve burada, Elma Proliferasyon Hastalığının gelişiminin altında yatan moleküler mekanizmaları açıklamak için bitki araştırmalarında kullanılmıştır. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir patojen efektörünün binlerce potansiyel etkileşimciye karşı taranabilmesiyle, bu yöntemi enfeksiyon araştırmaları için kolayca uygulanabilir bir başlangıç noktası haline getirmesidir.

Başlangıç olarak, Elma Proliferasyonu'na özgü semptomlar gösteren enfekte ağaçları belirleyin ve semptom göstermeyen ağaçları kontrol grubu olarak seçin. Temiz budama makasları kullanarak, kök sisteminin üç farklı noktasından 0,5-1 cm çapında ve yaklaşık 5 cm uzunluğunda kök örnekleri kesin. Kök örneklerini uygun şekilde etiketlenmiş plastik torbalara yerleştirin.

Ardından örnekleri, soğutulmuş termal paketlerin bulunduğu soğuk bir kutuya yerleştirin ve ileri işlemlere kadar 4 °C'de saklayın. Toprağı temizlemek için kök örneklerini suyla durulayın. Daha sonra örnekleri steril bir Petri kabına aktarın ve kök epidermisini ve korteksi temizlemek için sterilize edilmiş bir neşter kullanın.

Temiz, hav bırakmayan bir mendille bisturiyi silin. Ardından aleti %70 etanol içine batırın ve açık alev üzerinde ısı ile sterilize edin. Floemi çizmek için bisturiyi kullanın.

Numuneyi küçük parçalara bölün ve bu parçalardan 30-100 miligramı steril iki mililitrelik bir reaksiyon tüpüne paylaştırın. Numuneleri 80 °C'de saklayın veya efektör gen amplifikasyonu ve ardından efektörün yem vektörüne klonlanması için kalıp görevi görecek DNA'yı izole etmek amacıyla hemen kullanın. Enfekte ağaçlardan fitoplazma polispisifik DNA izole edildikten sonra, metin protokolüne uygun olarak yem vektörlerine klonlama yapın ve kendi kendine aktivasyon ile ekspresyon açısından test edin.

ATP 00189 efektörü ile transforme edilmiş NMY51'i taze bir SD-trp plakasına çizgi ekim yöntemiyle ekleyin ve kırmızı koloniler oluşana kadar 30 °C'de iki ila üç gün boyunca kültüre edin. Agar plaktaki bir kırmızı koloniyi, küçük bir çalkalama balonundaki 3 mL SD-trp ortamını inoküle etmek için kullanın ve kültürü 30 °C'de, dakikada 120-150 rotasyon hızında çalkalayarak gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, gece boyu büyütülen kültürden 1 mL alarak bir çalkalama balonundaki 20 mL SD-trp ortamını inoküle edin ve sekiz saat boyunca büyümesini sağlayın.

Kültürü OD600 değeri 0,2 olacak şekilde ayarlamak için SD-trp besiyeri kullanın ve kültürden on mililitre alarak, her biri 100 mililitre SD-trp besiyeri içeren iki erlene inoküle edin. Kültürleri 30 °C'de, çalkalamalı olarak gece boyunca inkübe edin. Ardından, kültürün OD600 değerini ölçün ve 120 OD600 birimini çöktürün.

Örneğin, 1,2 OD600 ölçüldüğünde, 100 mililitre örneği santrifüjleyin, süpernatantı atın ve peleti iki çalkalama balonunda yeniden süspande etmek için önceden ısıtılmış 800 mililitre 2xYPAD kullanın ve 30 santigrat derece'de inkübe edin. Maya kültürünü 30 santigrat derece'de ve dakikada 120-150 devirde inkübe edin. Metin protokolüne uygun olarak, 0,6 OD600 değerine ulaşana kadar yaklaşık her 1,5 saatte bir OD600 ölçümü yapın.

Metin protokolüne uygun olarak somon spermi DNA'sı, Lityum OAc ve PEG Lityum OAc hazırladıktan sonra, hücreleri çöktürmek için 800 mililitre maya kültürünü 700 x G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve çökelekleri toplam 200 mililitre steril çift distile su içerisinde yeniden süspande edin. Ardından hücreleri tekrar çöktürün ve süpernatantı atın.

Peleti 16 mililitre Te Lityum OAc karışımında yeniden süspande edin ve örneği tekrar santrifüjleyin. Ardından süpernatantı uzaklaştırıp, peleti yeniden süspande etmek için 9,6 mililitre Te Lityum OAc kullanın. Uygun boyutlu reaksiyon kaplarında; yedi mikrogram peak Add HAC DNA kütüphane vektörü, 100 mikrolitre %2 somon spermi DNA'sı ve 2,5 mililitre PEG Lityum OAc karışımı içeren on iki tüp hazırlayın.

Önceden hazırlanmış maya hücresi süspansiyonundan her bir tüpe 600 µL ekleyin ve bir dakika boyunca kuvvetlice karıştırın. Ardından, reaksiyonları 30 °C sıcaklıktaki bir benmari banyosunda, her 15 dakikada bir karıştırarak 45 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, her tüpe 160 µL DMSO ekleyin ve kuvvetlice karıştırın.

Ardından tüpleri 42 °C'de 20 dakika daha inkübe edin. Hücreleri çöktürdükten sonra süpernatantı atın ve her bir peleti resüspande etmek için 3 mL 2xYPAD kullanın. On iki tüpün tamamındaki hücreleri 100 mL'lik bir çalkalama balonuna birleştirin ve mayayı 30 °C'de, dakikada 120 devir hızında 90 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, hücreler peletlendikten ve süpernatan atıldıktan sonra, peleti dikkatli bir şekilde pipetleyerek tamamen yeniden süspande etmek için on mililitrelik bir serolojik pipet ve 4,5 mililitre steril %0,9 sodyum klorür kullanın. Süspansiyondan 50 µL çekin ve 1:10'dan 1:1000'e kadar on katlı dilüsyonlar hazırlamak için %0,9 sodyum klorür kullanın. Ardından, her dilüsyonun 100 µL'sini SD-trp-leu agar içeren 90 milimetrelik Petri kaplarına ekimleyin.

Seyreltilmemiş maya süspansiyonunun geri kalanını, SD-trp-leu-His-ade agarlı 16x150 milimetre çapındaki Petri kaplarına yayın. Plakaları, SD-trp-leu plakaları için üç gün, SD-trp-leu-his-ade plakaları için ise dört gün boyunca 30 degrees Celsius'ta inkübe edin. SD-trp-leu seçici plakalarındaki farklı seri dilüsyonların kolonilerini sayarak transfeksiyon verimliliğini belirleyin.

Her bir klonu, steril bir pipet ucu kullanarak koloniyi seçip taze SD-trp-leu-his-ade selektif plaklara ekerek aktarın. Plakları 30 degrees Celsius'de 24 saat boyunca inkübe edin. Toplam beş pasaja ulaşana kadar klon aktarımını her gün tekrarlayın.

Klonları analiz etmek için, steril bir kabin altında, her bir klon için 1 mL SD-trp-leu-his-ade içeren steril iki mililitrelik bir reaksiyon tüpü hazırlayın. Her tüpe sıcak bir iğne ile delik açın ve deliği kapatmak için gaz geçirgen bir kapatıcı kullanın. Her bir tüle tek bir klona ait taze koloni materyali inoküle edin ve tüpleri 30 °C'de, dakikada 150 rotasyonla 24 saat boyunca inkübe edin.

Hücreleri pelletledikten ve süpernatanı attıktan sonra, pellet uygun tampon içerisinde yeniden süspande edin ve taze iki mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın. Süspansiyona 100 mikrolitre asitle yıkanmış cam boncuk ekleyin ve tüpü beş dakika boyunca kuvvetle karıştırın. Son olarak, plazmid DNA'yı metin protokolüne göre saflaştırın.

Kendi kendine aktivasyon deneyi için beklenen sonuçların özeti ve bunların yorumu bu tablo ve şekilde sunulmuştur. Zayıf kendi kendine aktivasyon, trp-leu-his eksikliğindeki seçici plakalarda büyümeye yol açar, ancak trp-leu-his-ade eksikliğindeki plakalarda büyüme gerçekleşmez. Güçlü kendi kendine aktive olan bir yem ile transforme edilmiş mayalar ise trp-leu-his-ade içermeyen besiyerinde büyüyecektir.

Yem ve av proteinlerinin başarılı bir kotransformasyonu, trp ve leu içermeyen seçici plaklarda büyüme ile karakterize edilir. Yem ve av proteininin etkileşimi, NMY51'in his ve ade oksitrofisinin komplemanter hale gelmesine yol açar. Burada, bir Maya 2 Hibrit Deneyi'ndeki yem ve av arasındaki etkileşime dair bir örnek gösterilmektedir. Malus domestica konak etkileşim partnerleri MdTCP24 ve MdTCP25 tanımlanmış ve etkileşim, efektör ile denovo kon transformasyonu ile doğrulanmıştır.

Gerekli tüm ekipman ve materyaller, özellikle de maya, önceden uygun şekilde hazırlandığında, maya iki hibrit yöntemi uzmanlaşıldıktan sonra tek bir günde gerçekleştirilebilir. Bu prosedür uygulanırken kontaminasyondan kaçınmak ve her zaman steril koşullar altında çalışmak önemlidir. Bu prosedürün ardından, saptanan protein-protein etkileşimlerini doğrulamak için örneğin bimoleküler floresan komplementasyonu gibi başka bir bağımsız yöntem uygulanmalıdır.

Maya veya hibritin kendisi nispeten yanlış pozitif sonuçlar üretmeye eğilimli olduğu için bu durum özellikle önemlidir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, birçok farklı araştırma alanındaki araştırmacıların, özellikle konakçı-patojen etkileşimlerinde olmak üzere protein-protein etkileşimlerini içeren moleküler prensipleri ve diğer birçok biyolojik araştırma alanını daha iyi anlamalarına önayak olmuştur. Ayrıca, bu yöntemin uygulanmasının yeterli donanıma sahip herhangi bir moleküler biyoloji laboratuvarında kolayca gerçekleştirilebilir olduğunu anlayacaksınız.

Belirli kimyasallar, bisturiler ve açık alevlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu nedenle, bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman belirli önlemleri göz önünde bulundurmalısınız. Bu, eldiven ve koruyucu gözlük gibi kişisel koruyucu donanımlarınızı ve genel laboratuvar güvenlik ekipmanlarını kullanmanız gerektiği anlamına gelir.