Name: Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Keşfedin maya iki hibrid tarama yöntemiyle bakteriyel efektör proteinlerinin Malus domestica ile etkileşimlerini. Bu protokol bitki patojenliği ve enfeksiyon mekanizmalarını anlamak için sağlam bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz yazının redaksiyon için teknik destek için Dualsystems Biotech AG ve Julia Strobl gelen Laimburg Araştırma Merkezi ve Mirelle Borges Dias Schnetzer Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl Margot Raffeiner ve Florian Senoner teşekkür ederiz. Bu çalışma APPL2.0 projesinin bir parçası olarak gerçekleştirildi ve kısmen Bozen / Bolzano, İtalya Özerk İli ve Güney Tirol Apple Konsorsiyumu tarafından finanse edildi.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Y2H ekranında potansiyel efektör protein, farklı hipotetik etkileşen proteinlerin (basamak 7) benzer olan eksprese eş. Her büyüyen maya klonu yem ama (potansiyel olarak) farklı interaktör içerir. etkileşen proteinler av plazmid içine klonlanır bir cDNA kütüphanesinden kodlanır. yem ve av, bir maya transkripsiyon faktörünün bir kısmını, her eş-cistronically kodu plazmidler. yem (efektör) ve av plasmidle kodlanmış uygulayıcının arasında fiziksel bir etkileşim halinde, iki transkripsiyon faktör parçaları (DNA bağlama domeni ve aktivasyon alanı) birleşirler ve raportör gen ekspresyonu indüklenir. maya histidine- ve adenin tükenmiş SD seçimi plakalar üzerinde büyümek mümkün. av cDNA kütüphanesinin tür filtrelenmiş efektör bağlıdır ve buna göre seçilmelidir. av ve yem vektörü olarak maya suşu, uyumlu olmalıdır. Bu ekranda, bir LexA DNA etki alanı ve Gal4 aktivasyon Domai bağlayıcın uyumludur, Maya transkripsiyon faktörü birimler olarak kullanılmıştır. cDNA kütüphanesi tek tek özel elde ticari olarak yapılan ya da inşa edilebilir. cDNA av kütüphanenin hazırlanması Bu protokolün bir parçası değildir. Bu protokol, Malus domestica X yaprakların RNA&#39;dan İnşası normalleştirilmiş cDNA kütüphanesi kullanıldı ve pGAD-HA 41 içine klonlandı. Maya suşu -expressing efektör (yem) av kütüphanesi ile transforme edildi ve klonlar histidine- ve adenin tükenmiş SD seçme plakaları üzerinde seçilir. Maya kolonilerden plazmid DNA elde etmek için, bakteriler için bir sütun-bazlı DNA plazmid mini kiti maya hücrelerinin yok (adım 8) geliştirmek için, cam boncuklar kullanılarak bir mekanik aksama aşama ile birlikte tavsiye edilmektedir. Bu plazmid saflaştırma olarak, yem ve av vektörü nispeten düşük konsantrasyonlarda eş zamanlı olarak saflaştırılabilir olacaktır. Bununla birlikte, plasmid DNA miktarı dizi wit ile etkileşimi ortak tanımlamak için yeterlidirhout önce plazmid yayılma (adım 8.4). Bir alternatif olarak, adım 8.4 içinde saflaştırılmış DNA kompetan E. coli &#39;ye transforme edilebilir (ör pGAD-HA halinde ampisilin) av vektör aracılı antibiyotik direnci seçilebilir. Seçilen E. koloniler yalnızca pGAD-HA Kitaplık plasmidi taşıyan coli ve yüksek verimli plazmid saflaştırma, bu klonlar ile gerçekleştirilebilir. pLexA N ve pGAD-HA konstruktlarının başarılı dönüşüm NMY51 triptofan ve lösin oksotrofi tamamlar. efektör ve bir proteini (pGAD-HA kodlanmış) arasında bir etkileşim NMY51 suşları raportör sistemin aktivasyonuna yol açar. kendi kendine aktivasyon durumunda, NMY51 bağlı NMY51 raportör sistemi istenmeyen aktivasyonuna pGAD-HA Trp-Leu-His-ade eksik seçici plakalar üzerinde yetişen boş kütüphanesinin vektör ile kombinasyon halinde pLexA-N eksprese efektör ile transforme 40. kendi kendine aktivasyon W olabilirEAK ve yokluğunda oluşabilecek Trp-Leu-His ya da etkinleştirme güçlü ve Trp-Leu-His-ade plakalar 41 büyüme ile karakterize edilebilir. Kendinden aktivasyon gerçek Y2H ekranında yanlış pozitif klonların büyük bir arka plan neden olabilir. Bunu önlemek için, yem ile kendi kendine aktivasyon testi olan efektör-eksprese eden vektör ko-transforme edilmiş boş kütüphanesinin vektörü ile, yapılmalıdır. Bu deneysel ortamda, raportör gen sentezleme neden olmamalıdır. Kendi kendine aktivasyon (yani, seçici plakalar üzerine büyüme) test görülebiliyorsa, ortam 3-amino-1,2,4-triazol 45 (3-AT) farklı konsantrasyonları ile desteklenebilir. 3-AT imidazoleglycerol fosfat dehidrataz (HIS3), histidin biyosentezi 46 boyunca önemli bir enzim olan bir inhibitördür. 3-AT ile takviyesi, Y2H ekranlarında 47 sırasında kendini aktivasyonu zayıf etkilerini azaltabilir48. 3-AT farklı konsantrasyonları test edilmelidir. Bu protokol, 1-40 mM 3-kullanılmıştır. kendi kendine aktivasyon baskıya neden en düşük konsantrasyon, daha sonra Y2H ekranında kullanılmalıdır. ko-transformasyon, SD-Trp-Leu plakalar klon yeterli sayıda içeren self-aktivasyon tahlili seçici plakalar sadece değerlendirilebilir. bir gösterge ≥ olarak 90 mm (çap) bir petri 500 koloni yeterlidir. Tam transfeksiyon etkinliğini belirlemek için, ko-transforme edilmiş maya seri dilüsyonları hazırlamak ve SD-Trp-Leu plakaları üzerine yayılır önerilir. Kendi kendine aktivasyonunu önlemek için, efektör pLexA-C, proteinin C-ucuna LexA etiketi sigortalar bir yem sentezleme vektörü içine klonlanabilir. Lex-A etiketinin oryantasyon kendini aktivasyonunu 24 azaltabilir. Bununla birlikte, her durumda azaltılması ya da kendi kendine aktivasyonunu ortadan kaldırmak mümkün değildir. oluşumukırmızı veya kırmızımsı koloniler zayıf ya da yanlış pozitif etkileşim gösterir. Bu, bir protein-protein etkileşimi için söz konusu olduğunda NMY51 bölgesinin ade2 raportör gen sadece aktif olan bir dönüş blokları bu maya kökü 40 kırmızı boya birikimi. Güçlü inter aktörlerin taşıyan klonlar beyazdı sırasında başka bir etkileşim olmaması durumunda, NMY51, kırmızımsı. Seçim plakalar üzerinde koloni renginin gözlem ve böylece söz konusu koloniler true-ya da yanlış pozitif interaktörler olup olmadığını yargılamak başka bir önemli ipucu sağlar. Uyum ya da yem niteliği ve etkileşim özellikleri açısından belirli tahlil ayarlarını değiştirmek için sonunda gereklidir. Artık, iyileştirmeler ve ortak Y2H türev bir dizi teknik, farklı ev sahibi sistemlerinde oldukça zor protein etkileşimleri analiz için kurulmuştur. Stynen ve arkadaşları tarafından bir inceleme. 49 adreslerind Y2H, onun iyileştirmeler ve uyarlamalar farklı yönlerini açıklar ve böylece uygun etkileşim deneyi nasıl seçileceği hakkında yararlı bilgiler sağlar. Y2H ekranlar ve türetilmiş teknikleri yaygın ikili protein etkileşimleri belirlenmesi gerekli olduğu her yerde farklı araştırma alanlarında, kullanılır hale gelmiştir. Kritik kontrolleri, yem kendi kendine aktivasyon testi ve tespit etkileşen proteinlerin bire bir tekrar dönüşüm olarak gerçekleştirilse bile, Y2H yanlış sonuçlar 26, 50, 51 oluşturmak için müsaittir. bir model olarak maya tüm etkileşim çalışmaları için uygun değildir. Maya mutlaka her protein 24 için uygun post-translasyonel modifikasyonu ve katlama destekleyen bir hücresel ortam teşkil etmez. Ayrıca, Y2H ortamda proteinler aşırı ifade edilir ve ifade kontrol değildirdoğal promoter tarafından yol açtı. Y2H mutlaka doğal hücre içi hedef değil çekirdeği, proteinli etkileşim ortakları zorlar. etkileşim yerli hücresel koşullar dolayısıyla maya tarafından yansıtılması değil ve-yanlış negatif ya da yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir. En Y2H seçici bir madde olarak maya oksotrofi tamamlama dayanmaktadır. Bu besin seçimi yüksek hassasiyet ile karakterize, ancak diğer karşılaştırıldığında azalmış seçicilik pahasına (örneğin, kromojenik raportör) 49 deneyleri edilir. Azaltılamaz kendine aktivasyon (yukarıya bakınız) veya başka sınırlamalar belirli efektör için oluşursa, Y2H uygun bir deney, 25 değildir. Tablo 1 ve Şekil 1 &#39;de, kendi kendine aktivasyon testinde beklenen sonuçlar verilmiştir. Gerçek etkileşimler (yani, yanlış negatif) yokluğu protein zehirlenmesi, yanlış çeviri proteini neden olabiliretkileşim 24 için gerekli işleme, etkileşim sterik engel, av kütüphanede az temsil edilen etkileşim ortakları, yem membran lokalizasyonu, ya da eksik parçalar. Bu de novo önerilir pGAD-HA alt-klonlanmıştır, cDNA&#39;dan tanımlanır etkileşim proteininin tam uzunlukta genini çoğaltmak ve üretilen pGAD-HA içine inşa dönüştürerek bire bir etkileşim deneyi gerçekleştirmek yem eksprese NMY51 süzün. av kitaplığında gözlenen uygulayıcı sadece daha büyük bir proteinin bir parçası olabilir, çünkü bu gereklidir. Ancak, ilgili tam uzunlukta geni için bilgi önemli genomik ve transkriptomik dizi verileri mevcut ise sadece erişilebilir. Burada tarif edilen kendi kendine aktivasyon deneyi için transformasyon protokolü, bire-bir tahlil için uygulanabilir ve yem ve uygulayıcının arasındaki etkileşim tekrar üretilebilir olmalıdır. <p cleşek = &quot;jove_content&quot;&gt; bir Y2H ekranında tanımlanan etkileşimler her zaman başka bir bağımsız tekniği ile teyit edilmesi gerekir. Bu bağımsız bir teknik, gerçek protein-protein etkileşimi, doğal ortamda daha yakın olması gerekir. Phytoplasmal efektör ATP_00189 durumunda, Malus domestica X TCP transkripsiyon faktörleri ile etkileşimi, Nicotiana benthamiana bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) ile planta doğrulanmıştır 28 (bu protokol parçası değil) protoplastlannda. efektör protein ATP_00189 bitki patojeni P. mali&#39;nin türetilmiştir. Planta BiFC böylece Malus x domestica transkripsiyon faktörleri ile ATP_00189 etkileşimlerini doğrulamak için seçildi Daha önce Y2H 28 tespit edilmiştir. BiFC raportör sistemi &lt;etkinleştirmek için çekirdeğe etkileşen proteinlerin hücre içi translokasyon gerektirmeyen bir protein-protein etkileşimi deneyidirsup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Ayrıca, içinde planta ifadesi ve modifikasyon makine taklit onun bitki konak bitki bakteriyel efektör arasındaki doğal etkileşim ortamı. Bununla birlikte, BIFC kullanarak küresel ekran mümkün değildir. dikkatle ele alınması gereken protokol çeşitli adımlar vardır. Çevrede (basamak 4) geni amplifiye, primerler, bitki DNA&#39;ya bağlanan ekarte etmek önemlidir. Bu nedenle, enfekte olmayan bitkilerden DNA, bir negatif kontrol olarak dahil edilmesi gerekir. ilgi konusu genin dizisinin ucun doğrudan klonlanması için kullanılan, EcoRI ve SalI kısıtlama alanları içermemelidir. dizisi bu siteleri içeren olursa, klonlama için farklı sınırlama enzimleri seçilmelidir. Maya dönüşüm Bu protokol sırasında merkezi bir yöntemdir. Transfeksiyon verimi maya hücrelerinin yetkinlik, bunların canlılığı, büyümesi durumu ve transfeksiyon Reaktifler kalitesine bağlıdırent 53, 54. Önerilen protokolü için, son derece dönüşümleri yaparken (4 ° C&#39;de muhafaza) iki hafta daha eski olmayan yeni plakalardan mayayı kullanılması tavsiye edilir. Seçici sıvı kültürler bir agar plakalarından koloniler ile aşılanır, çoğu zaman, dönüştürülmüş maya büyümesi geciktirilir. Plaka doğrudan mayayı kullanmak gerçek deneyler için bir aşı gibi bir sıvı starter kültür kullanımı ve de yararlıdır. Düşük verimlilik, belirli av proteinleri (potansiyel interaktörler) underrepresentation yol açabilir yem-ifade mayaya av transfecting ve böylece bütün ekranı çarpık zaman. Bu protokolde, Y2H içinde ~ 150,000 cfu / ug transfekte DNA maya transfeksiyon verimliliği iyi çalıştı. Y2H tekniğinin kusurları ve dezavantajları bilmek ve eleştirel ve uygun bir şekilde sonuçları yorumlama Corr çizim için vazgeçilmezdirEKT sonuçlar. Y2H deneyleri ve türevleri yıllardır kullanılmaktadır ve farklı yem özelliklerine göre birçok yenilik ve uyarlamalar geçirmiş, etkileşim hücre içi lokalizasyonu, etkileşim için gerekli olabilecek beklenen bağlama partnerleri ve diğer faktörler (bkz Y3H 55, 56, 57). Son zamanlarda, bir dizi-bazlı Y2H ekranları ile av 58 milyonlarca karşı çok sayıda yemler otomatik yüksek verimli analizlere imkan vermek geliştirilmiştir. geleceği muhtemelen farklı araştırma alanlarda karmaşık sinyal yollarının ve interactomes açıklanması için izin vermek için bu deneyde otomasyon ve yüksek verimli yaklaşımları yer alır.

<html> Bira mayası iki-hibrid ekranlar (Y2H), 11 yaklaşık 27 yıl önce 1 geliştirilmiş ve yaygın olarak özel protein-protein etkileşimlerini 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 belirlemek için çeşitli alanlarda kullanılmaktadır zamandan beri edildi . bir konakçı hedef proteine ​​bakteriyel efektör fiziksel etkileşim genellikle, bu hedef proteinin fonksiyonel manipülasyonu için bir ön koşuldur. Bu etkileşimler analiz enfeksiyon biyoloji 12, 13, 14, 15, birçok farklı sektörlerin odak taşındı,&quot;16, 17, 18. Y2H ekran ilkesi iki proteinin etkileşim haberci genlerin ekspresyonunu tahrik eden bir fonksiyonel bir transkripsiyon faktörünün sulandırıldıktan neden olmasıdır. Bilinmektedir efektör (&gt;&quot; yem &quot;) translasyon birleştirilir DNA bağlama sahası transkripsiyon faktörünün (DBD), ve potansiyel etkileşim mümkün ( &quot;av&quot;) karşılıklı etkileşim eşleri, potansiyel bir kütüphane bilinmediği için., ilgili transkripsiyon faktörünün aktivasyon alanı (AD) kaynaştırılmış oldukları Uygulayıcılar sözde klonlanır &quot;av-kütüphane&quot;. Normal olarak, bu kütüphane yapılır DBD kodlanmış yem vektör ile uyumlu AD kodlayan uygun bir av vektörü ifade plazması içine cDNA&#39;ları klonlanmasıyla. etkileşim halinde, yeniden transkripsiyon faktörleri genellikle maya büyümesi seçilmesine olanak tanır haberci genlerin ekspresyonunu indükler.interactors tanımlama plazmid özgü primerler ile bir av plasmidi dizilenmesi ile elde edilir. Bakteriler işlemek ve ev sahibinin metabolizmasını istismar veya savunma mekanizmalarını kaçmasına ve farklı bakteri salgı sistemlerinin 19, 20, 21 üzerinden efektör molekülleri salgılaması için çeşitli stratejiler geliştirmiştir. Bu bakteri etkileyiciler bağlayıcı partnerleri belirlenmesi ve böylece ev sahibi manipüle yolu belirlemede ilk adımdır. Bu özel patojenite mekanizmaları daha iyi anlaşılması yol açar. Y2H ekranlar phytoplasmoses sırasında bakteriyel efektör etkileşimlerini tespit etmek için gerçekleştirilir ve genellikle, Y2H fitoplazmalar Research 22, 23 moleküler patojenite mekanizmaların daha fazla karakterizasyon için çok önemli bir başlangıç deneydir. Bununla birlikte, bir araya geldiEn yayınlarda hod açıklama oldukça azdır ve bu teknikler genellikle biyoteknoloji şirketleri için yaptırılmaktadır. Bu yöntemin fizibilite dikkat çekmek için, bu protokol doğal konakta bakteriyel efektör molekülünün etkileşim ortakları belirlemek için adım-adım bilgi sağlar. Geniş kullanım ve Y2H ekranlarının hızlı ileri yaklaşıma rağmen, belli etkileşimler maya sistemde meydana olmayabilir unutmamak gerekir. Bu maya hücresi, belirli bir biyolojik sınırlamalar ile &quot;in vivo Reaksiyon kabı&quot; bir tür olarak kullanılması gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Birçok yazar avantajları ve Y2H ve türevleri 11, 24, 25, 26, 27 dezavantajları ele alınmıştır. Genel hususlar maya hücresi, uygun temin olmayabilir, örneğin, şunlardırGen ifadesi, (post) translasyonel veya ilgili proteinlerin translocational koşullar çalışılmaktadır. Bu ekranda yalancı negatif sonuçlara yol açabilir. Olumlu etkileşimler da eserler olabilir ve (uygun bir konak içinde efektör durumunda, örneğin), doğal durumda ortaya olmayabilir. Bir daha yakından ilişkili biyolojik sistemde bağımsız bir etkileşim testi ile heterolog maya ifade sisteminden etkileşimi onaylamak için böylece vazgeçilmezdir. Bu çalışmada, sigara tarıma bitki patojeni mali Candidatus fitoplazmalar (S. Mali) efektör ATP_00189 bağlayıcı partnerleri tespit edilmiştir. Sonuçlar elma çoğalması 28, Avrupa&#39;da 29 etkilenen elma büyüyen bölgelerde yüksek ekonomik kayıplara neden olan bir hastalık belirtisi gelişimine neden olan moleküler mekanizmalar önemli bir anlayış sağlamak.

<table><tbody><tr><td>Setiltrimetilamonyum bromür (CTAB)</td><td>DNA hazırlığı için</td> <td>aplikit</td><td>A6284</td></tr><tr><td>Trishidroksimetilaminometan (Tris)</td><td>Ortam ve tampon için</td><td>A2264</td> <td>Applichem</td> A2264</tr><tr><td>Ortam ve tampon için</td><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Applichem</td><td>A2942</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit Disodyum tuzu (NaEDTA)</td>Ortam ve tampon için <td>aplican</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>DNA hazırlığı için</td> <td>N-Lauroylsarcosin sodyum tuzu</td><td>Applichem</td><td>A7402</td></tr><tr><td>amonyum asetat ve nbsp;</td><td>DNA hazırlığı için</td> <td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>9688</td></tr><tr>DNA <td>hazırlığı için</td><td>2-merkaptoetanol</td><td>Applichem</td><td>A1108</td></tr><tr>DNA <td>hazırlığı için</td><td>İzopropanol (2-Propanol)</td><td>Applichem</td><td>A3928</td></tr><tr><td>DNA</td> hazırlığı için Etanol <td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>51976</td><td>DNA hazırlığı</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>için RNAse Applichem A2760Kloroform: DNA hazırlama için İzoamil 24: 1</td><td>Applichem</td><td>A1935</td><td></td></tr><tr><td>Düzeltme Polimeraz (örn. iProof)</td><td>PCR için</td> <td>Bio-Rad</td><td>203433</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0271</td><td>klonlama için</td></tr><tr><td>SalI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0641</td><td>Klonlama için</td></tr><tr><td>Sütun Tabanlı DNA Saflaştırma Kiti (örn. QIAquick)</td><td>Klonlama için</td> <td>Qiagen</td><td>28104</td></tr><tr><td>Kanamisin Sülfat</td><td>Uygulaması için</td><td>A1493</td>, <td>mikrobiyolojik seçim için</td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-Triazol (3-AT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td>, <td>A8056</td>, <td>kendi kendine aktivasyon testi için</td></tr>, <tr><td>L-Arginin Monohidroklorür ve nbsp;</td><td>Maya kültürü için</td> <td>Applichem</td><td>A3680</td></tr><tr><td>L-İzolösin&nbsp;</td><td>Maya kültürü için</td> <td>Applichem</td><td>A3642</td></tr><tr><td>L-lizin Monohidrat&nbsp;</td><td>Maya kültürü için</td> <td>Applichem</td><td>A3448</td></tr><tr><td>L-Metionin&nbsp;</td><td>Maya kültürü için</td> <td>Applichem</td><td>A3897</td></tr><tr><td>L-Fenilalanin & nbsp;</td><td>Maya kültürü için</td> <td>Applichem</td><td>A3464</td></tr><tr><td>L-Treonin&nbsp;</td><td>Maya kültürü için</td> <td>Applichem</td><td>A3946</td></tr><tr><td>L-Tirozin&nbsp;</td><td>Maya kültürü için</td> <td>Applichem</td><td>A3401</td></tr><tr><td>L-Urracile</td><td>Maya kültürü için</td><td>Applichem</td><td>A0667</td></tr><tr><td>L-Valin&nbsp;</td><td>Maya kültürü için</td> <td>Applichem</td><td>A3406</td></tr><tr><td>L-Adenin Hemisülfat Tuzu&nbsp;</td><td>Maya kültürü 0.22</td>ve mikro için <td>Applichem</td><td>A1596</td></tr><tr><td>; m Gözenek Filtresi</td>: <td>Steril filtrasyon için</td><td>Sartorius</td><td>16541</td></tr>, <tr><td>L-Histidin Monohidroklorür</td>, <td>Maya kültürü için</td><td>Applichem</td><td>A3719</td></tr>, <tr><td>L-Lösin&nbsp;</td><td>Maya kültürü için</td> <td>Applichem</td><td>A3496</td></tr><tr><td>L-Triptofan&nbsp;</td><td>Maya kültürü için</td> <td>Applichem</td><td>A3410</td></tr><tr><td>Maya Azot Bazı&nbsp;</td><td>Maya kültürü için</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>51483</td></tr><tr><td>D-Glikoz Monohidrat&nbsp;</td><td>Maya kültürü için</td> <td>Applichem</td><td>A1349</td></tr><tr><td>Maya ve bakteri kültürü için</td><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-1</td></tr><tr><td>Maya kültürü için</td><td>Pepton</td><td>Applichem</td><td>A2208</td></tr><tr><td>Polietilen Glikol 4000 (PEG)</td><td>Maya dönüşümü için</td> <td>Applichem</td><td>A1249</td></tr><tr><td>Lityum Asetat Dihidrat (LiOAc)</td>Maya dönüşümü için <td>Applichem</td><td>A3478</td><td></td></tr><tr><td>Somon Sperm DNA'sı&nbsp;</td><td>Maya dönüşümü için</td> <td>Applichem</td><td>A2159</td></tr><tr><td>Lex-A etiketine karşı antikor (örn. Anti-LexA DNA bağlanma bölgesi)</td><td>Western blot</td>için <td>Millipore</td><td>06-719</td></tr><tr><td>Plazmid Miniprep kiti (örn. GenElute Plazmid Miniprep Kiti)</td><td>Maya ve bakterilerden plazmit saflaştırması için</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>PLN350</td></tr><tr><td>Asitle Yıkanmış Cam Boncuklar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Mayadan plazmid saflaştırması için</td> <td>G8772</td></tr><tr><td>Mikrobiyolojik seçim için</td><td>Ampisilin Sodyum Tuzu</td><td>Uygulaması</td><td>A0839</td></tr><tr><td>Maya kültürü için</td><td>Maya Özü</td><td>Uygulaması</td><td>A1552</td></tr><tr><td>Vakum yoğunlaştırıcı santrifüj (örn. Yoğunlaştırıcı 5301)</td><td>DNA hazırlama için</td> <td>Eppendorf</td><td>Z368245 (Sigma)</td></tr> <tr><td>Yem vektörü (örn. pLexA-N)</td><td>Y2H</td>için <td>Dualsystems</td><td>P01004</td></tr><tr><td>Av vektörü (örn. pGAD-HA)</td><td>Y2H</td>için <td>Dualsystems</td><td>P01004</td></tr><tr><td>Av vektörünü kontrol edin (örn pLexA-p53)</td><td>Y2H için</td> <td>Dualsystems</td><td>P01004</td></tr><tr><td>Kontrol yem vektörü (örn. pACT-largeT)</td><td></td><td>Y2H</td><td></td></tr> <tr><td>için Dualsystems P01004Elektroyetkin E. coli (örn. MegaX DH10B T1R Electrocomp Hücreleri)</td><td>Klonlama için</td> <td>invitrojen</td><td>C640003</td></tr><tr><td>Maya raportör suşu (NMY51: MATahis3 & Delta; 200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, örn. NMY51)</td><td>Y2H</td>için <td>Dualsystems</td><td>P01004</td></tr><tr><td>Plastik parafin filmi (örn Maya</td> <td>ve bakteri kültürü için</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td></tr><tr><td>Gaz geçirgen kapatıcı (örn. BREATHseal)</td><td>Greiner</td><td>676 051</td> maya <td>kültürü için</td></tr><tr><td>PCR Döngüleyici (örn. T100 Termal Döngüleyici)</td><td></td><td>PCR</td>kantitatif PCR Döngüleyici için <td>Bio-Rad</td> 1861096</tr><tr><td>(örn. CFX96 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi)</td><td>Kantitatif PCR</td><td>Mikrosantrifüj</td> için <td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>1855195 (örn Santrifüj 5417 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>genel laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Santrifüj (örn. Santrifüj 5804 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>genel laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su (DNAse-free, RNAse-free, Proteaz-free)</td><td>5PCR</td><td>ve DNA çalışmaları için</td>Prime <td>2500010</td></tr><tr>DNA <td>hazırlama için</td><td>Scalpell</td><td>Swann-Morton</td><td>0301</td></tr><tr><td>Steril filtre (0.22 & mikro; m; Polietersülfon)</td><td>VWR-International</td><td>514-0073 (Avrupa Katalog numarası)</td><td>maya ve bakteri kültürü için</td></tr><tr><td>Petri kapları & Oslash; 90 mm&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td>maya ve bakteri kültürü için</td></tr><tr><td>Petri kapları & Oslash; 150 mm&nbsp;</td><td>Maya kültürü için</td> <td>Greiner Bio-One</td><td>639161</td></tr><tr><td>Fotometre (örn. Biyofotometre)</td>Maya <td>kültürü için</td> <td>Eppendorf</td><td>550507804</td></tr><tr><td>Fotometre Küvetleri</td><td>Maya kültürü için</td><td>Marka</td><td>759015</td></tr><tr><td>Su Banyosu (örn. Su Banyosu Memmert WB7)</td><td>Maya dönüşümü için</td> <td>Memmert</td><td>WB7</td></tr><tr><td>Western Blot Ekipmanları</td><td>Protein tespiti için</td> <td>Bio-Rad</td><td>çeşitli</td></tr><tr><td>dNTP'ler</td><td>Shaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Erlenmeyer) Şişeleri (100 mL; 1.000 mL; 2.000 mL) ve nefes alabilen pamuk tıkaçları (örn. Duran Erlenmeyer dar boyunlu şişeler)</td> klonlamak için 5Prime 2201210 <td>Sigma Aldrich</td><td>Z232793 Z232858,</td> maya <td>ve bakteri kültürü için</td>Z232866</tr><tr><td>(örn. GFL 3031)</td><td>GFL</td><td>Maya ve bakteri kültürü için</td> <td>3031</td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Bağlayıcı</td><td>KB 53 (E3.1)</td><td>maya ve bakteri kültürü için</td></tr><tr><td>Buz Yapıcı (örn. Buz Yapıcı IF 825)</td><td>Omniwash</td><td>IF 825</td><td>genel laboratuvar ekipmanı</td></tr><tr><td>0,2 mL, 1,5 mL ve 2,0 mL Reaksiyon Şişeleri (Polipropilen)</td><td>Eppendorf</td><td>0030.124.332 (0,2 ml); 0030.123.328 (1,5 ml); 0030.123.344 (2,0 ml)</td><td>Genel Laboratuvar Ekipmanları</td></tr><tr><td>Pipetler ve tek kullanımlık pipet Uçları (farklı hacim: 10 - 1.000 &mikro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>çeşitli</td><td>genel laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Yayıcı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SPR-L-S01</td> maya <td>ve bakteri kültürü için</td></tr><tr><td>Vorteks çalkalayıcı (örn MS 3 Minishaker)</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>genel laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>T4-Ligase</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0011</td><td>klonlama için</td></tr><tr><td>Buzdolabı (4 > C) (örn. Liebherr Medline FKEX 5000)</td><td>Liebherr</td><td>81.767.580.4</td><td>genel laboratuvar ekipmanı</td></tr><tr><td>Dondurucu (-20 derece; C) (örn. Liebherr Comfort Professional G5216)</td><td>Liebherr</td><td>G5216</td><td>genel laboratuvar ekipmanı</td></tr><tr><td>Dereceli Silindir (örn. Marka)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z327352; Z327417; Z327441&nbsp; &nbsp;</td><td>Genel Laboratuvar Ekipmanları</td></tr><tr><td>Serolojik Pipetler (örn. Fisherbrand)</td>Maya <td>ve bakteri kültürü için</td> <td>Thermo Fisher</td><td>S55701</td></tr><tr><td>Mekanik Pipetleyici (örn. Pipetboy acu 2)</td><td>Integra-Biosciences</td><td>155000</td><td>genel laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Elektroporasyon için Küvetler (1 mm)</td>Bakteri <td>dönüşümü</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>için Moleküler Biyo Ürünler 5510-11Elektroporatör (örn. Eporator)</td><td>Bakteri dönüşümü için</td> <td>Eppendorf</td><td>4309000019</td></tr><tr><td>Jel ve Blot görüntüleme sistemi (örn. ChemiDoc MP Sistemi)</td><td>Bio-Rad</td><td>1708280</td><td>genel laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Konik santrifüj tüpleri (Polipropilen) (50 mL)</td><td>VWR-International&nbsp;</td><td>525-0403 (Avrupa Katalog numarası)</td><td>genel laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Konik santrifüj tüpleri (Polipropilen) (13 mL)</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>genel laboratuvar ekipmanları</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT; 1 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>P2325</td><td>ligasyon için</td></tr><tr><td>adenozin trifosfat (ATP, örn. ATP Çözeltisi (10 mM))</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM8110G (Thermo Scientific tarafından dağıtılan)</td> <td>ligasyon için</td></tr><tr><td>histidin, lösin, triptofan ve adenin içermeyen bırakma karışımı (DO, örn. Maya Sentetik Bırakma Ortamı Takviyeleri)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2021 Sigma&nbsp;</td><td>Maya kültürü için (hazır karışım)</td></tr></tbody></table>

bir maya İki hibrid ekran kullanarak olmayan ekilebilir bitki patojen bir bakteriyel efektör fonksiyonu aydınlatmak

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Hastalık belirtileri moleküler mekanizmalarını aydınlatmak bitki bilimi patolojileri ve semptom gelişimini anlamak önemlidir. Bakteriler kendi çıkarları için ev sahibi metabolizmasını işlemek için farklı stratejiler geliştirmişlerdir. Bu bakteri manipülasyon sıklıkla şiddetli semptom gelişimi veya etkilenen bitkilerin ölümü ile birleştirilir. konak manipülasyon sorumlu özel bakteriyel molekülleri belirlenmesi mikrobiyolojik araştırmalarda önemli bir alan haline gelmiştir. adı bu bakteriyel moleküllerin tespit edilmesinden sonra &quot;efektörleri,&quot; kendi fonksiyonu ortaya çıkarmak için önemlidir. Basit bir yaklaşım, bir efektör işlevi, bir maya iki-hibrid (Y2H) ekran ile doğal konukçuda da proteinli bağlanma ortağı tespit etmek belirlemek için. Normalde ev sahibi siliko algoritma herhangi biri tarafından yeterince tahmin edilemez çok sayıda potansiyel bağlanma ortakları barındırır. Nedenle perfo için en iyi seçimdirifade konak proteinlerin bir bütün kütüphane karşı varsayımsal efektör içeren bir ekran rm. etkeni phytoplasma gibi İşlenen ise özellikle zordur. Bu protokol phytoplasma enfekte odunsu konukçu bitki, potansiyel efektör yükseltilmesi ve Y2H ekrana sahip tesisin moleküler etkileşim ortağı sonraki kimlik DNA saflaştırılması için adım adım yönergeler sağlar. Y2H ekranlar yaygın olarak kullanılan olsa bile, bir ücret karşılığında Y2H hizmeti sunan biyoteknoloji şirketleri bu tekniği fason bir eğilim vardır. Bu protokol, standart laboratuvar teknikleri kullanarak herhangi bir terbiyeli donanımlı moleküler biyoloji laboratuarında bir Y2H gerçekleştirmek ilişkin yönergeler sağlar.

Gerçek Y2H ekranı uygulanmadan önce yem kendi kendine aktivasyonu için test edilmelidir. Bu, boş bir av kütüphane vektörü ile birlikte yem ekspresyon vektörü dönüştürme ve seçici plakalar üzerine büyüme kontrol ederek elde edilir. Bölüm 5. yem plazmid gezimi tamamlayan ve av S. cerevisiae NMY51 40 ley oksotrofinin plazmid açıklandığı gibi phytoplasmal protein ATP_00189 kendini aktive edici olup olmadığını analiz etmek için, kendi kendine aktivasyon testi yapıldı. Başarılı bir ko-transformasyon, böylece Trp ve Leu yoksun seçici plakalar üzerine büyümesiyle karakterize edilir. yem ve av protein etkileşimi NMY51 ve onun ve ade oksotrofinin bir tamamlama yol açar. etkileşim yokluğunda yem ile kendini etkinleştirme belirirse, maya, onun ve ade eksik seçici plakalar üzerinde yetişir. Güçlü ve zayıf özAktivasyon oluşabilir. yem güçlü kendi kendine aktivasyon Trp-Leu-His-ADE tükenmiş seçme plakaları üzerinde eş-dönüştürülmüş maya büyümesi ile karakterize edilir. Zayıf kendilik aktivasyonu üzerinde büyümesine yol açar trp-leu-onun değil trp-leu-onun-ade tükenmiş seçim plakalar üzerinde. Uygun pozitif kontroller kendine aktivasyon tahlilinin sonuçlarını yorumlamak için vazgeçilmezdir. Bir öz-aktivasyon testinin beklenen sonuçların özeti ve yorumlanması Tablo 1&#39;de verilmiştir ve Şekil 1&#39;de görüntülenmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Şekil 1: Bir Y2H Ekran Gösteri Önce bir Bait Bait Öz-aktivasyon Testleri örneği. , Zayıf bir kendi kendine aktive olan bir artı boş bir av Terazi: S. Cerevisiae NMY51 pozitif bir kontrol (AC sol panel) ve (Plex-p53) ve yırtıcı (Paktı-larget) yem etkileşim ile birlikte transforme edilmiş olanry vektörü (orta panel: df) ve kendinden aktive yem artı boş av kütüphane vektörü (sağ panel: gi). , Trp, Leu ve (orta panel: B, E, H): CO-dönüştürülmüş maya Trp ve Leu (a, D, G, üst panel) barındırmayan SD tabakalarına kültürlendi ve Trp, Leu, His ve ade (düşük Panel: c, f, i). yem vektör trp oksotrofinin ve av vektör NMY51 (SD-trp-leu üzerinde büyüme) ve leu oksotrofi tamamlar olarak orta eksik trp ve leu üzerinde seçim, başarılı ko-dönüşüm için olumlu bir kontroldür. yem ve yırtıcı ya da yem kendi kendine aktivasyonu arasındaki etkileşim halinde, NMY51 muhabiri ifadesi açık ve onun ve ade oksotrofi (SD-trp-leu-onun-ade üzerinde büyüme) tamamlar. Zayıf bir kendilik aktivasyonu SD-trp-leu-onun plakaları üzerinde büyüme ile karakterizedir (orta panel, df). Bir yem zayıf kendilik aktivasyonu önce yem analiz etmek için azalmış olmalıdırBir Y2H ekranında, seçici ortama 3-AT ekleyerek örneğin. Amino asit fakirleşme ile gösterilir &quot;-&quot; ilgili ortam adı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> Yok </td><td> koloniler </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td></tr><tr><td> Yok </td><td> pGAD-HA </td><td> büyüme yok </td><td> koloniler </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td></tr><tr><td> pLexA -N </td><td> Yok </td><td> koloniler </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td></tr><tr><td> pLexA -N </td><td> pGAD-HA </td><td> koloniler </td><td> koloniler </td><td&gt; koloniler </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td></tr><tr><td> pLexA p53 </td><td> Paktı-larget </td><td> koloniler </td><td> koloniler </td><td> koloniler </td><td> koloniler </td><td> koloniler </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> koloniler </td><td> koloniler </td><td> koloniler </td><td> büyüme yok </td><td> büyüme yok </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Bait Öz aktivasyon Testi Beklenen sonuçlar. S. Cerevisiae NMY51 dönüşüm birlikte dönüştürülmüş yem ve av özelliklerine göre seçici ortam üzerinde farklı büyüme elde edilir. seçici plakalar üzerine büyüme 30 ° C de 72 saat inkübe edildikten sonra, farklı vektör kombinasyonları (AF) transformasyonu sonra değerlendirildi. Zayıf kendilik aktivasyonu üzerinde maya büyüme ile karakterizedir SD-trp-leu-onun ve SD-trp-leu-onun-ade seçim plat üzerinde büyüme ile güçlü kendilik aktivasyonubir etkileşim ortağının yokluğunda es. pLexA-N kodlanmış phytoplasmal efektör ATP_00189 NMY51 kendisinin ve ade yokluğunda büyüme dönüştürülmüş yem vektörünün yetersizlik ile karakterize kendine aktivasyonu, sergilemez. yem bağlı olarak, bir Y2H ekran seçici plakalar üzerinde büyüyen çok sayıda maya klonları elde edebilirsiniz. Tüm klonlar, analiz ve olası işten kontrol edilmelidir. normalleştirilmiş cDNA kütüphanesi kullanılmıştır bile, bir uygulayıcı farklı klonlar temsil edilir çok muhtemeldir. Kütüphane klonlama tekniğe bağlı olarak, tam genin sadece fragmanları bir av vektörlerine eklenir da mümkündür. (CDNA&#39;dan) yükseltmek ve uygulayıcının tam uzunlukta geni alt klon ve bire-bir Y2H analizi (Şekil 2) bir etkileşim test etmek de novo böylece tavsiye edilir. <img alt = &quot;Şekil 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2: Bir Y2H Deney Yem ve Prey arasında bir etkileşim örneği. Bir maya iki-hibrid (Y2H) Ekran uygulandı ve pozitif uygulayıcı klonlardan plazmidler saflaştırılmıştır. Av vektör dizisi ve Malus x domestica konak etkileşim ortakları MdTCP24 ve MdTCP25 tespit edilmiştir. Bir negatif kontrol MdTCP34 (bunlar için herhangi bir uygulayıcı Y2H kitaplık taraması tespit edilmiştir) ve paralel alt-klonlanmıştır. Tam uzunluktaki genleri av vektörü (ko-cistronically aktivasyon alanı AD eksprese) içine alt klonlanmış, elma cDNA&#39;dan amplifiye edildi de novo DNA bağlama sahası (BD) birleştirilmiş bakteriyel efektör ATP_00189 ifade yem vektörü ile ko-transformasyona. Bu rakam, 28 alınır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Bir büyük görmek için tıklayınız</a>Bu rakamın sürümü.

Bakteriyel efektör proteinleri başarılı enfeksiyonları kurulması için önemlidir. Bu protokol, doğal bitki konukçuda bir bakteriyel efektör proteininin proteinli bağlanma partnerleri ile deneysel tanımlanmasını açıklar. Maya iki hibrit ekranlarından yoluyla bu efektör etkileşimleri belirlenmesi moleküler patojenite stratejilerinin çözülüyor önemli bir araç haline gelmiştir.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Bu prosedürün genel amacı, bir candidatus phytoplasma malefactor proteininin malus domestica konak proteinleri ile etkileşimini belirleyerek virulent stratejileri ve konak-patojen sistemlerini aydınlatmaktır. Bu yöntem, birçok farklı biyolojik araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve burada, Elma Proliferasyon Hastalığının gelişiminin altında yatan moleküler mekanizmaları açıklamak için bitki araştırmalarında kullanılmıştır. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir patojen efektörünün binlerce potansiyel etkileşimciye karşı taranabilmesiyle, bu yöntemi enfeksiyon araştırmaları için kolayca uygulanabilir bir başlangıç noktası haline getirmesidir.Başlangıç olarak, Elma Proliferasyonu'na özgü semptomlar gösteren enfekte ağaçları belirleyin ve semptom göstermeyen ağaçları kontrol grubu olarak seçin. Temiz budama makasları kullanarak, kök sisteminin üç farklı noktasından 0,5-1 cm çapında ve yaklaşık 5 cm uzunluğunda kök örnekleri kesin. Kök örneklerini uygun şekilde etiketlenmiş plastik torbalara yerleştirin.Ardından örnekleri, soğutulmuş termal paketlerin bulunduğu soğuk bir kutuya yerleştirin ve ileri işlemlere kadar 4 °C'de saklayın. Toprağı temizlemek için kök örneklerini suyla durulayın. Daha sonra örnekleri steril bir Petri kabına aktarın ve kök epidermisini ve korteksi temizlemek için sterilize edilmiş bir neşter kullanın.Temiz, hav bırakmayan bir mendille bisturiyi silin. Ardından aleti %70 etanol içine batırın ve açık alev üzerinde ısı ile sterilize edin. Floemi çizmek için bisturiyi kullanın.Numuneyi küçük parçalara bölün ve bu parçalardan 30-100 miligramı steril iki mililitrelik bir reaksiyon tüpüne paylaştırın. Numuneleri 80 °C'de saklayın veya efektör gen amplifikasyonu ve ardından efektörün yem vektörüne klonlanması için kalıp görevi görecek DNA'yı izole etmek amacıyla hemen kullanın. Enfekte ağaçlardan fitoplazma polispisifik DNA izole edildikten sonra, metin protokolüne uygun olarak yem vektörlerine klonlama yapın ve kendi kendine aktivasyon ile ekspresyon açısından test edin.ATP 00189 efektörü ile transforme edilmiş NMY51'i taze bir SD-trp plakasına çizgi ekim yöntemiyle ekleyin ve kırmızı koloniler oluşana kadar 30 °C'de iki ila üç gün boyunca kültüre edin. Agar plaktaki bir kırmızı koloniyi, küçük bir çalkalama balonundaki 3 mL SD-trp ortamını inoküle etmek için kullanın ve kültürü 30 °C'de, dakikada 120-150 rotasyon hızında çalkalayarak gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, gece boyu büyütülen kültürden 1 mL alarak bir çalkalama balonundaki 20 mL SD-trp ortamını inoküle edin ve sekiz saat boyunca büyümesini sağlayın.Kültürü OD600 değeri 0,2 olacak şekilde ayarlamak için SD-trp besiyeri kullanın ve kültürden on mililitre alarak, her biri 100 mililitre SD-trp besiyeri içeren iki erlene inoküle edin. Kültürleri 30 °C'de, çalkalamalı olarak gece boyunca inkübe edin. Ardından, kültürün OD600 değerini ölçün ve 120 OD600 birimini çöktürün.Örneğin, 1,2 OD600 ölçüldüğünde, 100 mililitre örneği santrifüjleyin, süpernatantı atın ve peleti iki çalkalama balonunda yeniden süspande etmek için önceden ısıtılmış 800 mililitre 2xYPAD kullanın ve 30 santigrat derece'de inkübe edin. Maya kültürünü 30 santigrat derece'de ve dakikada 120-150 devirde inkübe edin. Metin protokolüne uygun olarak, 0,6 OD600 değerine ulaşana kadar yaklaşık her 1,5 saatte bir OD600 ölçümü yapın.Metin protokolüne uygun olarak somon spermi DNA'sı, Lityum OAc ve PEG Lityum OAc hazırladıktan sonra, hücreleri çöktürmek için 800 mililitre maya kültürünü 700 x G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve çökelekleri toplam 200 mililitre steril çift distile su içerisinde yeniden süspande edin. Ardından hücreleri tekrar çöktürün ve süpernatantı atın.Peleti 16 mililitre Te Lityum OAc karışımında yeniden süspande edin ve örneği tekrar santrifüjleyin. Ardından süpernatantı uzaklaştırıp, peleti yeniden süspande etmek için 9,6 mililitre Te Lityum OAc kullanın. Uygun boyutlu reaksiyon kaplarında; yedi mikrogram peak Add HAC DNA kütüphane vektörü, 100 mikrolitre %2 somon spermi DNA'sı ve 2,5 mililitre PEG Lityum OAc karışımı içeren on iki tüp hazırlayın.Önceden hazırlanmış maya hücresi süspansiyonundan her bir tüpe 600 µL ekleyin ve bir dakika boyunca kuvvetlice karıştırın. Ardından, reaksiyonları 30 °C sıcaklıktaki bir benmari banyosunda, her 15 dakikada bir karıştırarak 45 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, her tüpe 160 µL DMSO ekleyin ve kuvvetlice karıştırın.Ardından tüpleri 42 °C'de 20 dakika daha inkübe edin. Hücreleri çöktürdükten sonra süpernatantı atın ve her bir peleti resüspande etmek için 3 mL 2xYPAD kullanın. On iki tüpün tamamındaki hücreleri 100 mL'lik bir çalkalama balonuna birleştirin ve mayayı 30 °C'de, dakikada 120 devir hızında 90 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, hücreler peletlendikten ve süpernatan atıldıktan sonra, peleti dikkatli bir şekilde pipetleyerek tamamen yeniden süspande etmek için on mililitrelik bir serolojik pipet ve 4,5 mililitre steril %0,9 sodyum klorür kullanın. Süspansiyondan 50 µL çekin ve 1:10'dan 1:1000'e kadar on katlı dilüsyonlar hazırlamak için %0,9 sodyum klorür kullanın. Ardından, her dilüsyonun 100 µL'sini SD-trp-leu agar içeren 90 milimetrelik Petri kaplarına ekimleyin.Seyreltilmemiş maya süspansiyonunun geri kalanını, SD-trp-leu-His-ade agarlı 16x150 milimetre çapındaki Petri kaplarına yayın. Plakaları, SD-trp-leu plakaları için üç gün, SD-trp-leu-his-ade plakaları için ise dört gün boyunca 30 degrees Celsius'ta inkübe edin. SD-trp-leu seçici plakalarındaki farklı seri dilüsyonların kolonilerini sayarak transfeksiyon verimliliğini belirleyin.Her bir klonu, steril bir pipet ucu kullanarak koloniyi seçip taze SD-trp-leu-his-ade selektif plaklara ekerek aktarın. Plakları 30 degrees Celsius'de 24 saat boyunca inkübe edin. Toplam beş pasaja ulaşana kadar klon aktarımını her gün tekrarlayın.Klonları analiz etmek için, steril bir kabin altında, her bir klon için 1 mL SD-trp-leu-his-ade içeren steril iki mililitrelik bir reaksiyon tüpü hazırlayın. Her tüpe sıcak bir iğne ile delik açın ve deliği kapatmak için gaz geçirgen bir kapatıcı kullanın. Her bir tüle tek bir klona ait taze koloni materyali inoküle edin ve tüpleri 30 °C'de, dakikada 150 rotasyonla 24 saat boyunca inkübe edin.Hücreleri pelletledikten ve süpernatanı attıktan sonra, pellet uygun tampon içerisinde yeniden süspande edin ve taze iki mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın. Süspansiyona 100 mikrolitre asitle yıkanmış cam boncuk ekleyin ve tüpü beş dakika boyunca kuvvetle karıştırın. Son olarak, plazmid DNA'yı metin protokolüne göre saflaştırın.Kendi kendine aktivasyon deneyi için beklenen sonuçların özeti ve bunların yorumu bu tablo ve şekilde sunulmuştur. Zayıf kendi kendine aktivasyon, trp-leu-his eksikliğindeki seçici plakalarda büyümeye yol açar, ancak trp-leu-his-ade eksikliğindeki plakalarda büyüme gerçekleşmez. Güçlü kendi kendine aktive olan bir yem ile transforme edilmiş mayalar ise trp-leu-his-ade içermeyen besiyerinde büyüyecektir.Yem ve av proteinlerinin başarılı bir kotransformasyonu, trp ve leu içermeyen seçici plaklarda büyüme ile karakterize edilir. Yem ve av proteininin etkileşimi, NMY51'in his ve ade oksitrofisinin komplemanter hale gelmesine yol açar. Burada, bir Maya 2 Hibrit Deneyi'ndeki yem ve av arasındaki etkileşime dair bir örnek gösterilmektedir. Malus domestica konak etkileşim partnerleri MdTCP24 ve MdTCP25 tanımlanmış ve etkileşim, efektör ile denovo kon transformasyonu ile doğrulanmıştır.Gerekli tüm ekipman ve materyaller, özellikle de maya, önceden uygun şekilde hazırlandığında, maya iki hibrit yöntemi uzmanlaşıldıktan sonra tek bir günde gerçekleştirilebilir. Bu prosedür uygulanırken kontaminasyondan kaçınmak ve her zaman steril koşullar altında çalışmak önemlidir. Bu prosedürün ardından, saptanan protein-protein etkileşimlerini doğrulamak için örneğin bimoleküler floresan komplementasyonu gibi başka bir bağımsız yöntem uygulanmalıdır.Maya veya hibritin kendisi nispeten yanlış pozitif sonuçlar üretmeye eğilimli olduğu için bu durum özellikle önemlidir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, birçok farklı araştırma alanındaki araştırmacıların, özellikle konakçı-patojen etkileşimlerinde olmak üzere protein-protein etkileşimlerini içeren moleküler prensipleri ve diğer birçok biyolojik araştırma alanını daha iyi anlamalarına önayak olmuştur. Ayrıca, bu yöntemin uygulanmasının yeterli donanıma sahip herhangi bir moleküler biyoloji laboratuvarında kolayca gerçekleştirilebilir olduğunu anlayacaksınız.Belirli kimyasallar, bisturiler ve açık alevlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu nedenle, bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman belirli önlemleri göz önünde bulundurmalısınız. Bu, eldiven ve koruyucu gözlük gibi kişisel koruyucu donanımlarınızı ve genel laboratuvar güvenlik ekipmanlarını kullanmanız gerektiği anlamına gelir.

unravelling-function-bacterial-effector-from-non-cultivable-plant

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, biz, maya ve efektör-kaynaklı büyüme inhibisyonu fenotiplerinin belirlenmesi bakteri tip III etkileyiciler ifadesi için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu tür fenotipleri sonradan efektör fonksiyonları ve hedefleri aydınlatmak için yararlanılabilir.

Büyüme inhibisyonu fenotipleri tanımlanması Mayalarda bakteriyel Tip III Efektör İfade İndüklenmiş

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Biz geleneksel maya iki-hibrit taraması, protein etkileşimleri tanımlayan genetik etkili bir aracı olarak var. Bu değişiklik, sürecin belirgin kısaltır, iş yükünü azaltır ve en önemlisi, yanlış pozitiflerin sayısını azaltır. Buna ek olarak, bu yaklaşım, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Büyüme Faktörü Progranulin ile etkileşimde Proteinler tanımlamak Modifiye Maya-İki Hybrid Sistemi

Bu makalede, ev sahibi ve iki dik yöntemleri bir arada kullanarak patojen proteinler arasında yüksek güvenen etkileşim veri setlerinin belirlenmesi üzerinde duruluyor: maya iki hibrit HT-GPCA adı verilen memeli hücrelerinde yüksek verimli bir etkileşim yöntemi ile izledi.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Burada açıklanan yöntem, bir anti-apoptotik bakteriyel efektör proteinin aktivitesini incelemek için tanımlanmış adımlarda apoptotik sinyal kaskadını indüklemek için kullanılır. Bu yöntem aynı zamanda pro-apoptotik veya toksik proteinlerin indüklenebilir ekspresyonu için veya diğer sinyal yollarıyla etkileşimi incelemek için de kullanılabilir.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

Floresan protein temelli yaklaşımlar konak hücrelere bakteriler tarafından salgılanan effectors izlemek için zor olan. Bu tip III salgı sistemi ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk kaynaklanmaktadır. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş split superfolder GFP sistemi ana bitki hücre bakteriler tarafından salgılanan effectors görselleştirme için kullanılır.

Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.

Toplu işleme Maya 2-hibrid ekranlarının birden fazla yem protein etkileşim profilleri av füzyon protein son derece karmaşık bir dizi doğrudan karşılaştırma sağlar. Burada, rafine yöntemleri, yeni reaktifler ve bunların kullanımı böyle ekranlar için nasıl açıklar.

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Bakteriyel patojenler, önemli biyolojik süreçleri hedef alan konakiçine protein salgılarlar. Bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarının belirlenmesi moleküler patogenezi ele almanın anahtarıdır. Burada, toksik bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarını açıklamak için modifiye edilmiş maya bastırıcı ve toksisite ekranı kullanılarak kullanılan bir yöntem tanımlanmıştır.

Maya Toksisitesi ve Bastırıcı Ekranlar Kullanılarak Bakteriyel Efektör Proteinlertarafından Hedeflenen Konak Yollarının Belirlenmesi

Burada, bitki patojenlerinde RNA susturucularını hızlı bir şekilde taramak için yaygın olarak kullanılabilecek değiştirilmiş bir tarama yöntemi salıyoruz.

Bitki Patojenlerinin Gizli Efektörlerinden RNA Susturucu Baskılayıcıların Taranması ve Tanımlanması

Protein-protein etkileşimleri gibi biyomoleküllerin etkileşimleri, biyolojik fonksiyonların moleküler temelidir. Özellikle ilgili etkileşimden yoksun olan etkileşim-sıfır/bozulmuş mutantlar izole edilebilirse, bu etkileşimin işlev(ler)ini anlamaya büyük ölçüde yardımcı olacaklardır. Bu makale, etkileşimi boş/bozulmuş mutantları izole etmenin etkili bir yolunu sunmaktadır.

Maya iki-hibrit testi kullanılarak etkileşim-boş/bozulmuş mutantların izole edilmesi

Fisyon mayası burada, polimerizasyonlarını görselleştirmek için GFP ile translasyonel füzyon proteinleri olarak FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese etmek için heterolog bir konakçı olarak kullanılır. Ayrıca, polimerizasyonu etkileyen bileşikler, bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntüleme ile tanımlanır.

Bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan antibakteriyel ilaç taramaları için bir platform olarak fisyon mayası

Keşfedin maya iki hibrid tarama yöntemiyle bakteriyel efektör proteinlerinin Malus domestica ile etkileşimlerini. Bu protokol bitki patojenliği ve enfeksiyon mekanizmalarını anlamak için sağlam bir çerçeve sunar.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Daha fazla video keşfet