Name: Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Öğrenin, HEK-293 hücreleri kullanarak serum içermeyen ortamda terapötik antikor üretimi ve saflaştırma yöntemini. Bu protokol, yüksek verimli ve tekrarlanabilir antikor üretimi için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Araştırma Sydney Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ, Andrew Beavil'in (Addgene plazmidi # 61883) bir hediyesiydi. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ ile ilgili faydalı tartışmalar için Tihomir S. Dodev'e teşekkür ederiz.

NOT: uygun bir memeli ifade vektörü, bu protokol için kullanılmalıdır. Burada, iki ekspresyon kasetleri içeren tek bir yapı kullanılmıştır (örneğin ağır ve hafif zincir ekspresyon ayrı promoterler tarafından tahrik edilir). Trastuzumab, ağır ve hafif zincirler, daha önce vektörüne klonlanmıştır. Bu vektör bir değil, kar amacı gütmeyen plazmid depo 13 ile elde edilen Andrew Beavil bir hediye oldu. 1. geri kazanımı ve vektör DNA ölçek büyütme Not: Vektör DNA, Escherichia coli XL-1 Mavi suşu bir yumuşak agar levha kültür olarak alınmıştır; Vektör higromisin direnç taşımaktadır. <ol><li> Daha sonra çizgi bir Luria Bertani (LB) agar plaka 75 mikrogram ile hazırlanan bıçak kültürünün yumuşak agar içine steril bir aşılama bıçak ya da döngü takın / izole koloniler için ml higromisin. 18-24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> 75 ug / ml higromisin içeren 5 ml Terrific suyu (TB) içine tek bir koloni inoküle. incu225 rpm çalkalanarak 18-24 saat boyunca 37 ° C &#39;de kesmek kültürü. </li><li> yavaşça -80 ° C de meydana gelmekteydi ve dondurularak 200 ul% 80 gliserol ile kültür, 800 ul karıştırılarak vektör DNA, bir gliserol stokundan hazırlamak için bir gece boyunca kültür kullanın. <ol><li> Ihtiva eden 100 mi TB gecelik kültüründen 100 ul ekle 75 ug / bölmeli bir çalkalama şişesinde (örneğin 1/1000 seyrelti) içinde higromisin ml. 225 rpm çalkalanarak 18-24 saat boyunca 37 ° C &#39;de kültür inkübe edin. </li></ol></li><li> bir gece kültürden sonra, ayıklamak ve şu istisna ile MIDI / maksi hazırlama kiti üreticinin talimatlarına göre DNA saflaştırılması; su (pH 7,0-8,5) ile son adım, elute veya tekrar süspansiyon DNA sırasında. </li><li> daha sonra -20 ° C de, DNA depolamak 260 ve 280 nm &#39;de konsantrasyon ve absorbans okumaları ile DNA saflığı kontrol edin. NOT: İsteğe bağlı (tavsiye): Sıra DNA kimliğini doğrulamak için vektör-spesifik primerler kullanılarak. </li></ol> 2. HEK-293 hücrelerinin kararlı transfeksiyonu <ol><li> Büyüme ve Erlenmeyer şişelerinde% 0.1 noniyonik yüzey aktif madde ile takviye edilmiş serumsuz ortamda, standart protokollere göre, HEK-293 hücreleri (süspansiyon hücreleri) korur. 2 x 10 5 hücre / ml ve alt kültür her dördüncü gün koruyun. % 5 CO2 ve 120 rpm dönme ile 37 ° C &#39;de kültür hücreleri. Not: Hücreler, en az 4 gün boyunca kültür edilmiş ve transfeksiyondan en fazla 4 hafta önce olmalıdır. Serum içeren ortam içinde mono-tabaka olarak yetiştirilen HEK-293 hücreleri bu işlem için kullanılabilir. </li><li> Günde, transfeksiyondan önce, tohum, HEK-293 hücreleri, bir 12-yuvalı plakanın yuvaları içinde 3 x 10 5 hücre / ml&#39;de 2% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Ortamı (DMEM) içinde mi ( FBS). Transfeksiyon gününde, hücreler% 80-90 konfluent ulaşmış kontrol </li><li> Daha sonra karıştırın transfeksiyon medyada ayrı ayrı DNA ve polietilenimin (PEI) seyreltin.<ol><li> 300 ul transfeksiyon medyada kuyu başına 1.25 mikrogram vektör DNA (12 kuyuları için 15 mikrogram) seyreltin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> (12 kuyu 30 ul, yani 1: PEI DNA 2 oran) 1 mg / ml PEI solüsyonu 2.5 ul seyreltilir 300 ul transfeksiyon ortamı içinde. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> hafifçe karıştırın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe, seyreltilmiş PEI seyreltilmiş DNA ekleyin. </li></ol></li><li> plakanın her oyuğuna DNA / PEI karışımı damla damla 50 ul ekle. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 transfeksiyon karışımı daha sonra plaka yer dağıtılması için hafifçe plaka sallayın. </li><li> Oyuk başına B higromisin ve 10 gün boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ile plaka dönüş ml / 50 ug ekleyin. Not: kararlı bir şekilde transfekte edilmiş hücrelerde, uygulanabilir ve plakaya eklenir ise 10. günde, un transfekte edilmiş hücreler, plaka yüzeyindeki öldü ve müstakil olacaktır. </li><li> ile kuyularda medya değiştirin1/4 hacim serumsuz ortam ve 3/4 hacim DMEM% 10 FBS (örneğin, 0.5 mi serumsuz ortam + 1.5 ml DMEM =% 7.5 nihai serum konsantrasyonu) ve 4 gün boyunca inkübe ile takviye edilmiştir. </li><li> % 10 FBS (+ 1 mi DMEM =% 5 son serum konsantrasyonu, yani 1 mi serumsuz ortam) ile desteklenmiş 1/2 hacim serumsuz ortam ve 1/2 hacim DMEM ile kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin. </li><li> % 10 FBS (örneğin, 1.5 mi serumsuz ortam + 0.5 mi DMEM =% 2.5 nihai serum konsantrasyonu) ile desteklenmiş 3/4 hacim serumsuz ortam ve 1/4 hacim DMEM ile kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin. </li><li> % 0.1 noniyonik yüzey aktif madde (örneğin,% 0 son serum konsantrasyonu) ile desteklenmiş serumsuz ortam 2 ml kuyu ortamı yerine ve 4 gün boyunca inkübe edin. Not: serumsuz uyarlanması sırasında hücreler üzerinde 50 ug / ml higromisin B seçici bir basınç muhafaza edin. serum ücretsiz medya adapte Hücreler kuyuların yüzeyinden ayırmak ve i küme olabilirn süspansiyon. 50 ug ek takviyesi ile kültür koşulları için 2.1 adıma bakın / B. ml higromisin </li><li> Bir pipet kullanarak, hafifçe ayrı tüp içine 12 oyuklu plaka ve havuz hücre süspansiyon kültürleri karıştırın. <ol><li> Bir hemasitometre kullanarak, 2 x 10 5 hücre / ml bir Erlenmeyer şişesi içinde 30 ml serumsuz ortam içinde toplanmış hücreleri ve tohum numaralandırmak. % 5 CO2 ve 120 rpm dönme ile 37 ° C &#39;de kültür hücreleri. Altkültür ve her dördüncü gün genişletin. </li></ol></li><li> / 1 x 10 7 hücre 10 şişe elde etmek için gerekli hücre yoğunluğu kültür boyutunu genişletmek sıvı azot içinde dondurulması için şişeyi devam edin. % 10 dimetilsülfoksit (DMSO) ihtiva eden serumsuz ortam hücreleri dondurun. Not: antikor içeren koşullu ortam, protein üretimini teyit etmek için her bir alt kültür hasat veya saflaştırma koşulları optimize etmek için kullanılabilir. klimalı ortam hasat ve alt kültür hücreleri korumak, en kültürünü santrifüj5 dakika boyunca 300 x g daha sonra bir 0.22 mikron filtre içinden süpernatan filtre-sterilize edin. Filtre yüzer 1-2 hafta veya daha uzun süreli depolama için -20 ° C, 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> Toplu kaplamak Kültür 3. Büyük Ölçekli Antikor Üretimi NOT: Antikor üretimi mevcut hücreler kurulum toplu kaplamak kültür hacmine dayalı gerekli hücre yoğunluğuna genişletilir adım 2.11 dan takip edilebilir. Aksi takdirde, soğukta korunan çözülmüş olan hücreler bir kez uygun bir hücre yoğunluğuna ve hacmine genişletilmiş bu aşamada başlar. Çeşitli kültür takviyeleri antikor üretimini optimize etmek için kullanılabilir; tripton kullanımı antikor verimi Bu protokolde gösterilmiştir artırmak için. <ol><li> Tohum hücreler iki Erlenmeyer şişelerinde 100 mi serumsuz ortam içinde 2 x 10 5 hücre / ml&#39;de (takviye un ve besin takviye kültürlerden antikor verimlerini karşılaştırmak üzere). 37 ° C&#39;de Kültür ° C,% 5 CO2 </sub&gt; ve 120 rpm. </li><li> 24 saat sonra, besin takviye kültüre% 0.5 bir son konsantrasyona tripton ekleyin. serum serbest medya ile un takviye kültür hacmini eşitlemek. </li><li> Gün 8, hücre canlılığı izlemek için bir hemositometre kullanılarak, günlük kültürlerin hücre sayımı gerçekleştirin. hücre canlılığı, 80% &#39;den daha az bir kez kültür süpernatanlarının hasat. <ol><li> 3,000 xg 15 dakika için kültürlerin santrifüj ile hasat yüzer madde daha sonra 0.22 um&#39;lik bir filtreden süpernatan içeren (antikoru) filtre-sterilize edin. 4 ° C (kısa süreli) olarak süpernatantlar saklayın veya -20 ° C (uzun vadeli) donma. </li></ol></li></ol> Bağlantı Kromatografisi ile saflaştırma 4. Antikor otomatik bir hızlı protein sıvı kromatografi kullanarak (FPLC) Sistem Not: Aşağıdaki prosedür, genel olarak, çoğu otomatik sistemlere uygulanabilir. Saflaştırma, oda sıcaklığında gerçekleştirilir ya da 4 ° C &#39;de (FPLC sistemi serin bir odada muhafaza edilir ise) olabilir.keşif bir dizi test (Sonuçlar bölümüne bakınız) koşullandırılmış ortamdan saflaştırıldı antikorun en iyileşme sağlamak için tampon elüsyon tampon ve pH, bağlayıcı uygun sütun matrisi içeren uygun saflaştırma koşulları belirlemek için gerçekleştirilebilir. Optimal koşullar, antikor veya protein arındırılmadan bağlıdır. Saflaştırma otomatik bir FPLC sistemi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma 5 ml&#39;lik bir Protein A kolonu kullanılarak oda sıcaklığında yapıldı. <ol><li> ultra saf su kullanılarak, aşağıdaki tamponlar hazırlamak ve daha sonra bir 0.22 mikron filtre içinden filtre tavsiye edilen pH ayarlamak. <ol><li> 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCI, 0.01 M Na-2 HPO 4 0.001 M KH 2 PO 4: aşağıdakileri karıştırarak fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), pH 7.4 (bağlanma tamponu) 1 L hazırlayın. tampon filtreleme önce gerekirse pH ayarlayın. </li><li> 0.1 M glisin-HCI pH 2.7 (elüsyon tamponu), 500 ml hazırlayın. buff filtreleme önce pH ayarlayıner. </li><li> 1 M Tris pH 9.0 (nötralizasyon tamponu) 50 ml hazırlayın. </li></ol></li><li> yapılan bilgisayar ile tüm sistem güç ve iletişim bağlantılarını sağlamak. Cihazlar yazılımı &#39;Sistem Denetimi&#39; modülünde görünür olmalıdır. Emin UV cep 280 nm dalga boyunda ayarlanır. İsteğe bağlı: Bağlı ve kullanılacak eğer pH metre kalibre. </li><li> sistemin yıkanması, aşırı saf su içinde A, B ve örnek pompa giriş tüpleri bırakın. boru içindeki hava veya sistemde bir hava şüphe varsa bir şırınga ile pompaları temizleyin. sistem kontrolörü üzerinden veya otomatik yöntemiyle manuel kullanıma su ile sistemi yıkayın. Bu basınç, iletkenlik, UV280 izleme ve pH tutarlı kalır ve sütun için basınç limiti üreticinin şartnamesine göre aşmamak gözlemleyin. NOT: anormallikleri devam etmeden önce ele alınması gereken sistemde hava veya tıkanıklığa işaret eder. </li><li> sistem kontrol modülü, 1 de debi başlatmakml / dk manuel ya yük pompa A yoluyla (örnek döngü atlayarak) veya sütun bağlayan başlamak için pozisyon (örnek döngü yoluyla) enjekte edilir. Kes sistem sütun konumunu girişinde boru ve sütun girişine bağlı tıpa kaldırın. <ol><li> Su daha sonra kolona sistemi boru eklemek sütununun tepesine sistem boru damla damla akmasına izin verir. Sütun girişi olan ve giriş uydurma su damlaları ile taşan hava kabarcıkları serbest bir bağlantı sağlar. </li></ol></li><li> mansap çıkışında sütun çıkışını takın ve tüm parçaları sıkıca tutturulmuş emin olun. Sütun artık sisteme bağlı sütun şartnamesinde belirtildiği gibi, maksimum basınç sınırı ve debi sınırlarını aşmamaktadır. </li><li> su, 5 kolon hacminde (CV) ile kolon yıkanır. Gerekirse UV280 izleme stabilize kadar, kolon yıkama devam ediyor. </li><li> tampon Bağlama A&#39;nın giriş tüpleri daldırın, Tasfiye B tampon ve Ciltleme tampon t örnek pompasıo doğru tamponlarda sistemi dengeye. manüel işlemle PumpWash kullanarak tamponu ile giriş tüpleri doldurmak. </li><li> Yazılımın &#39;yöntemi Editörün&#39; modülünde, kurulum için bir yöntem sihirbaz kullanılmak üzere tasarlanmıştır sütun için bir afinite kromatografisi yöntemi kullanın. NOT: Otomatik FPLC sistemler yöntemleri önerilen ayarlar (yani debi ve basınç sınırı) ile önceden doldurulmuş ve saflaştırılması için seçilen sütunun (üretici, matris ve boyut) dayalı adım koşmak ile birlikte gelir. <ol><li> Protein A afinite kromatografisi için aşağıdaki çalışma adımları kullanın: <ol><li> Bağlama tamponu 5 CV ile sisteme dengelenmesi ve atık kabına flowthrough toplamak. </li><li> Sütun üzerine yük numune ve ayrı bir kabın içine flowthrough toplamak (hacim yöntemi elle belirtilen yüklenecek). </li><li> Bağlama tampon çözeltiden 5 CV ile yıkama sistemi, ayrı bir kap içine flowthrough toplar. </li><li> 5 CV isocrat ile elüt sütunuElüsyon tamponu ve fraksiyon toplayıcı tarafından fraksiyonları gibi saflaştırılmış antikor numune toplamak kullanarak IC fraksiyonasyon. </li><li> Bağlama tamponu 5 CV ile sisteme dengelenmesi ve atık kabına flowthrough toplamak. </li></ol></li></ol></li><li> yöntem kurulumu edildikten sonra, koşullu ortamın hacmi kolonuna uygulanacak belirtmek ve yöntem kaydedin. Not: Yöntem belirtilen birim örnek akımı boyunca hava giriş önlemek için, gerçek hacmi 5-10 mi az olmalıdır. Bu protokolde kullanılan belirtilen hacim 90-120 ml. </li><li> klimalı ortamı içeren kabına numune pompa hortumunu Batmak. </li><li> Belirtilen çıkış boru ile örnek flowthrough toplanması için ayrı bir kap hazırlanır. NOT: sütun veya arıtma r uygulanamayacağı için flowthrough gerektiren aşıldığında bir hata çalıştırmak veya sütun bağlama kapasitesi sırasında oluşması durumunda flowthrough toplamak için önemlidirepeated. </li><li> fraksiyon toplayıcı toplama tüpleri hazırlayın. 1 mi fraksiyon hacim başına nötralizasyon tampon 100 ul ekle. FPLC sistem otomatik toplama tüpleri içine kesirler Zehir. </li><li> Yazılımın &#39;Sistem Kontrolü&#39; modülünde, yöntem açmak çalıştırılacak. NOT: yöntem çalışma yöntemi, fraksiyon toplayıcı kurulum değişkenleri kontrol ve sonuç dosya adını ve depolama konumunu tanımlayan dahil sayfaların bir dizi başlatılır. </li><li> Çalışmayı başlatmak için BAŞLAT tıklayın. run &#39;Sistem Denetimi&#39; modülünde izlenebilir. </li><li> arıtma çalışmasının bitiminde, sistem yazılımı &#39;Değerlendirme&#39; modülünde sonuçlanan kromatogramı kontrol edin. </li><li> Ayrı bir tüp, tampon değişimi içine tüm protein ihtiva eden fraksiyonlar birleştirilir ve kesik 30 kDa molekül ağırlığına sahip bir santrifüj filtre cihazı kullanılarak PBS içinde konsantre edilir. üreticinin göre santrifüj adımları uygulayıntalimatlar. </li><li> üreticinin talimatlarına göre bisinkoninik asit analizi (BCA) kullanılarak antikor konsantrasyonu ölçümü. </li><li> Başka bir arıtma çalıştırmak yapılacak ise, Bağlama tampon ve tekrar başbakan örnek pompa hortumu 4.9-4.14 adımları. </li><li> saflaştırma çalışır tamamlanmasından sonra, aşırı saf su içinde A, B ve örnek pompa giriş tüpleri daldırın ve adım 3&#39;te yapılan gibi bir sistem ve sütun yıkayın. </li><li> sistem ve kolonun depolanması için% 20 etanol ve tekrar yıkama prosedüründe A, B ve örnek pompa hortumunu Batmak. </li><li> aşağı prizden sütun ayırın ve sütun stoper yerine, daha sonra girişinde sütun ayırın ve stoper yerine, sisteme boru bağlayın. 4 ° C&#39;de sütun saklayın. </li></ol>

<ol><li>Nelson, A. L., Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+trends+for+therapeutic+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Development trends for therapeutic antibody fragments.</a> Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).</li>
<li>Drake, P. M., Rabuka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+playbook+for+antibody-drug+conjugates%3A+lessons+from+the+laboratory+and+clinic+suggest+a+strategy+for+improving+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety.</a> Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).</li>
<li>Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies.</a> Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).</li>
<li>Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+challenges+for+the+next+generation+of+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies.</a> Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).</li>
<li>Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).</li>
<li>European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).</li>
<li>Lopez-Morales, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+and+biological+characterization+of+a+biosimilar+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab.</a> Biomed Res Int. 2015, 427235(2015).</li>
<li>Jung, S. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25517302">Physicochemical characterization of Remsima.</a> MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).</li>
<li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+and+functional+comparability+between+the+proposed+biosimilar+rituximab+GP2013+and+originator+rituximab%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab.</a> BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+different+vector+designs+for+the+mammalian+expression+of+recombinant+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies.</a> J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).</li>
<li>Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+IRES+elements+in+mRNAs+to+the+eukaryotic+translation+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus.</a> Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).</li>
<li>Ho, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+Tricistronic+vectors+for+enhancing+generation+of+high+monoclonal+antibody+expressing+CHO+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines.</a> J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).</li>
<li>Dodev, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tool+kit+for+rapid+cloning+and+expression+of+recombinant+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies.</a> Sci Rep. 4, 5885(2014).</li>
<li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+protein+biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals.</a> Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).</li>
<li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+vector+design+and+multi-pathway+modulation+of+HEK+293E+cells+yield+recombinant+antibody+titers+exceeding+1+g%2Fl+by+transient+transfection+under+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions.</a> Nucleic Acids Res. 36 (15), 96(2008).</li>
<li>Bebbington, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression+of+a+recombinant+antibody+from+myeloma+cells+using+a+glutamine+synthetase+gene+as+an+amplifiable+selectable+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker.</a> Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).</li>
<li>Kaufman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coamplification+and+coexpression+of+human+tissue-type+plasminogen+activator+and+murine+dihydrofolate+reductase+sequences+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells.</a> Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).</li>
<li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).</li>
<li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+gene+expression+in+HEK293+cells%3A+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).</li>
<li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transient+transfection+of+serum-free+suspension-growing+HEK293+EBNA1+cells%3A+peptone+additives+improve+cell+growth+and+transfection+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).</li>
<li>Yang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+valproic+acid+to+CHO+cell+fed-batch+cultures+improves+monoclonal+antibody+titers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers.</a> Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).</li>
<li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+acid%3A+a+viable+alternative+to+sodium+butyrate+for+enhancing+protein+expression+in+mammalian+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures.</a> Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).</li>
<li>Jiang, Z., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+butyrate+stimulates+monoclonal+antibody+over-expression+in+CHO+cells+by+improving+gene+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).</li>
<li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu protokol, HEK-293 hücrelerinde transfeksiyon, stabil ekspresyon ve bir terapötik antikorun saflaştırılması göstermektedir. antikor genlerinin kararlı tanımının, bir terapötik antikorun geliştirilmesi ve üretimi için bir antikor üreten hücre hattı oluşturmak için ilk adımdır. Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücreleri, terapötik proteinler için tercih edilen sentezleme platformu kalırken, HEK-293 hücre hattı mesaj açısından bu hücrelerde üretilen proteinler, doğal insan proteini olarak oluşan yakın bir maç gerçekleştiril...

terapötik antikorların başarılı nesil terapötik bir dalga başlar Antikor gelişme içine önemli miktarda yatırım sürmeye devam eder. Antikor pazar uygun özelliklere 4 antikor fragmanları 1, antikor-ilaç konjugatlarının 2 bispesifik antikorlar 3 ve işlenmiş antikorlar suretiyle yeniden beklenmektedir. İlaç ilgi kazanıyor başka sınıf biyobenzerler vardır. Biyobenzer antikorlar zaten düzenleyici onayı almış bir terapötik antikorun ürünlerini çoğaltmak &#39;son derece benzer&#39;. Önerilen bir Biyobenzer yapısı, fonksiyon, hayvan toksisite, klinik güvenlik ve etkinliği, insan farmakokinetik (PK), farmakodinamik (PD) ve immünojenite 5, 6 ile ilgili olarak yaratıcısı antikoru ile uyumlu olmalıdır. onay rBiyobenzer antikorların ates nedeniyle ürünün nihai kalitesi üzerinde sıkı kısıtlamalar yavaş olmuştur. Böyle son işlem adımlarına yoluyla hücre hatları ve kültürleme koşulları belirli tam olarak üretim süreçlerinin tescilli kalabilir. Dahası, antikor üretimi doğal oldukça benzer bir ürün üretme meydan ekleyebileceğiniz değişkenlik derecesi gerektirir. Kapsamlı bir fizikokimyasal ve biyofizik karakterizasyonu ve karşılaştırma oldukça zordur, ancak Biyobenzer antikorların özelliklerini gösteren bir dizi çalışma literatürde 7, 8, 9 ortaya çıkıyor. terapötik bir antikor üretme ilgili antikor için geni taşıyan bir vektör ile memeli konakçı hücrelerinin transfeksiyonu ile başlar. Vektör tasarımı, hücre dizisi ve kültür koşulları eski kurmak için anahtar faktörlerdirpression sistemi. antikorların DNA dizileri İlaç Bankası (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ya da patent dahil olmak üzere araştırma yayınlarından kaynaklı olabilir. Örneğin, trastuzumab sırası İlaç Bankası (: DB00072 DB ID) aracılığıyla kullanılabilir. değişken bölgelerinin amino asit dizisi istenen konakçı türlerinde sentezi için gen tasarımı ve optimizasyonu geçirebilmektedir. Bu hiçbir değişiklik amino asit sekansına yapılan bir biyobenzer antikor için önemlidir. sentezlenmiş sonra, antikor genleri seçim uygun bir vektör içine alt klonlanabilir. İnsan IgG antikorları iki özdeş ağır zincir ve iki özdeş hafif zincirlerin oluşur. Her iki zincir sıkı bir biçimde düzenlenmesi sentezleme memeli hücrelerinde 10 heterolog IgG proteini optimal üretimi için gereklidir. arası zincirli disülfid bağının oluşmaması gerekir ve post-translasyonel modifikasyonlar, bir dizi olması hem de İçiprotein biyosentezi sırasında troduced. vektörlerin bir dizi antikor genleri (Malzeme Tablo bakın) ifade etmek için özel olarak tasarlanmış olduğunu mevcuttur. Bu antikor özel vektörler, genellikle, her zincirin bu nedenle sadece değişken bölgeleri klonlama gerektirir ağır hem de hafif zincirlerin sabit bölgeleri ifade eder. iki bağımsız yapıların (ko-transfeksiyon) ile hücrelerin transfeksiyonu, ağır ve hafif zincir kodlayan genlerin verilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Başka bir deyişle, her bir genin endoplazmik retikulum içinde birleştirilmeden önce, kendi promoter tarafından tahrik edilen ve ayrı antikor zincirleri olarak transkripsiyonu. Diğer taraftan, çoklu-sistronik vektörler mRNA 11 iç bölgelerinden izin çeviri ile tek bir mRNA transkripti olarak birden fazla genin ifadesini izin dahil dahili ribozom giriş sahası (IRES) elemanları vardır. Bu durumda, ağır ve hafif zincir kodlayan genler arrang bağlanmış olanHer iki antikor zincirlerinin 10, 12 eş ifadesini elde etmek için ası,. geçici olarak transfekte hücreler, deney sınırlı sayıda gerçekleştirmek için yeterli protein elde birlikte, genom entegrasyonu için seçim geçiren stabil olarak transfekte edilmiş hücre hatları daha yüksek verim verebilir. Daha yüksek protein miktarlarının in vitro karakterizasyonu ile ilgili deney geliştirme sağlar ve klonal hücre hattı ve kurşun aday seçimi gibi alt uygulamalar dikkate antikor kalitesinin bir göstergesini sağlar. Bu maddenin amacı, bir memeli ekspresyon sisteminde üretilmiş bir terapötik antikorun kararlı ifadesi ve saflaştırılması tarif etmektir. Gerçekten de, bu yöntem, biyobenzer antikorun ifadesine uygulanabilir. yöntem, zaman alıcı ste olsa önemli için devam etmeden önce, antikorların başlangıç ​​karakterizasyonu için kullanılabilirdaha büyük ölçekli üretimi için bir arzu klon belirleme ps. Dahası, bu yöntem diğer proteinleri ve sadece antikorların ifade edilmesi için kullanılabilir. Aşağıdaki detaylı protokol terapötik antikor trastuzumab ifadesini açıklar. Bu, otomatik bir kromatografik yöntem ile, HEK-293 hücre hattı ve antikor proteininin saflaştırılmasına kararlı transfeksiyonu takiben vektör DNA&#39;nın hazırlanması oluşur.

<table><tbody><tr><td>pFUSE vektör serileri</td><td>InvivoGen</td><td>N/A</td><td>Ko-transfeksiyon gerektiren ayrı vektörlerde ifade edilen ağır ve hafif antikor genleri.</td></tr><tr><td>mAbXpress vektör serisi</td><td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td><td></td><td>Ağır ve hafif antikor genleri, ko-transfeksiyon gerektiren ayrı vektörlerde ifade edilir. Bakınız: Jones, M. L. et al. Rekombinant monoklonal antikorların hızlı, ligasyondan bağımsız yeniden biçimlendirilmesi için bir yöntem. J İmmünol Yöntemleri. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td></tr><tr><td>pVITRO1 vektör</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ağır ve hafif antikor genlerinin her biri, tek bir vektörde ayrı bir promotör tarafından yönlendirilir. Bakınız: Dodev, T. S. et al. Rekombinant antikorların hızlı klonlanması ve ekspresyonu için bir araç kiti. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td></tr><tr><td>GS vektör serileri</td><td>Lonza</td><td></td><td>Ağır ve hafif antikor genleri ile çoklu sistronik vektör birlikte eksprese edildi ve tek transkript olarak çevrildi.</td></tr><tr><td>Çoklu sistronik vektör serisi 1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ağır ve hafif antikor genlerine sahip çoklu sistronik vektör birlikte eksprese edilir ve tek transkript olarak çevrilir. Bakınız: Li, J. et al. Rekombinant IgG antikorlarının memeli ekspresyonu için farklı vektör tasarımlarının karşılaştırmalı bir çalışması. J İmmünol Yöntemleri. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td></tr><tr><td>Çoklu sistronik vektör serisi 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ağır ve hafif antikor genlerine sahip çoklu sistronik vektör birlikte eksprese edilir ve tek transkript olarak çevrilir. Bakınız: Ho, SC et al. CHO hücre hatlarını eksprese eden yüksek monoklonal antikor oluşumunu arttırmak için IRES aracılı Trisistronik vektörler. J Biyoteknoloji. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td></tr><tr><td>pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&kappa;</td><td>Addgene</td><td>61883</td><td>Higromisin direnç genine sahip trastuzumab antikor genlerini içeren memeli ekspresyon vektörü; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&kappa; Andrew Beavil'in bir hediyesiydi.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro Agar</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-s</td><td>75 & mikro içeren düşük tuzlu LB agar hazırlamak için kullanılır; g / ml higromisin.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro TB</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-l</td><td>75 & mikro içeren düşük tuzlu TB suyu hazırlamak için kullanılır; g/ml higromisin.&nbsp;</td></tr><tr><td>Gliserol, BioXtra, & ge; %99</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td>Su ve otoklav ile %80'e kadar hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>Jestar 2.0/LFU Plazmid Maxi Kiti</td><td>Astral Scientific</td><td>G221020</td><td>Plazmid Maxi Hazırlık Kiti; DNA'yı suda elüte edin veya yeniden süspanse edin (pH 7.0-8.5).</td></tr><tr><td>FreeStyle 293-F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td>HEK-293 hücre hattı, serumsuz ortamda süspansiyon kültürüne uyarlanmıştır.</td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293-F hücre hattını ve yüksek protein ekspresyonunu korumak için özel olarak formüle edilmiş serumsuz ortam.</td></tr><tr><td>Kolliphor P188</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4894</td><td>İyonik olmayan yüzey aktif madde; pluronik F-68; Suda% 10'a kadar hazırlayın ve 0.22 & mu kullanarak filtreyle sterilize edin; m filtresi. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile İnaktive Edilmiş Fetal Sığır Serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin, Lineer, MW 25.000&nbsp;</td><td>Polibilimler A.Ş.</td><td>23966</td><td>Suda 1 mg / ml'ye hazırlayın. 1 M HCl ile pH 7.0'a ayarlayın (çözelti berraklaşır) ve 0.22 & mu kullanarak filtreyle sterilize edin; m filtresi. -80 &°C'de saklayın; Kullanana kadar C.</td></tr><tr><td>OptiPro SFM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12309-050</td><td>Transfeksiyon formüle edilmiş serumsuz ortam</td></tr><tr><td>Higromisin B Çözeltisi</td><td>Jomar Life Research</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsülfoksit (DMSO)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AJA2225</td><td></td></tr><tr><td>Tripton (kazein pepton)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>PBS'de% 20'ye hazırlayın ve 0.22 & kullanarak filtreyle sterilize edin; m filtresi. 4 & ° C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) Tabletleri, pH 7.4, 100 ml</td><td>Astral Scientific</td><td>09-2051-100</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Protein A Yüksek Performanslı, 1 x 5 ml kolonlu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0403-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTApurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>28406266 P-960 numune pompası ve Frac-920 fraksiyon toplayıcı içerebilen otomatik FPLC sistemi.</td></tr><tr><td>Glisin-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik Asit, monohidrat</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOC2123</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Sitrat, trisodyum tuzu dihidrat&nbsp;</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOCB0035</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl çözeltisi pH 9.0</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOSD8146</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Santrifüj Filtreler (30 MWCO)</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803008/UFC903008</td><td>Saflaştırılmış proteini tamponlamak, değiştirmek ve konsantre etmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Pierce Bikinkoninik Asit (BCA) Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>BLItz Sistemi</td><td>fort &eacute; BIO</td><td>45-5000</td><td>Biyo-katman interferometrisi (BLI) ölçümleri için kullanılan cihaz.</td></tr><tr><td>Protein A biyosensörleri</td><td>fort&eacute; BIO</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid/Bisakrilamid (37.5:1), %40 çözelti</td><td>Astral Scientific</td><td>786-502</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Persülfat (APS)</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0486</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Astral Bilimsel</td><td>AM0761</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Parlak Mavi R-250</td><td>Astral Scientific</td><td>786-498</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Çift Renkli Protein Standart</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr></tbody></table>

laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Terapötik bir antikorun başarılı bir şekilde üretilmesinin sağlanması, geliştirme sürecinin erken dönemlerinde başlar. İlk aşama, antikor genlerinin vektör ekspresyonu ve ardından uygun bir hücre hattına stabil transfeksiyondur. Kararlı klonlar, istenen üretim ve büyüme özelliklerine sahip klonların seçilmesi için taramaya tabi tutulur. Bu, süreçte zaman alıcı olsa da kritik bir adımdır. Bu protokol, terapötik bir antikorun ekspresyonu için vektör seçimini ve antikor dizilerinin kaynağını dikkate alır. Yöntemler, polietilenimin (PEI) kullanılarak insan embriyonik böbrek 293 (HEK-293) hücre hattının bir süspansiyon varyantının stabil transfeksiyonu için vektör DNA'nın hazırlanmasını tanımlar. Hücreler, transfeksiyon verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için serum içeren ortamda yapışık hücreler olarak transfekte edilir ve daha sonra serumsuz koşullara adapte edilir. Toplu aşırı büyüme kültürleri olarak kurulan büyük ölçekli üretim, otomatik bir hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) cihazı kullanılarak afinite kromatografisi ile saflaştırılan antikor proteini elde etmek için kullanılır. Bu yöntemle üretilen antikor verimleri, antikorun ilk karakterizasyonuna başlamak için yeterli proteini sağlayabilir. Bu, kurşun adaylar için zaman alıcı klonal tarama görevine yardımcı olmak için in vitro test geliştirmeyi veya fizikokimyasal karakterizasyonu içerebilir. Bu yöntem, biyobenzer antikorların üretimi için bir ekspresyon sisteminin geliştirilmesine aktarılabilir.

Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi transfekte edilmiş HEK-293 hücreleri ile trastuzumab kararlı üretim biyo-tabakalı interferometrik (BLI) kullanılarak teyit edilmiştir. Bir IgG standart eğrisi IgG antikoru standart ve Protein A biyosensör (Şekil 1A) arasındaki bağlanma oranı ölçülerek elde edilmiştir. Ham yüzer kısım Örnek Benzer ölçülmüş, daha sonra da konsantrasyonu, standart bir eğrisi (Şekil 1B) arasında interpolasyon. Süpernatan kon...

Bu protokol, bir memeli ekspresyon sistemi içinde terapötik bir antikor üretimini tarif eder. Tarif edilen yöntemler, afinite kromatografisi kullanılarak, büyük ölçekli kültür ve saflaştırma ayarlamak vektör DNA, kararlı transfeksiyonu ve bir insan embriyonik böbrek 293 hücre hattı serumsuz adaptasyon hazırlanmasını içerir.

Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Bu yöntemin genel amacı, terapötik bir antikorun laboratuvar ölçekli üretimi için yüksek verimli, serumsuz bir ekspresyon sistemi geliştirmektir. Bu yöntem; stabil bir hücre hattının oluşturulması, takviyelerin eklenmesi ve saflaştırma stratejilerinin optimize edilmesi gibi bir antikor ekspresyon sistemi tasarımındaki temel hususları ele alabilir. Bu tekniğin temel avantajı, serumlu medyuma adapte edilmiş stabil bir hücre hattı üretmenin, terapötik antikorun sağlam ve tekrarlanabilir miktarlarda elde edilmesini sağlamasıdır.Başlamak için, HEK-293 hücrelerini standart protokollere uygun olarak, %0.1 iyonik olmayan sürfaktan ile desteklenmiş serumsuz besiyerinde, Erlenmeyer balonlarında kültüre edin. Hücreleri 37 °C ve %5 CO2 altında, dakikada 120 rotasyon hızında inkübe edin. Kültürü 2 × 10⁵ hücre/mL yoğunluğunda tutun ve her dördüncü günde bir pasajlayın.Transfeksiyondan bir gün önce, HEK-293 hücrelerini 12 kuyucuklu plakanın kuyucuklarına, %10 ısıdan arındırılmış FBS içeren 2 mL DMEM içerisinde mililitrede 3x10⁵ hücre yoğunluğunda ekleyin. Transfeksiyon gününde, hücrelerin %80 ila %90 konfluens düzeyine ulaştığını kontrol edin. Kuyucuk başına 1,25 µg vektör DNA'sını 300 µL transfe

laboratory-scale-production-and-purification-of-a-therapeutic-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Protein terapötikler üretmek için hücre hattı geliştirme, üretim, yüksek verimlilik, otomatik bir platform açıklanmıştır. Uygulama, BD FACS Aria Hücre Sıralayıcısı CloneSelect Imager ve Tecan Özgürlük EVO sıvı taşıma sistemi, gelişmiş hücre hattı kalite ve yüksek tekrarlanabilirlik hücre hattı geliştirme işleme kapasitesi önemli ölçüde artış göstermiştir.

Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

Bu video, bir fare tümörü ksenogreft modelinde tümöre özgü antikorların in vivo lokalizasyonunu incelemek için bir tekniği göstermektedir. Tümör oluşumu için kanser hücrelerinin farelere deri altına enjekte edilmesinin ardından, tümöre özgü reseptörlere bağlanan floresan etiketli antikorlar enjekte edilir ve görüntüleme yoluyla antikor lokalizasyonunun in vivo olarak değerlendirilmesini sağlar.

Tümöre Özgü Antikorların İn Vivo Lokalizasyonunu Değerlendirmek İçin Bir Teknik

Video, memeli konak hücrelerinde gen ekspresyonundan sekresyona kadar antikor üretme sürecini açıklıyor. Transkripsiyon, translasyon, sinyal tanıma, doğru katlamayı ve nihayetinde salgı vezikülleri yoluyla hücre dışı ortama salınmasını içerir.

Memeli Hücrelerinden Rekombinant Antikorların Üretimi ve Saflaştırılması

Bu video, Çin Hamster Yumurtalık hücrelerinden hasat edilen hücre kültürü sıvısından monoklonal antikorların saflaştırılması için bir testi göstermektedir. Numunedeki antikorların Fc bölgesine bağlanan ve onları kirleticilerden etkili bir şekilde ayıran hareketsizleştirilmiş protein A içeren gözenekli bir cam reçine kullanır. Düşük pH'lı bir elüsyon tamponunun kullanılması, saflaştırılmış antikorların alınmasını kolaylaştırarak etkileşimi zayıflatır.

Çin Hamster Yumurtalık Hücreleri Tarafından Üretilen Monoklonal Antikorları Saflaştırmak İçin Bir Teknik

Video, stabil şekilde transfekte edilmiş memeli hücreleri kullanarak terapötik antikorlar üretmek için bir yöntemi göstermektedir. Tripton takviyesi, hücre bölünmesini uyararak aşırı büyümeye neden olur ve daha yüksek bir antikor verimini destekler. Antikor içeren ortam hasat edilir, filtrelenir ve daha sonraki kullanım için saklanır.

Transfekte Edilmiş Memeli Hücrelerinin Toplu Aşırı Büyüme Kültüründen Antikor Üretimi

Bu video, antikor üreten bir hücre kültüründen elde edilen kültür süpernatantından monoklonal antikorların saflaştırılması için bir tekniği göstermektedir. İşlem, boncuklar üzerindeki süpernatanttaki antikorları hareketsiz hale getiren ve kirleticilerden etkili bir şekilde ayrılmaya izin veren konjuge Protein A ile çapraz bağlı agaroz boncuklarından oluşan bir matrisin kullanılmasını içerir. Düşük pH'lı bir elüsyon tamponu uygulanarak, protein A-antikor etkileşimi gevşetilir ve antikor içeren...

Monoklonal Antikorların Saflaştırılması için Bir Afinite Kromatografisi Tekniği

Bu video, bir antikor mikrodizi çipi kullanarak çevresel bir numunedeki Siyanobakteri suşlarını tespit etmek için bir yöntemi gösterir. Çeşitli bakterileri taşıyan numuneler, basılı antikorlarla etkileşime girer ve florofor etiketli anti-siyanobakteriyel-suş antikorları ile immün boyama, farklı noktalarda floresan yoluyla spesifik siyanobakteriyel suşların varlığını ortaya çıkarır.

Bir Antikor Mikroarray Çipi Kullanarak Siyanobakteriyel Suşları Tespit Etmek İçin Bir Teknik

İnsan tüketimine yönelik tatlı su rezervuarlarında siyanobakteriyel toksinlerin varlığı, su yönetimi yetkilileri için büyük bir endişe kaynağıdır. Su kontaminasyonu riskini değerlendirmek için bu makale, bir antikor mikrodizi çipi kullanılarak sıvı ve katı numunelerdeki siyanobakteri suşlarının sahada tespiti için bir protokol açıklamaktadır.

Saptamak için deneysel protokol Siyanobakteri Bir Antikor Mikroarray Chip ile Sıvı ve Katı Örneklerinde

Otomatik microbioreactors hasat hücre kültürü sıvı (HCCF) bir monoklonal antikor arıtma ve sonraki analizi için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Kritik kalite niteliklerini (CQAs) belirlemek ve önemli bilgileri ayıklamak için sınırlı numune hacmini maksimize etmek için analitiklerin kullanılması da sunulmaktadır.

Otomatik bir Mikrobioreactor sistemi kullanılarak Çin hamster yumurtlama hücrelerinden bir monoklonal antikor arıtma ve analitik

Burada fare tümörü ksenogreft modellerinde antikorların in vivo lokalizasyonunu incelemek için bir protokol sayılmaktadır.

Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi

Öğrenin, HEK-293 hücreleri kullanarak serum içermeyen ortamda terapötik antikor üretimi ve saflaştırma yöntemini. Bu protokol, yüksek verimli ve tekrarlanabilir antikor üretimi için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Daha fazla video keşfet